地高辛标记系统

Avidin与Streptavidin的区别
Avidin是一种醣蛋白，被发现存在于鸡蛋卵白中，所以中文称之为「卵白素」，鸟类、爬虫类及两栖类的组织中亦存在。

Avidin 总分子量为 67,000 Daltons，由四个完全相同的次体 (subunit)所组成，每个次体皆能与一分子的 biotin 结合。

Avidin 含醣比例颇高，约占了总分子量的 10％。

其 pI＝10-10.5，溶于水及含盐溶液中。

Avidin 在相当广的温度及 pH 范围下皆很稳定。

Streptavidin 也是个由四个相同次体 (subunit)所组成的蛋白质，每个次体皆能与一分子的 biotin 结合，且其与 biotin 之键结亲和力相当于Avidin-biotin 之亲和力。

不过Biotin-Streptavidin 复合物对
于 guanidine.HCl 将两者分开的抗拒能力较Biotin-Avidin 还要强。

此外，Streptavidin 不含醣且具有酸性的pI = 5，正好与Avidin相反。

地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。

样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

地高辛标记dna探针原理
地高辛标记DNA探针是一种通过标记染色体上的特定DNA序列用于鉴定、检测和定位目标DNA的技术。

其原理主要涉及两方面，一是DNA杂交，二是标记检测。

首先，标记DNA探针通过与目标DNA发生杂交反应，将DNA探针上的特定DNA序列与目标DNA上的互补序列结合，使探针与靶标DNA 形成双链DNA杂交物。

这种杂交反应通常在高温下进行，以便将DNA 双链分离，随后在低温下进行，以便使探针和目标DNA结合。

其次，标记检测通过将探针的DNA序列与荧光染料等标记物进行连接，以获得可见的信号。

在探针杂交反应后，如果探针成功与目标DNA结合，则标记物也会随之结合，反之则不会结合。

通常通过显微镜或荧光成像系统观察标记信号来确定目标DNA的存在。

因此，地高辛标记DNA探针的原理主要基于DNA杂交和标记检测技术，可以用于检测和定位目标DNA，为分子生物学等领域的研究提供了有力的支持。

地高辛标记原理及步骤地高辛（Digoxin）是一种植物来源的药物，常用于治疗心脏病和心律失常。

在临床实验室中，地高辛也可用于标记其他物质，以便进行研究和诊断。

本文将介绍地高辛标记的原理及步骤。

一、地高辛标记的原理地高辛标记是一种共价标记方法，通过将地高辛与待标记物质结合，使其能够被检测出来。

该方法基于地高辛的特殊结构和与其他物质之间的化学反应。

地高辛的结构包含一个呈环状的核苷苷酸结构，其中有一个活性位点。

这个活性位点可以与其他分子中的羟基或氨基等活性基团发生化学反应。

在地高辛标记中，我们利用这个活性位点将地高辛与待标记物质连接起来。

二、地高辛标记的步骤1. 准备地高辛标记试剂首先，我们需要准备地高辛标记的试剂，包括地高辛分子和反应条件。

根据不同的实验需要，地高辛可以选择单独标记或与其他分子共同标记。

2. 标记反应的进行将待标记物质与地高辛标记试剂加入反应体系中，控制好反应时间和温度。

反应条件的选择需要根据实验的具体要求来确定。

3. 纯化标记产物完成标记反应后，需要对反应产物进行纯化，以去除未反应的地高辛和其他杂质。

常见的纯化方法包括色谱层析、电泳等。

4. 检测标记效果对纯化后的标记产物进行检测，确定地高辛与待标记物质的结合情况。

常用的检测方法包括光谱分析、质谱分析、核磁共振等。

5. 应用标记产物纯化并验证了标记产物后，可以将其应用到相应的实验或诊断中。

根据实验的目的和需求，地高辛标记产物可以被用于免疫染色、荧光探针等多个领域。

总结：地高辛标记是一种常用的药物标记方法，其原理是通过地高辛与待标记物质的共价结合。

标记步骤包括准备试剂、标记反应、纯化产物、检测效果和应用标记产物。

掌握地高辛标记原理及步骤对于科研和临床实验室中的药物研究和诊断具有重要意义。

地高辛标记核酸探针的标记方法地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3,末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

地高辛标记核酸探针的标记方法地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3,末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

斑点杂交实验【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

【实验步骤】1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。

（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）2．变性：将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。

（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上）【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。

3．点样：将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。

4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。

用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。

除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min。

【原理】封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。

（已准备好）6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL，除去气泡，封口。

置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7．洗膜：（1）回收杂交液；（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min；（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。

8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。

斑点杂交实验【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

【实验步骤】1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。

（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）2．变性：将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。

（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上）【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。

3．点样：将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。

4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。

用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。

除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min。

【原理】封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。

（已准备好）6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL，除去气泡，封口。

置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7．洗膜：（1）回收杂交液；（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min；（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。

8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。