山东省社会信用中心2020年科研课题合作单位征集公(2020)

山东省人民政府关于2020年度山东省科学技术奖励的决定文章属性•【制定机关】山东省人民政府•【公布日期】2020.12.31•【字号】鲁政发〔2020〕18号•【施行日期】2020.12.31•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】科技奖励正文山东省人民政府关于2020年度山东省科学技术奖励的决定各市人民政府，各县(市、区)人民政府，省政府各部门、各直属机构，各大企业，各高等院校：为深入贯彻习近平新时代中国特色社会主义思想，全面落实党的十九大和十九届二中、三中、四中、五中全会精神，加快科技自立自强，深入实施科教兴鲁战略、人才强省战略、创新驱动发展战略，充分发挥科技创新支撑新旧动能转换的重要作用，省政府决定，对为我省科学技术进步、经济社会发展作出突出贡献的科学技术人员和组织给予奖励。

根据《山东省科学技术奖励办法》规定，经省科学技术奖励评审委员会评审、省科学技术奖励委员会审定和省科技厅审核，省政府批准，授予中国海洋大学李华军、山东重工集团有限公司谭旭光省科学技术最高奖；授予“复杂三维形状的高效生成、分析与制造”等2项成果省自然科学奖一等奖，“严格反馈随机系统的分析与控制”等32项成果省自然科学奖二等奖，“模糊集在拓扑、粗糙近似算子及数据特征提取和分类中的应用研究”等5项成果省自然科学奖三等奖；授予“EtherMAC网络化运动控制关键技术及系列装备”等3项成果省技术发明奖一等奖，“大蒜全程机械化生产技术装备研发与应用”等6项成果省技术发明奖二等奖，“超级压光机的研发及应用”等6项成果省技术发明奖三等奖；授予“脂肪族异氰酸酯全产业链制造技术”等26项成果省科学技术进步奖一等奖，“高速动车组转向架数字化装配生产线”等79项成果省科学技术进步奖二等奖，“LCZ-ZD全钢一次法三鼓成型机的开发”等110项成果省科学技术进步奖三等奖。

全省科学技术工作者要向李华军、谭旭光同志及全体获奖者学习，弘扬科学精神和工匠精神，深入实施创新驱动发展战略，加快建设创新型省份，营造崇尚创新的社会氛围，为新时代现代化强省建设作出新的更大贡献。

山东省海洋局关于征集2020年度山东省海洋软科学研究课题的通知文章属性•【制定机关】山东省海洋局•【公布日期】2020.03.09•【字号】•【施行日期】2020.03.09•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】科学技术综合规定正文山东省海洋局关于征集2020年度山东省海洋软科学研究课题的通知各有关单位：2020年是我省海洋软科学课题研究的第九个年度。

为充分借助各方面的智力资源，深入研究山东海洋发展重大问题，整体推进海洋强省建设，为省委、省政府决策提供参考，现向社会公开征集2020年度山东省海洋软科学研究课题。

具体事项通知如下。

一、总体要求以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，坚持问题导向和目标导向，坚持“三新一用”（研究新情况、分析新问题、提出新建议、可直接用于决策）的研究标准、“小切口、大介入”的研究方法、政产学研金服用融合的研究机制，围绕更加注重经略海洋、加快落实海洋强省战略、完善海洋产业发展政策、强化海洋灾害应急管理、促进海洋经济高质量发展等重点领域开展调查研究，提高选题的针对性、时效性、应用性，力争形成一批可转化、能应用的高质量研究成果。

二、选题原则和重点对于推荐的选题，一是要明确研究的关键点。

明确研究成果要解决的关键性问题，务必具体、可界定，不能提出笼统的、不可考量的研究目标任务。

二是要体现研究的创新性。

研究成果要能够解决目前尚无人能够明确回答的具体问题。

参考选题如下：（一）新冠肺炎疫情对山东海洋产业（可具体到某一个产业）的影响与对策；（二）中美贸易摩擦背景下山东海洋产业（可具体到某一个产业）面临的新情况、新问题与对策；（三）特重大海洋灾害应急管理存在的重大问题与对策；（四）海洋牧场盗捕现象的成因与对策；（五）“岛长制”制度设计方案研究；（六）国有企业参与海洋牧场建设面临的困难与对策；（七）山东省极地及远洋渔业面临的新形势与对策建议；（八）海水淡化成本分析与降低成本对策；（九）山东省海洋装备制造业主攻方向研究；（十）其他有关海洋经济高质量发展的重大问题及对策。

山东省科学技术厅关于印发《山东省科技计划项目科研诚信管理办法》的通知文章属性•【制定机关】山东省科学技术厅•【公布日期】2020.11.24•【字号】鲁科字〔2020〕105号•【施行日期】2021.01.01•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】科技计划正文山东省科学技术厅关于印发《山东省科技计划项目科研诚信管理办法》的通知各市科技局，各有关单位：现将《山东省科技计划项目科研诚信管理办法》印发给你们，请认真遵照执行。

