RNA干扰技术及其在细胞周期研究中的应用
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细胞周期依赖性激酶 CDK在特定时间与其调节 亚基细胞周期蛋白 cyclin形成 CDK / cyclin复合物 ,磷
酸化相应底物蛋白 ,推动细胞通过细胞周期的特定时 相 ,即细胞检验点 ( cell cycle checkpoint) 。另外还有通 过非磷酸化途径抑制 CDK / cyclin活性的 CDK抑制物 (CKI) 。以 CDK、cyclin和 CKI三者为中心形成检验点 复杂而精细的调控网络 。
相对于 M ytl和 W eel而言 , cdc25则行使正性调节 功能 。由 cdc25磷酸酶家族将上述表位去磷酸化对于 cdc2 / cyclinB 复合体的激活是必需的 。 cdc25蛋白由一 个多基因家族编码 , 包括 cdc25A、cdc25B 和 cdc25C。 过去 一 直 认 为 cdc25A 在 G1 / S 期 过 渡 中 通 过 激 活 CDK2激 酶而 起至 关重 要 的 作 用 , 而 现 在 M ailandN. (2002)则发现 , cdc25A 在有丝分裂 G2 /M 期中还有不 为人知的作用 ,即除了在 G1 / S期中有一个发挥作用的 不稳定形式以外 , cdc25A还在 G2 /M 期存在一个明显的 稳定形式。该 cdc25A 的稳定形式结合并激活 cdc2 / cy2 clinB ,当其过度表达时会加速细胞分裂 ,而通过 RNA i对 cdc25A的负调节则使细胞延迟进入有丝分裂 。 2 RNA i在 G2期 DNA 不恰当复制研究中的应用
scridp tional gene silencing, PTGS) 。 dsRNA 经 D icer酶降解成 21 - 23nt的 siRNA ,并以其为模板 ,特定位点 、特定间隔降解与
之序列相应的 mRNA。随着 RNA i机制的深入研究与广泛应用 ,目前该技术已经普遍应用于细胞周期研究中 ,在阐明各种
在所有真核生物中 ,细胞周期 G2期中发生的不恰 当复制起始都由细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK所抑 制 ,而多细胞真核生物中还有另外一种 DNA 不恰当复 制的抑制剂 —孪蛋白 gem inin。孪蛋白出现于 S和 G2 期 ,其与 Cdtl/RLF - B 结合 ,后者是微小染色体维持 (m inichromosome maintenance, MCM ) 复合体所必需的 复制起始因子 ,孪蛋白 C - 末端卷曲螺旋域与 Cdtl的 结合阻止了 MCM 复合体结合人前复制复合体 ( p re RC)中而抑制 DNA 复制 。孪蛋白接着在有丝分裂的中 期 /后期过渡时被破坏 ,细胞得以进入下一周期的 DNA 复制 。孪蛋白在过度表达时有多向性作用 ,除了诱导 未定型的胚细胞分化成为神经元的作用外 ,目前主要 认为它在 S或 G2 期阻止 DNA 的再次复制起始 。而 M ihaylov通过 RNA i在 SD2 细胞中使孪蛋白沉默而导 致有丝分裂的中断和基因组的非同步过度复制 ,同时 细胞则含有了单个巨大核并在 4N 和 8N 的 DNA 含量 之间包含了部分染色体倍数 。孪蛋白缺失的影响可以 完全被 Dup (Cdtl的果蝇同系物 )的共沉默所抑制 。他 们的研究证明了孪蛋白对抑制过度复制和维持基因稳 定性是必需的 [ 10 ] 。 3 RNA i在核质转运研究中的应用
在胞核和胞质之间蛋白的调节分布对于细胞周期 的维持 、细胞和组织分化 、以及整个有机体的发育都是 至关重要的 。输入蛋白 α家族共有三个成员 : IMA - 1、 IMA - 2和 IMA - 3。这些蛋白共同拥有两个相同的结 构特征 :识别核定位信号 NLS的中心 a rm 重复序列包
