实训1 双水相萃取相图的制作
一、实训目的
1. 学习双水相分离萃取的原理和方法
2. 学习双水相萃取相图的制作 二、实训原理
双水相萃取法是利用物质在互不相容的两个水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
两水相的形成：高聚物与无机盐在水中由于盐析的作用会形成两个相，如PEG 与硫酸盐或碱性磷酸盐。
两种亲水性高聚物在水中由于聚合物的不相容性也会形成两个相。
但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相，双水相形成的定量关系可用相图来表示。
相图是一根双节线, 把均匀区和两相区分隔开来。
当成相组分的配比取在：线的下方时，为均相区； 曲线的上方时，为两相区；在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。
相图中TMB 称为系线；T 代表上相组成；B 代表下相组成；同一条系线上各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。
V T / V B = BM / MT
三、实训器材、试剂、材料
1.器材：试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管。
2.试剂：聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵。
四、实训操作步骤
1.PEG2000（NH 4)2SO 4双水相体系相图的测定
（1）取10%（g/ mL ）PEG2000溶液10mL 于三角瓶中。
（2）用40%（g/mL ）（NH 4)2SO 4溶液装入滴定管中滴定至三角并中溶液出现浑浊，记录）NH4)2SO 4溶液消耗的体积。
加入1mL 水使溶液澄清，继续用（NH 4)2SO 4溶液滴定至浑浊，重复7～8次，记录每次（NH 4)2SO 4溶液消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG2000和（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）。
（3） 以（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）为横坐标，PEG2000的浓度（g/mL ）为纵坐标，绘制PEG2000- （NH 4)2SO 4双水相体系相图。
2. 相图制作表
10%PEG2000 10mL 温度T=20℃
PEG2000 %
(NH 4)2SO 4 %
两相 均相
五、结果与讨论
1.如何正确绘制相图。
2.如何根据相图配制双水相体系。
实训2 两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一、实训目的
1.学习双水相分离萃取蛋白质的原理和方法。
2.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作。
3.学习掌握双水相萃取分配系数的测定。
二、实训原理
1. 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。
2. 分配系数：当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比称为分配系数，
分配系数K = C上/ C下;
3.相比：上下相体积比称为相比R = V上/ V下
4.以牛奶中的酪蛋白为实验对象，在PEG/(NH4)2SO4两水相系统进行分配。
5.用考马斯亮兰(CBB G-250)比色法分别测定上下相中总蛋白的含量。
CBB G-250是一种染
料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大吸收值。
低浓度（0.01～1.0mg/mL）时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
三、试剂、材料
1. 考马斯亮兰G-250溶液配制
精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。
2. 标准蛋白溶液-牛血清蛋白溶液配制
精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成120 g/ml的牛血清蛋白原液。
四、操作步聚
PEG4000 10g 加入20ml 水，配制50%的PEG4000溶液，加入10ml 牛奶，再加入4.5g 硫酸铵，搅拌，溶解，3000rpm 离心20min ，分别记录上下相体积、取样，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