山东省科学技术厅2020年11月24日目录第一章总则第二章行为评价第三章失信记录第四章评价结果应用第五章附则山东省科技计划项目科研诚信管理办法第一章总则第一条为加强和规范省级科技计划项目（以下简称项目）科研诚信管理，营造诚实守信的良好科研环境，根据《中共中央办公厅国务院办公厅印发〈关于进一步加强科研诚信建设的若干意见〉的通知》《中共山东省委办公厅山东省人民政府办公厅印发〈关于弘扬科学家精神加强科研诚信建设的若干措施〉的通知》和《科学技术活动违规行为处理暂行规定》（科学技术部令第19号）等文件精神，制定本办法。

第二条项目科研诚信管理是省科技厅对参与项目的相关责任主体在项目推荐、申报、立项、实施、管理、验收、绩效评价和咨询评审评估等全过程中，遵守学术规范、恪守科学道德、履行约定义务的诚信状况进行公正评价和客观记录，并据此进行守信激励、失信惩戒等相关工作。

第三条参与项目的相关责任主体，主要包括项目承担（申报）人员、项目咨询评审专家（以下简称专家）等自然人，以及受省科技厅委托开展项目管理工作的专业机构（以下简称管理机构）、项目承担（申报）单位、第三方科学技术服务机构（以下简称服务机构）等法人机构。

第四条全面实施科研诚信承诺制。

省科技厅负责组织相关责任主体在项目申报管理实施前签署科研诚信承诺书，明确承诺事项和违背承诺的处理要求。

第五条建立完善科研诚信审核机制。

省科技厅负责对相关责任主体开展科研诚信审核，将具备良好科研诚信状况作为参与项目的必备条件。

1.作者：败转头作品编号44122544：GL568877444633106633215458时间：2020.12.13一、单选题（共20道题，下列各题选项中，只有一个正确答案）1.《失信企业协同监管和联合惩戒合作备忘录》由多少个部委联合签署？（2 分）A. 21B. 27C. 34D. 38ABCD2.上海市公共信用信息服务平台是在哪一年开通的？（2 分）A. 2012年B. 2013年C. 2014年D. 2015年ABCD3.“信用中国”网站主要是由哪个部委支持下建设的？（2 分）A. 国家发展改革委B. 中国人民银行C. 工业和信息化部D. 国家工商总局ABCD4.苏州市社会信用体系建设领导小组组长由哪个级别的官员担任？（2 分）A. 市委书记B. 市长C. 常务副市长D. 市经济和信息化委员会主任ABCD5.“信用中国”网站由哪个公司提供技术支持？（2 分）A. 阿里巴巴B. 百度C. 腾讯D. 联想ABCD6.“信用记录关爱日”是哪一天？（2 分）A. 3月15日B. 3月5日C. 6月14日D. 12月4日ABCD7.中国人民银行企业和个人征信系统正式对外提供服务。