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含域 ,以及 N - 末端输入蛋白 β结合 ( IBB )域 。它们能 介导包含 NLS蛋白和输入蛋白 β之间的相互作用 ,从 而介 导 包 含 经 典 核 定 位 信 号 cNLS 蛋 白 的 核 输 入 。 Kenneth利用 RNA i耗竭了 IMA - 2而造成了胚致死性 和一个终末非整倍体表型 。 im a - 2 ( RNA i)胚在核膜 形成以及胞质中核孔蛋白和核纤层蛋白的积累方面有 严重缺陷 。因此证实了 IMA - 2对种系和胚早期有丝 分裂中正确的染色体动力学是必需的 ,并且它还涉及 有丝分裂结束时核膜的装配 。同时 Kenneth通过 RNA i 试验还证实了 IMA - 3在卵母细胞发育期间对于减数 分裂前期 I的进程是必需的 。 IMA - 3的表达缺失也会 导致核孔复合体的破坏并伴随 P颗粒的错误定位 。发 生在 im a - 3 (RNA i) F1代中的大范围缺陷更加支持了 IMA - 3在胚及幼虫发育期间的作用 [ 11 ] 。 MI A - 3与不 同细胞事件之间的功能联系 、其表达方式和细胞定位都 证明了核转运机制的调节作用与发育途径的控制有关 。 4 RNA i在有丝分裂研究中的应用 411 在着丝粒内蛋白研究中的应用
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第 23卷第 2期 2006年 4月
生物学杂志
JOURNAL OF B IOLOGY
Vol. 23 No. 2
Ap r, 2006
致 cdc2在 Thrl4残基上的磷酸化作用明显减少 。然而 只有当 dM ytl和 dW eel的表达都经 RNA i减少而非单独 在 dW eel表达减少时才出现 cdc2在 Tyrl5残基上的减 少 [ 9 ] 。这充分证实了两种抑制性激酶在 cdc2 上的作 用位点 。
调控机制的同时也为基因治疗提供了新靶点 。
关键词 : RNA 干扰 ;细胞周期 ;基因沉默
中图分类号 : Q522
文献标识码 : B
文章编号 : 1008 - 9632 (2006) 02 - 0045 - 03
在 多 种 生 物 细 胞 中 , 外 源 或 内 源 性 双 链 RNA ( double - stranded RNA , dsRNA ) 可 触 发 细 胞 内 同 源 mRNA 的特异性降解 ,从而使该基因表达沉默 ,这种现 象称为 RNA 干扰 ( RNA interference, RNA i) 。 1998 年 , Fire等在研究反义 RNA 在线虫中的基因阻断作用时首 先发 现 了 RNA i 现 象 [ 1 ] , 随 后 证 实 在 果 蝇 ( D rosoph i2 la) [2 ] 、涡虫 ( P lana rian) [3 ] 、水螅 ( hyd ra ) [4 ] 、锥虫 ( tryp2 anosom es) [5 ] 、小鼠胚胎细胞 [ 6 ]及哺乳动物成体细胞 [ 7 ] 中均存在 dsRNA 介导的 RNA i现象 。在动物中发现的 RNA 干扰与植物中的共抑制 ( cosupp ression) 、粗糙脉胞 菌 (mold Neurospora crassa)中的压制 ( quelling)有着相 似的基因机制 , 都属于转录后基因沉默 ( post - tran2 scrip tional gene silencing, PTGS) 。由于 RNA i在动植物 抵抗外源病毒 、生长发育调控方面起着重要作用 ,而且 在功能基因组研究 、基因治疗方面有着广泛的应用前 景 ,所以近几年在国际上掀起了一股研究 RNA i的热 潮 。2001年和 2002 年 , RNA i技 术 连 续 两 次 被《 Sci2 ence》杂志评为当年十大科学成就之一 , 足可见其重 要 。现在 RNA i已用于在人体研究 ,并广泛地在抗病 毒 、肿瘤 、免疫 、药理 、遗传等方面得到应用 。基因有限 公司和 宝 生 物 公 司 等 已 开 发 出 RNA i 试 剂 盒 , 目 前 RNA i数据库与表型 blast也已建立 。 1 RNA i在细胞周期检验点研究中的应用 111 在 G1 / S期检验点研究中的应用