3. 两相中总蛋白的测定：
上相液：吸取0.5ml ，蒸馏水定容至50ml ，按下表操作。
下相液：上相完全吸掉，并吸掉部分下相，再取样。
五、结果计算 1.标准曲线 OD = K · X （μg ）＋ b 求斜率K 和截距b
2. 分配系数 K = C 上 / C 下
ml g K
b OD C /100μ⨯-=上
上相ml g K b OD C /1.01μ⨯-=下下相
双水相萃取案例 案例1 双水相萃取血红蛋白
血红蛋白（hemoglobin,HB ）是由四条多肽链组成——二条α链和二条β链，每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe 2+不被氧化。
分子质量为64458D ，等电点约为6.9。
双水相萃取血红蛋白的基本流程：
人或动物血液中预先加入3g/L 柠檬酸钠，防止血液凝固。
离心后，用生理盐水洗涤三次。
血红蛋白的分配系数随pH 的升高而升高，随PEG 分子量的增加而下降。
在PEG1500 12.5%，pH10，血红蛋白的分配系数最高，为2.96。
前萃取条件：系线长度22%，PEG1500 18.9%，磷酸钾盐9%，相平衡时间5～10min ，离心分相5000g ，5～10min ，得上相体积521mL ，下相体积330 mL 。
细胞碎片和各种细胞质在下相富集，并形成界面沉淀。
上相澄清透明，下相浑浊且不透明。
下相弃去后，单独存放，有胶凝化现象。
血红蛋白部分形成界面沉淀，造成损失。
前萃取收率64.9%。
反萃取条件：系线长度22%，，PEG1500 15.5%，磷酸钾盐与钠盐11%，相平衡时间5～10min ，离心分相5000g ，5～10min ，得上相体积370mL ，下相体积195 mL 。
上相与下相澄清透明。
上相弃去，血红蛋白在下相富集。
反萃取收率96.9%。
人或动物血液
（血浆） （红血球） 弃去 生理盐水洗涤 ） 下相（弃去） 下相 透析 纯品
案例2 双水相萃取基因重组人胰岛素生长因子-I（IGF-I）
基因重组人胰岛素生长因子-I（IGF-I）是一种生长激素，由肝分泌并入血液循环的中性多肽。
IGF-I能促进细胞增殖，分化和细胞分泌作用。
IGF-I能对所有胰岛素靶器官起经典的胰岛素效应，能促进脂肪组织的糖代谢和糖转运，促进脂肪和糖元合成。
IGF-I能增进鸟氨酸脱羧酶的活性，促进DNA、RNA和蛋白质合成，最终导致细胞增殖。
IGF-I对动物的生长发育和繁殖都有促进的作用。
IGF-I的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性。
一条肽链，非糖基化蛋白，由70个氨基酸残基构成，分子质量为7.6KD，等电点为7.6。
工业上由大肠杆菌表达生产IGF-I。
发酵后的提取与复性过程基本如下：
（1）包含体溶解将1200L发酵液（含有IGF-I 3.8g/L）泵入反应罐中，加入220L含174kg 尿素的水溶液，接着加入8L50%氢氧化钠溶液，调pH=10.0。
再加入2.9kg二硫苏糖醇（DTT），3L50%氢氧化钠溶液，复调pH=10.0。
反应罐内充氮气，37℃反应60min，随后冷却到22℃，进入双水相萃取工段。
（2）双水相萃取仍充氮气保护，萃取温度22℃。
向上一步获得的液体中加入250kgPEG8000和90kg硫酸钠，搅拌40min。
取样离心分析表明，此时IGF-I分配系数为8.5，上下相的体积比为2.6。
两相混合后用Westfalia SB-7分离机分相，得1300L上相、550L下相，下相弃去。
不同条件下IGF-I的分配系数、相比和萃取上相收率见表。
反相高效液相色谱分析表明，IGF-I萃取上相收率为88%，上相继续充怕氮气保护。
（3）IGF-I沉淀向前步获得的1300L上相中加入36L 2mol/L磷酸，调pH=7.0。
22℃下轻微搅拌8h，反相高效色谱分析表明，此时有96% IGF-I沉淀。
沉淀用Westfalia SB-7分离机富集，得沉淀88kg。
（4）复性取部分沉淀17.6kg用65L以下溶液溶解：含2mol/L尿素，10mmol/L二硫苏糖醇，10%氢氧化钠溶液，调pH=10.0。
然后加入到700L复性缓冲液（含2mol/L尿素，1mol/L氯化钠溶液，19%（体积分数）乙醇，20mmol/L甘氨酸，0.5µmol/L铜离子，pH=10.5）中，复性在22℃下进行，轻微搅拌，通入氧气280mL/min。
3h后，复性结束，停止通氧，用磷酸调pH=3.5。
反相高效液相色谱表明，复性收率为50%。