（2 分）A. 2010年B. 2011年C. 2012年D. 2013年ABCD8.中国在哪一年出现了第一家互联网企业？（2 分）A. 1992年B. 1993年C. 1994年D. 1995年ABCD9.《国务院关于建立完善守信联合激励和失信联合惩戒制度加快推进社会诚信建设的指导意见》是在哪年出台的？（2 分）A. 2014年B. 2015年C. 2016年D. 2017年ABCD10.以下哪个机制是社会信用体系运行的核心机制？（2 分）A. 守信激励和失信惩戒机制B. 信用信息归集机制C. 信用信息共享机制D. 诚信教育机制ABCD11.《国务院办公厅关于社会信用体系建设的若干意见》是在哪一年出台的？（2 分）A. 2007年B. 2009年C. 2011年D. 2014年ABCD12.社会信用代码中的校验码有多少位？（2 分）A. 1B. 3C. 6D. 9ABCD13.哪个城市推出了市民信用评价产品“桂花分”？（2 分）A. 杭州B. 苏州C. 义乌D. 成都ABCD14.《社会信用服务机构执业管理办法》是由哪个单位制定的？（2 分）A. 国家发展改革委B. 中国人民银行C. 商务部D. 中国信用协会ABCD15.《国务院关于加强政务诚信建设的指导意见》是哪一年出台的？（2 分）A. 2012年B. 2014年C. 2015年D. 2016年ABCD16.国家质检总局把企业质量信用等级分为几级？（2 分）A. 3级B. 4级C. 5级作者：败转头作品编号44122544：GL568877444633106633215458时间：2020.12.13D. 6级ABCD17.社会信用代码第一位是什么代码？（2 分）A. 登记管理机关行政区划码B. 主体标识码（组织机构代码）C. 登记管理部门代码D. 机构类别代码E. 校验码ABCDE18.第二批青年信用体系建设试点地区有多少个？（2 分）A. 7个B. 9个C. 11个D. 15个ABCD19.哪个省份是全国首个颁布青年守信联合激励政策的省份？（2 分）A. 北京市B. 上海市C. 广东省D. 浙江省ABCD20.中央改革办在哪一年把社会信用体系建设作为改革督察的重点内容？（2 分）A. 2014年B. 2015年C. 2016年D. 2017年ABCD二、多选题（共10道题，下列各题选项中，可能有多个正确答案）21.政务诚信建设要坚持哪些原则？（4 分）A. 依法行政B. 政务公开C. 勤政高效D. 守信践诺ABCD22.中国人民银行征信系统接入了哪些类型的金融机构？（4 分）A. 商业银行B. 信托公司C. 财务公司D. 租赁公司E. 资产管理公司ABCDE23.司法公信力体现的是人民群众对以下哪些方面的信任程度？（4 分）A. 司法制度B. 司法机关C. 司法人员D. 司法权运行过程及结果ABCD24.个人诚信体系建设的基本原则包括哪些？（4 分）A. 政府推动，社会共建B. 健全法制，规范发展C. 全面推进，重点突破D. 强化应用，奖惩联动ABCD25.团江苏省委联合哪些政府部门成立了江苏省青年信用体系建设试点工作领导小组？（4 分）A. 江苏省发展和改革委员会B. 江苏省经济和信息化委员会C. 江苏省教育厅D. 中国人民银行南京分行ABCD26.德国采用了哪些社会信用体系建设模式？（4 分）A. 政府主导模式B. 市场主导模式C. 会员制模式ABC27.根据《国务院办公厅关于加强个人诚信体系建设的指导意见》，以下哪些重点领域要建立个人诚信记录？（4 分）A. 食品药品B. 安全生产C. 消防安全D. 交通安全ABCD28.以下哪些区县（县级市）是江苏省社会信用体系建设第一批县级试点地区？（4 分）A. 姑苏区B. 江阴市C. 睢宁县D. 兴化市ABCD29.《国务院关于建立完善守信联合激励和失信联合惩戒制度加快推进社会诚信建设的指导意见》提出对重点领域和严重失信行为实施联合惩戒，以下哪些属于严重失信行为？（4 分）A. 逃税骗税B. 恶意拖欠货款或服务费C. 非法集资D. 传销E. 无证照经营ABCDE30.以下哪些是对失信行为的市场性约束和惩戒措施？（4 分）A. 限制参与有关公共资源交易活动B. 对有履行能力但拒不履行的严重失信主体实施限制出境、乘坐飞机等措施C. 支持征信机构采集严重失信行为信息，纳入信用记录和信用报告。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(８):５６~６４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０８.００８收稿日期:２０２２－１０－２０基金项目:国家自然科学基金项目(３２００１９２９)ꎻ山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２０ＭＣ１２５)作者简介:赵晓彤(２０００ )ꎬ女ꎬ山东东营人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为园林植物种质资源创新与应用ꎮＥ－ｍａｉｌ:２５８１１４６９４９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:王桂清(１９６８ )ꎬ女ꎬ河北泊头人ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事植物保护教学与科研工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗａｎｇｇｕｉｑｉｎｇ＠ｌｃｕ.