在 C. elegans线虫中 , A IR - 2 ( auroraB )的功能需要 ICP - 1 ( INCENP) 和 B IR - 1 ( Survivin) 参与 。 R ichard 用 RNA i把 INCENP 相关基因产物之一 —类 INCENP 蛋白 ( ICP - 1)失活而使得 auroraB /A IR - 2不能正确定 位于染色体及纺锤体中间区 ,另外经 RNA i把 B IR - 1 失活也得到同一结果 。由 RNA i造成 B IR - 1 / Survivin 功能消除的结果是 auroraB /A IR - 2 激酶的错误定位 , 及减数分裂期间组蛋白 H3 磷酸化缺陷及染色体凝聚 异常 。这些结果清楚地显示了 auroraB 激酶对组蛋白 H3的磷酸化很重要 。通过用 RNA i消除 INCENP、au2 roraB 和 B IR - 1 的功能得出了以下类似结果 : 被敲除 INCENP的胚不能完成胞质分裂 ,另外还伴有染色体分 离困难和微管异常 。在这种情况下胚启动卵裂 ,但分 裂沟出现倒退 , 导致了多核细胞的产生 。对 ICP - 1 (RNA i)的缩时分析也显示了该结果 ,尽管染色体在第 一次细胞分裂中期时正常地排成一线 ,但在第一次细 胞分裂后期仍然出现了错误 ,姐妹染色单体似乎并未 分离而是沿着后期纺锤体伸展开来 。 INCENP ( RNA i) 表型得出这样一种结果 :姐妹染色单体分离失败的严 重性更甚于胞质分裂的失败 [ 12 ] 。同年 R ichard在培养
收稿日期 : 2005 - 07 - 05
作者简介 :霍黉琦 (1980 - ) ,女 ,硕土研究生 ; 通讯作者 :李新平 (1967 - ) ,男 ,博士后 ,副教授 ,主要从事分子生物学研究 , E - mail: lxp67cqu@163. com。 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30471250)
第 23卷第 2期 2006年 4月
生物学杂志
JOURNAL OF B IOLOGY
Vol. 23 No. 2
Ap r, 2006பைடு நூலகம்
RNA 干扰技术及其在细胞周期研究中的应用
霍黉琦 ,李新平 ,曹志飞 , 李 静 ,汪成富
(苏州大学生命科学学院 ,苏州 215006)
酸化相应底物蛋白 ,推动细胞通过细胞周期的特定时 相 ,即细胞检验点 ( cell cycle checkpoint) 。另外还有通 过非磷酸化途径抑制 CDK / cyclin活性的 CDK抑制物 (CKI) 。以 CDK、cyclin和 CKI三者为中心形成检验点 复杂而精细的调控网络 。
相对于 M ytl和 W eel而言 , cdc25则行使正性调节 功能 。由 cdc25磷酸酶家族将上述表位去磷酸化对于 cdc2 / cyclinB 复合体的激活是必需的 。 cdc25蛋白由一 个多基因家族编码 , 包括 cdc25A、cdc25B 和 cdc25C。 过去 一 直 认 为 cdc25A 在 G1 / S 期 过 渡 中 通 过 激 活 CDK2激 酶而 起至 关重 要 的 作 用 , 而 现 在 M ailandN. (2002)则发现 , cdc25A 在有丝分裂 G2 /M 期中还有不 为人知的作用 ,即除了在 G1 / S期中有一个发挥作用的 不稳定形式以外 , cdc25A还在 G2 /M 期存在一个明显的 稳定形式。该 cdc25A 的稳定形式结合并激活 cdc2 / cy2 clinB ,当其过度表达时会加速细胞分裂 ,而通过 RNA i对 cdc25A的负调节则使细胞延迟进入有丝分裂 。 2 RNA i在 G2期 DNA 不恰当复制研究中的应用
scridp tional gene silencing, PTGS) 。 dsRNA 经 D icer酶降解成 21 - 23nt的 siRNA ,并以其为模板 ,特定位点 、特定间隔降解与
之序列相应的 mRNA。随着 RNA i机制的深入研究与广泛应用 ,目前该技术已经普遍应用于细胞周期研究中 ,在阐明各种