ｅｄｕ.ｃｎ不同培养条件对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９生长与产孢的影响赵晓彤ꎬ王桂清(聊城大学农学与农业工程学院ꎬ山东聊城㊀２５２０００)㊀㊀摘要:采用十字交叉法和血球计数法分析不同培养基㊁温度㊁光照㊁酸碱度㊁碳源和氮源等对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９菌丝生长和孢子形成的影响ꎬ明确两种木霉生长繁殖的最佳条件ꎬ指导其人工扩繁和工厂化生产ꎮ结果表明ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９在含碳源和有机氮的ＰＤＡ㊁ＣＤＡ培养基中ꎬ常温㊁黑暗㊁非强酸强碱培养条件下其菌丝生长良好ꎬ光照㊁果糖㊁牛肉膏培养条件更有利于二者孢子形成ꎻ温度㊁酸碱度和培养基是影响ＳＭＦ２和Ｔ３９孢子形成的主要因素ꎬ３５ħ㊁ｐＨ值为７㊁ＰＤＡ培养基最利于ＳＭＦ２产孢ꎬ３０ħ㊁ｐＨ值为６㊁ＣＤＡ培养基最利于Ｔ３９产孢ꎻ相同条件下ꎬＳＭＦ２的菌丝生长略快ꎬ而Ｔ３９的产孢能力更强ꎻ单糖和有机氮更有利于促进ＳＭＦ２和Ｔ３９产孢ꎮ关键词:培养条件ꎻ长枝木霉ＳＭＦ２ꎻ哈茨木霉Ｔ３９ꎻ菌丝生长ꎻ孢子形成中图分类号:Ｓ４７６.１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０８－００５６－０９ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎＧｒｏｗｔｈａｎｄＳｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＬｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍＳＭＦ２ａｎｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＨａｒｚｉａｎｕｍＴ３９ＺｈａｏＸｉａｏｔｏｎｇꎬＷａｎｇＧｕｉｑｉｎｇ(ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｈｏｏｌꎬＬｉａｏｃｈｅｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉａｏｃｈｅｎｇ２５２０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａꎬｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｌｉｇｈｔꎬｐＨꎬｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｔｈｅｈｙｐｈａｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｐｏｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍＳＭＦ２ａｎｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＴ３９ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｒｏｓｓｍｅｔｈｏｄａｎｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ.Ｉｔｗａｓａｉｍｅｄｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉ￣ｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｅｃｉｅｓꎬａｎｄｔｏｇｕｉｄｅｔｈｅｉｒａｒｔｉｆｉｃｉａｌｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎａｎｄｆａｃｔｏｒｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＳＭＦ２ａｎｄＴ３９ｈａｄｂｅｔｔｅｒｈｙｐｈａｇｒｏｗｔｈｕｎｄｅｒｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａ￣ｔｕｒｅꎬｄａｒｋꎬｎｏｎ￣ｓｔｒｏｎｇａｃｉｄａｎｄａｌｋａｌｉｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎＰＤＡａｎｄＣＤＡｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅａｎｄｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎꎬａｎｄｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｌｉｇｈｔꎬｆｒｕｃｔｏｓｅａｎｄｂｅｅｆｐａｓｔｅｗｅｒｅｍｏｒｅｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏｔｈｅｓｐｏｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ.ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬｐＨａｎｄｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＳＭＦ２ａｎｄＴ３９ｓｐｏｒｅｓꎻ３５ħꎬｐＨ＝７ａｎｄＰＤＡｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏＳＭＦ２ｓｐｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬａｎｄ３０ħꎬｐＨ＝６ａｎｄＣＤＡｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏＴ３９ｓｐｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.ＵｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｔｈｅｈｙｐｈａｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｏｆＳＭＦ２ｗａｓｓｌｉｇｈｔｌｙｆａｓｔｅｒꎬａｎｄｔｈｅｓｐｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆＴ３９ｗａｓｓｔｒｏｎｇｅｒ.Ｍｏｎｏ￣ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｗｅｒｅｍｏｒｅｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏＳＭＦ２ａｎｄＴ３９ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＣｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎻＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍＳＭＦ２ꎻＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＴ３９ꎻＨｙ￣ｐｈａｇｒｏｗｔｈꎻＳｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀生防真菌在防治作物病害(尤其是土传病害)方面发挥着巨大作用ꎬ其中研究最多和应用最广的为木霉菌(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ.)[１]ꎮ木霉菌广泛分布于不同生态环境中ꎬ以丰富的次生代谢物和强大的竞争能力及重寄生特性实现其生物防治作用ꎬ在土壤修复㊁促进植物生长和控制病害方面发挥着重要作用[２]ꎬ可作为高效㊁经济㊁环保的原材料应用于工业和农业生产[３]ꎮ因其具有生长分布的广泛性㊁种类株系的适应性㊁拮抗真菌的广谱性㊁活性物质的多样性㊁作用机制的复杂性和对环境的友好性等特点而成为最有应用前途的生防因子[４－６]ꎮ最为常见的木霉菌有哈茨木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ)㊁棘孢木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ)㊁长枝木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ)和绿色木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ)等ꎮ哈茨木霉是目前农业生物防治中最具商业化价值的木霉菌ꎬ应用广泛ꎻ长枝木霉是较为常见的拮抗类木霉ꎬ在植病生防中越来越受到重视ꎮ哈茨木霉Ｔ２２㊁Ｔ３９作为生防产品已登记注册ꎬ不仅可以诱导寄主防御基因表达产生抗病性而防治植物病害ꎬ还可以促进作物生长进而提高生物量[７－９]ꎮ长枝木霉ＳＭＦ２主要通过产生抗菌肽康宁霉素(ｔｒｉｃｈｏｋｏｎｉｎｓꎬＴＫｓ)而对植物病害产生抑制作用ꎬ同时对苦瓜㊁白三叶草等植物具有明显的促生作用[１ꎬ１０]ꎮ木霉菌种类不同㊁菌株不同ꎬ其生态适应性也不同ꎮ绿色木霉ＴＲ－８㊁哈茨木霉ＴＨ－１均可在ＰＤＡ培养基上正常生长ꎻ光照可促进孢子产生ꎬ但二者最适生长温度㊁ｐＨ值等略有不同ꎻ微量元素Ｍｎ对ＴＲ－８菌丝生长有一定的促进作用[１１－１２]ꎮ生物学特性是研究真菌繁殖条件㊁发生规律㊁生态调控等方面的理论基础ꎬ对生防菌的科学利用具有指导作用[１３]ꎮ本试验通过研究不同培养条件下长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９的生物学特性ꎬ明确其生长繁殖条件ꎬ为其人工扩繁和工厂化生产奠定理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试材料供试菌种为长枝木霉(Ｔ.ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ)ＳＭＦ２和哈茨木霉(Ｔ.ｈａｒｚｉａｎｕｍ)Ｔ３９ꎬ由聊城大学植物病理实验室提供ꎮ将供试菌种在(２５ʃ１)ħ㊁ＬʒＤ(光照ʒ黑暗)＝１２ｈʒ１２ｈ的恒温光照培养箱内采用ＰＤＡ培养基培养３ｄ后ꎬ用打孔器取直径０.７ｃｍ的菌饼备用ꎮ１.２㊀试验设计１.２.１㊀培养基㊀供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(ＰＤＡ:去皮马铃薯２００ｇ㊁葡萄糖２０ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁蒸馏水１Ｌ)㊁察氏培养基(ＣＤＡ:葡萄糖２０ｇ㊁ＫＨ２ＰＯ４０.５ｇ㊁Ｋ２ＨＰＯ４０.６ｇ㊁ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.５ｇ㊁ＮａＣｌ０.１ｇ㊁天门冬酰胺５ｇ㊁ＣａＣｌ２０.１ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁蒸馏水１Ｌ)㊁燕麦培养基(ＯＭＡ:燕麦片４０ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁蒸馏水１Ｌ)㊁基础固体培养基(ＢＣＭ:蛋白胨１０ｇ㊁牛肉浸膏３ｇ㊁Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ㊁ＮａＣｌ５ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁蒸馏水１Ｌ)㊁麦芽糖琼脂培养基(ＭＥＡ:麦芽糖２０ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁蒸馏水１Ｌ)[１５]共５种ꎮ１.２.２㊀温度㊀以ＰＤＡ培养基为营养源ꎬ温度范围５~４０ħ之间ꎬ设置５㊁１０㊁１５㊁２０㊁２５㊁３０㊁３５㊁４０ħ共８个处理ꎮ１.２.３㊀光照㊀以ＰＤＡ培养基为营养源ꎬ设置全光照㊁光暗交替(ＬʒＤ＝１２ｈʒ１２ｈ)㊁全黑暗３个处理ꎮ１.２.４㊀ｐＨ值㊀以ＰＤＡ培养基为营养源ꎬ使用１.０ｍｏｌ/ＬＨＣｌ溶液和１.０ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液调节ＰＤＡ培养基的ｐＨ值ꎬ设ｐＨ值为３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８㊁９㊁１０㊁１１㊁１２共１０个处理ꎮ１.２.５㊀碳源㊀以ＣＤＡ培养基作为基础培养基ꎬ用供试碳源等量替换其中的葡萄糖(标准碳)ꎬ制成不同碳源培养基ꎮ供试碳源选用蔗糖㊁麦芽糖㊁乳糖㊁果糖㊁海藻糖㊁阿拉伯糖㊁可溶性淀粉㊁微晶纤维素共８种ꎬ并以无碳处理作为空白对照ꎮ１.２.６㊀氮源㊀以ＣＤＡ培养基作为基础培养基ꎬ用供试氮源等量替换其中的天门冬酰胺(标准氮)ꎬ制成不同氮源培养基ꎮ供试氮源选用硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钠㊁牛肉膏㊁酵母浸膏㊁蛋白胨㊁甘氨酸共７种ꎬ并以无氮处理作为空白对照ꎮ１.３㊀测定项目及方法将高压湿热灭菌后的培养基制成平板(直径９ｃｍ)ꎬ于培养皿内接种木霉菌饼ꎬ１皿１饼ꎬ重复３次ꎮ研究不同培养基㊁温度㊁光照㊁ｐＨ值㊁碳源和氮源对ＳＭＦ２㊁Ｔ３９菌丝生长和产孢量的影响ꎮ不同处理分别于(２５ʃ１)ħ㊁ＬʒＤ＝１２ｈʒ１２ｈ的恒温光照培养箱培养４８ｈ后ꎬ采用十字交叉法测量菌落直径ꎬ７２ｈ后用相机拍照记录培养性状ꎬ采用血球计数法计算产孢量[１４－１５]ꎮ７５㊀第８期㊀㊀㊀㊀㊀赵晓彤ꎬ等:不同培养条件对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９生长与产孢的影响１.４㊀数据处理与分析利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０２０处理数据ꎬ用ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ２０２０软件处理照片ꎬ用ＤＰＳ１９.０５中的Ｄｕｎｃａｎ ｓ法进行多组样本间的差异显著性分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀不同培养基对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响图１显示ꎬＳＭＦ２㊁Ｔ３９在５种供试培养基中均可生长ꎬ菌丝生长呈辐射状ꎬ色素颜色为黄绿色ꎬ培养基不同菌丝色素颜色深浅不同ꎮ其中ꎬ二者在ＭＥＡ培养基上生长均不理想ꎬ菌丝稀薄ꎬ不产生色素ꎬ产孢量小ꎮ不同培养基条件下两种木霉菌丝生长速度和产孢量存在差异ꎮ由图２可知ꎬ二者在ＰＤＡ培养基上生长状况最好ꎬ菌落大㊁菌丝生长旺盛ꎬ产孢量大ꎮＳＭＦ２菌落直径达７.６９ｃｍꎬ是Ｔ３９的１.２５倍(表１)ꎬ产孢量为２.６４ˑ１０１０个/皿ꎻＴ３９菌落直径为６.１６ｃｍꎬ产孢量为３.８６ˑ１０１０个/皿ꎮ在ＣＤＡ㊁ＯＭＡ㊁ＢＣＭ培养基上ꎬ二者生长状况较好ꎬＴ３９的产孢量是ＳＭＦ２的１.２７~６.５５倍(表１)ꎬ且Ｔ３９在ＣＤＡ上的产孢量高达４.