在所有真核生物中 ,细胞周期 G2期中发生的不恰 当复制起始都由细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK所抑 制 ,而多细胞真核生物中还有另外一种 DNA 不恰当复 制的抑制剂 —孪蛋白 gem inin。孪蛋白出现于 S和 G2 期 ,其与 Cdtl/RLF - B 结合 ,后者是微小染色体维持 (m inichromosome maintenance, MCM ) 复合体所必需的 复制起始因子 ,孪蛋白 C - 末端卷曲螺旋域与 Cdtl的 结合阻止了 MCM 复合体结合人前复制复合体 ( p re RC)中而抑制 DNA 复制 。孪蛋白接着在有丝分裂的中 期 /后期过渡时被破坏 ,细胞得以进入下一周期的 DNA 复制 。孪蛋白在过度表达时有多向性作用 ,除了诱导 未定型的胚细胞分化成为神经元的作用外 ,目前主要 认为它在 S或 G2 期阻止 DNA 的再次复制起始 。而 M ihaylov通过 RNA i在 SD2 细胞中使孪蛋白沉默而导 致有丝分裂的中断和基因组的非同步过度复制 ,同时 细胞则含有了单个巨大核并在 4N 和 8N 的 DNA 含量 之间包含了部分染色体倍数 。孪蛋白缺失的影响可以 完全被 Dup (Cdtl的果蝇同系物 )的共沉默所抑制 。他 们的研究证明了孪蛋白对抑制过度复制和维持基因稳 定性是必需的 [ 10 ] 。 3 RNA i在核质转运研究中的应用
在胞核和胞质之间蛋白的调节分布对于细胞周期 的维持 、细胞和组织分化 、以及整个有机体的发育都是 至关重要的 。输入蛋白 α家族共有三个成员 : IMA - 1、 IMA - 2和 IMA - 3。这些蛋白共同拥有两个相同的结 构特征 :识别核定位信号 NLS的中心 a rm 重复序列包
46
含域 ,以及 N - 末端输入蛋白 β结合 ( IBB )域 。它们能 介导包含 NLS蛋白和输入蛋白 β之间的相互作用 ,从 而介 导 包 含 经 典 核 定 位 信 号 cNLS 蛋 白 的 核 输 入 。 Kenneth利用 RNA i耗竭了 IMA - 2而造成了胚致死性 和一个终末非整倍体表型 。 im a - 2 ( RNA i)胚在核膜 形成以及胞质中核孔蛋白和核纤层蛋白的积累方面有 严重缺陷 。因此证实了 IMA - 2对种系和胚早期有丝 分裂中正确的染色体动力学是必需的 ,并且它还涉及 有丝分裂结束时核膜的装配 。同时 Kenneth通过 RNA i 试验还证实了 IMA - 3在卵母细胞发育期间对于减数 分裂前期 I的进程是必需的 。 IMA - 3的表达缺失也会 导致核孔复合体的破坏并伴随 P颗粒的错误定位 。发 生在 im a - 3 (RNA i) F1代中的大范围缺陷更加支持了 IMA - 3在胚及幼虫发育期间的作用 [ 11 ] 。 MI A - 3与不 同细胞事件之间的功能联系 、其表达方式和细胞定位都 证明了核转运机制的调节作用与发育途径的控制有关 。 4 RNA i在有丝分裂研究中的应用 411 在着丝粒内蛋白研究中的应用
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第 23卷第 2期 2006年 4月
生物学杂志
JOURNAL OF B IOLOGY
Vol. 23 No. 2
Ap r, 2006
致 cdc2在 Thrl4残基上的磷酸化作用明显减少 。然而 只有当 dM ytl和 dW eel的表达都经 RNA i减少而非单独 在 dW eel表达减少时才出现 cdc2在 Tyrl5残基上的减 少 [ 9 ] 。这充分证实了两种抑制性激酶在 cdc2 上的作 用位点 。
调控机制的同时也为基因治疗提供了新靶点 。
关键词 : RNA 干扰 ;细胞周期 ;基因沉默
中图分类号 : Q522
文献标识码 : B
文章编号 : 1008 - 9632 (2006) 02 - 0045 - 03