５８ˑ１０１０个/皿ꎮ上行图为ＳＭＦ２ꎬ下行图为Ｔ３９ꎬ下同ꎻ从左至右依次为ＰＤＡ㊁ＣＤＡ㊁ＯＭＡ㊁ＢＣＭ㊁ＭＥＡꎮ图１㊀不同培养基条件下两种木霉培养结果比较图２㊀不同培养基对两种木霉菌丝生长和产孢量的影响㊀㊀表１㊀不同培养基下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标ＰＤＡＣＤＡＯＭＡＢＣＭＭＥＡ菌落直径１.２５１.０５０.９７１.０９０.８４产孢量１.４６６.５５１.２７２.０１０.８８㊀㊀注:表中菌落直径的倍数为ＳＭＦ２/Ｔ３９ꎬ产孢量的倍数为Ｔ３９/ＳＭＦ２ꎬ下同ꎮ㊀㊀综合菌丝生长速度㊁产孢量和培养性状ꎬＰＤＡ为ＳＭＦ２菌株生长发育的最佳培养基ꎬＣＤＡ为Ｔ３９的最佳培养基ꎮＴ３９菌株的产孢能力明显大于ＳＭＦ２ꎮ２.２㊀不同温度对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响由图３可知ꎬ两种木霉在２５~３５ħ范围内菌丝生长旺盛ꎬ呈辐射状ꎬ菌落致密ꎬ在整个培养基上密布成堆ꎮ当培养温度ɤ２０ħ或高达４０ħ时ꎬ两种木霉生长状况均较差ꎬ菌丝稀薄ꎬ产孢量少ꎮ由图４可知ꎬ供试温度范围内ꎬ随着温度升高ꎬ两种木霉的菌落直径和产孢量均呈现先升高后降低的变化ꎮＳＭＦ２的菌落直径和产孢量拐点均出现在３５ħꎬ菌落直径最大达８.７５ｃｍꎬ是Ｔ３９的１.２９倍(表２)ꎬ产孢量最高达６１.０６ˑ１０８８５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀个/皿ꎻ而Ｔ３９的菌落直径拐点出现在２５ħꎬ最大达８.３５ｃｍꎬ产孢量拐点出现在３０ħꎬ最高达２０６.４６ˑ１０８个/皿ꎮ５~３０ħ范围内ꎬ同一温度下ꎬＴ３９的产孢能力强于ＳＭＦ２ꎬ前者的产孢量是后者的１.１１~２３.８３倍(表２)ꎻ而３５~４０ħ时ꎬＴ３９的产孢能力低于ＳＭＦ２ꎬ后者的产孢量是前者的１.０６~１.９６倍ꎮ从左至右依次为５㊁１０㊁１５㊁２０㊁２５㊁３０㊁３５㊁４０ħꎮ图３㊀不同温度条件下两种木霉培养结果比较㊀㊀表明两种木霉在最适培养温度上有差异ꎬＳＭＦ２的菌丝生长和产孢最适温度均为３５ħꎬＴ３９的菌丝生长最适温度为２５~３０ħꎬ产孢最适温度为３０ħꎮ相同温度下Ｔ３９产孢量整体较高ꎮ图４㊀不同温度条件下两种木霉菌丝生长和产孢量比较㊀㊀表２㊀不同温度条件下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标５ħ１０ħ１５ħ２０ħ２５ħ３０ħ３５ħ４０ħ菌落直径０.９０１.４９２.２４１.２１０.９３０.９８１.２９０.９４产孢量１.１７１.１１４.００３.７０２３.８３１３.６２０.５１０.９５２.３㊀不同光照对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响图５显示ꎬＳＭＦ２㊁Ｔ３９在３种不同光照条件下均能正常生长ꎬ菌落致密ꎬ菌丝呈辐射状ꎬ生长旺盛ꎮ二者在全光照条件下产孢最多ꎬ光暗交替条件下次之ꎬ全黑暗条件下最少ꎮ由图６可知ꎬ不同光照条件下ꎬＳＭＦ２㊁Ｔ３９的菌落直径范围分别为６.３１~８.１３㊁５.７５~６.６７ｃｍꎬ且菌落直径均在全黑暗条件下达到最大ꎬ全光照条件下次之ꎬ光暗交替条件下最小ꎮＳＭＦ２菌丝生长较快ꎬ是Ｔ３９的１.０５~１.２２倍(表３)ꎮ从左到右依次为全光照㊁光暗交替㊁全黑暗ꎮ图５㊀不同光照条件下两种木霉培养结果比较Ｔ３９㊁ＳＭＦ２产孢量均在全光照条件下达到最大ꎬ分别为３３.８３ˑ１０８㊁９.５０ˑ１０８个/皿ꎻ不同光照条件下ꎬＴ３９的产孢量为ＳＭＦ２的２.４５~４.１４倍(表３)ꎮ表明光照条件能够有效增加二者的产孢量ꎬ且同一光照条件下ꎬＴ３９产孢量明显高于ＳＭＦ２ꎮ图６㊀不同光照条件下两种木霉菌丝生长和产孢量比较９５㊀第８期㊀㊀㊀㊀㊀赵晓彤ꎬ等:不同培养条件对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９生长与产孢的影响㊀㊀表３㊀不同光照条件下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标全光照光暗交替全黑暗菌落直径１.０５１.１０１.２２产孢量３.５６２.４５４.１４２.４㊀不同ｐＨ值对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响图７显示ꎬ两种木霉在ｐＨ值为４~１１条件下均可生长ꎬ菌落相对致密ꎬ菌丝生长比较旺盛ꎬ孢子均匀密布整个培养基ꎻ但极强的酸㊁碱环境即ｐＨ值为３㊁１２条件下ꎬ二者生长状况较差ꎬｐＨ值为１２条件下菌丝生长缓慢ꎬ菌落较小ꎬ产孢量较少ꎻｐＨ值为３条件下由于酸性过大ꎬ培养基无法凝固ꎬ两种菌生长缓慢ꎬ产孢极少ꎮ从左到右依次为ｐＨ＝３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８㊁９㊁１０㊁１１㊁１２ꎮ图７㊀不同ｐＨ值条件下两种木霉培养结果比较㊀㊀由图８可知ꎬｐＨ值为４~１１条件下ꎬＳＭＦ２㊁Ｔ３９的菌丝生长和产孢量存在明显差异ꎮＳＭＦ２的菌落直径范围为６.５１~８.４５ｃｍꎬｐＨ值为９时菌落直径最大ꎻＴ３９的菌落直径范围为４.９５~７.４８ｃｍꎬｐＨ值为４时菌落直径最大ꎬ且随ｐＨ值增大整体呈减小趋势ꎮｐＨ值为４~５时ꎬＴ３９的菌丝生长比较快ꎬ其菌落直径是ＳＭＦ２的１.０７~１.１５倍ꎻｐＨ值为６~１１时ꎬＳＭＦ２的菌丝生长比较快ꎬ其菌落直径是Ｔ３９的１.