在 多 种 生 物 细 胞 中 , 外 源 或 内 源 性 双 链 RNA ( double - stranded RNA , dsRNA ) 可 触 发 细 胞 内 同 源 mRNA 的特异性降解 ,从而使该基因表达沉默 ,这种现 象称为 RNA 干扰 ( RNA interference, RNA i) 。 1998 年 , Fire等在研究反义 RNA 在线虫中的基因阻断作用时首 先发 现 了 RNA i 现 象 [ 1 ] , 随 后 证 实 在 果 蝇 ( D rosoph i2 la) [2 ] 、涡虫 ( P lana rian) [3 ] 、水螅 ( hyd ra ) [4 ] 、锥虫 ( tryp2 anosom es) [5 ] 、小鼠胚胎细胞 [ 6 ]及哺乳动物成体细胞 [ 7 ] 中均存在 dsRNA 介导的 RNA i现象 。在动物中发现的 RNA 干扰与植物中的共抑制 ( cosupp ression) 、粗糙脉胞 菌 (mold Neurospora crassa)中的压制 ( quelling)有着相 似的基因机制 , 都属于转录后基因沉默 ( post - tran2 scrip tional gene silencing, PTGS) 。由于 RNA i在动植物 抵抗外源病毒 、生长发育调控方面起着重要作用 ,而且 在功能基因组研究 、基因治疗方面有着广泛的应用前 景 ,所以近几年在国际上掀起了一股研究 RNA i的热 潮 。2001年和 2002 年 , RNA i技 术 连 续 两 次 被《 Sci2 ence》杂志评为当年十大科学成就之一 , 足可见其重 要 。现在 RNA i已用于在人体研究 ,并广泛地在抗病 毒 、肿瘤 、免疫 、药理 、遗传等方面得到应用 。基因有限 公司和 宝 生 物 公 司 等 已 开 发 出 RNA i 试 剂 盒 , 目 前 RNA i数据库与表型 blast也已建立 。 1 RNA i在细胞周期检验点研究中的应用 111 在 G1 / S期检验点研究中的应用
在 C. elegans线虫中 , A IR - 2 ( auroraB )的功能需要 ICP - 1 ( INCENP) 和 B IR - 1 ( Survivin) 参与 。 R ichard 用 RNA i把 INCENP 相关基因产物之一 —类 INCENP 蛋白 ( ICP - 1)失活而使得 auroraB /A IR - 2不能正确定 位于染色体及纺锤体中间区 ,另外经 RNA i把 B IR - 1 失活也得到同一结果 。由 RNA i造成 B IR - 1 / Survivin 功能消除的结果是 auroraB /A IR - 2 激酶的错误定位 , 及减数分裂期间组蛋白 H3 磷酸化缺陷及染色体凝聚 异常 。这些结果清楚地显示了 auroraB 激酶对组蛋白 H3的磷酸化很重要 。通过用 RNA i消除 INCENP、au2 roraB 和 B IR - 1 的功能得出了以下类似结果 : 被敲除 INCENP的胚不能完成胞质分裂 ,另外还伴有染色体分 离困难和微管异常 。在这种情况下胚启动卵裂 ,但分 裂沟出现倒退 , 导致了多核细胞的产生 。对 ICP - 1 (RNA i)的缩时分析也显示了该结果 ,尽管染色体在第 一次细胞分裂中期时正常地排成一线 ,但在第一次细 胞分裂后期仍然出现了错误 ,姐妹染色单体似乎并未 分离而是沿着后期纺锤体伸展开来 。 INCENP ( RNA i) 表型得出这样一种结果 :姐妹染色单体分离失败的严 重性更甚于胞质分裂的失败 [ 12 ] 。同年 R ichard在培养
收稿日期 : 2005 - 07 - 05
作者简介 :霍黉琦 (1980 - ) ,女 ,硕土研究生 ; 通讯作者 :李新平 (1967 - ) ,男 ,博士后 ,副教授 ,主要从事分子生物学研究 , E - mail: lxp67cqu@163. com。 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30471250)
第 23卷第 2期 2006年 4月
生物学杂志
JOURNAL OF B IOLOGY
Vol. 23 No. 2
Ap r, 2006பைடு நூலகம்
RNA 干扰技术及其在细胞周期研究中的应用
霍黉琦 ,李新平 ,曹志飞 , 李 静 ,汪成富
(苏州大学生命科学学院 ,苏州 215006)