１７~１.５９倍(表４)ꎮｐＨ值为４~１１条件下ꎬＳＭＦ２的产孢量为(０.４６~２.９１)ˑ１０１０个/皿ꎬｐＨ值为７时孢子量最多ꎻＴ３９的产孢量为(１.４８~５.２２)ˑ１０１０个/皿ꎬｐＨ值为６时孢子量最多ꎮ相同ｐＨ值下Ｔ３９的产孢量是ＳＭＦ２的１.２５~４.２０倍(表４)ꎮ表明中性偏碱环境有利于ＳＭＦ２的生长和繁殖ꎬ其菌丝生长和产孢的最适ｐＨ值分别为９和７ꎻ偏酸条件则更有利于Ｔ３９的生长发育ꎬ其菌丝生长和产孢的最适ｐＨ值分别为４和６ꎮ图８㊀不同ｐＨ值条件下两种木霉菌丝生长和产孢量比较㊀㊀表４㊀不同ｐＨ值条件下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标３４５６７８９１０１１１２菌落直径１.２９０.８７０.９３１.２４１.１７１.２１１.５９１.２３１.５４１.３４产孢量４.８９３.６８４.２０３.１３１.２５１.３２１.７６１.９３１.４３１.１７２.５㊀不同碳源对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响图９显示ꎬ两种木霉在无碳培养基上可产孢ꎬ从左到右依次为无碳㊁果糖㊁阿拉伯糖㊁海藻糖㊁麦芽糖㊁蔗糖㊁乳糖㊁可溶性淀粉㊁微晶纤维素ꎮ图９㊀不同碳源条件下两种木霉培养结果比较０６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀但产孢量较少㊁生长较差ꎬ菌落直径相对较小ꎬ菌丝稀疏ꎻ在其他碳源培养基上菌丝生长均较旺盛ꎬ产孢量大ꎬ呈辐射状ꎬ分生孢子密布于菌落上ꎮ不同碳源处理下两种木霉的生长发育状况较无碳对照均明显提高ꎬ表明其对碳源的要求不严格ꎬ但对单糖(果糖㊁阿拉伯糖)的利用效果优于双糖(海藻糖㊁麦芽糖㊁蔗糖㊁乳糖)和多糖(可溶性淀粉㊁微晶纤维素)ꎮ微晶纤维素由于自身溶解性较差ꎬ以其为碳源时ꎬ菌丝生长和产孢能力不理想ꎬ但其生长发育状况仍优于无碳对照ꎮ由图１０可知ꎬ无碳条件下ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９菌落直径均低于５ｃｍꎬ产孢量不超过１.００ˑ１０１０个/皿ꎮ不同碳源处理下ꎬＳＭＦ２的菌落直径为５.１６~７.７１ｃｍꎬ产孢量为(０.９５~１.６２)ˑ１０１０个/皿ꎬ分别是无碳培养基的１.０６~１.５９㊁２.７１~４.６３倍ꎻＴ３９的菌落直径为４.２０~５.６２ｃｍꎬ产孢量为(１.５６~２.５０)ˑ１０１０个/皿ꎬ与无碳培养基相比ꎬ前者产孢量是后者的１.６８~２.６９倍ꎬ菌落直径的倍数关系在１.０１~１.３６之间ꎬ差异较小ꎮ阿拉伯糖为ＳＭＦ２和Ｔ３９菌丝生长的最适碳源ꎬ果糖为二者产孢的最佳碳源ꎮ由表５可知ꎬ不同碳源条件下ꎬＳＭＦ２的菌丝生长较快ꎬ菌落直径是Ｔ３９的１.２３~１.４７倍ꎻＴ３９的产孢能力明显大于ＳＭＦ２ꎬ前者是后者的１.１０~１.６４倍ꎮ图１０㊀不同碳源条件下两种木霉菌丝生长和产孢量比较㊀㊀表５㊀不同碳源条件下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标无碳果糖阿拉伯糖海藻糖麦芽糖蔗糖乳糖可溶性淀粉微晶纤维素菌落直径１.１７１.４７１.３７１.４４１.４１１.３３１.３３１.３５１.２３产孢量２.６５１.５４１.４２１.５２１.５５１.４６１.１０１.５５１.６４２.６㊀不同氮源对两种木霉菌丝生长和产孢能力的影响图１１显示ꎬ无氮条件下ꎬ两种木霉的孢子肉眼几乎不可见ꎮ相比较无氮对照ꎬ两种木霉在以蛋白胨㊁酵母浸膏㊁牛肉膏㊁甘氨酸为氮源的培养基上生长良好ꎬ菌丝致密ꎬ产孢量较多ꎻ而在其他氮源培养基中ꎬ菌丝稀薄ꎬ产孢量少ꎬ生长㊁产孢均不理想ꎮ从左到右依次为无氮㊁蛋白胨㊁牛肉膏㊁酵母浸膏㊁甘氨酸㊁硝酸钠㊁硫酸铵㊁氯化铵ꎮ图１１㊀不同氮源条件下两种木霉培养结果比较㊀㊀由图１２可知ꎬ不同氮源条件下两种木霉的菌丝生长差异明显ꎮ在以有机氮(蛋白胨㊁牛肉膏㊁酵母浸膏)㊁氨基酸态氮(甘氨酸)为氮源的培养基上生长速率均快于铵态氮(硫酸铵㊁氯化铵)和硝态氮(硝酸钠)ꎮ在有机氮㊁氨基酸态氮为氮源的培养基上菌落直径为４.２８~７.６９ｃｍꎬ在其他氮源培养基上的菌落直径仅为０.９２~１.８７ｃｍꎮ其中ꎬＳＭＦ２在有机氮㊁氮基酸态氮㊁硝态氮为氮源的培养基上菌落直径大于Ｔ３９ꎬ前者是后者的１.０３~１.３９倍(表６)ꎮ１６㊀第８期㊀㊀㊀㊀㊀赵晓彤ꎬ等:不同培养条件对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９生长与产孢的影响无氮条件下ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９的菌落直径分别为３.７２㊁４.７２ｃｍꎬ产孢量为９.１７ˑ１０８㊁７３.７５ˑ１０８个/皿ꎮ不同有机氮源条件下ꎬＳＭＦ２产孢量达到(３０４.３８~５２８.３３)ˑ１０８个/皿ꎬＴ３９产孢量达到(９１.８８~１５９.３８)ˑ１０８个/皿ꎬＳＭＦ２的产孢量是Ｔ３９的２.９４~５.６９倍ꎻ而以硝态氮和铵态氮为氮源时ꎬＴ３９的产孢能力增强ꎬ其产孢量是ＳＭＦ２的２.７３~４.６８倍(表６)ꎮ㊀㊀表６㊀不同氮源条件下ＳＭＦ２与Ｔ３９生物量的倍数比较指标无氮蛋白胨牛肉膏酵母浸膏甘氨酸硝酸钠硫酸铵氯化铵菌落直径０.７９１.３９１.０５１.０３１.０６１.１６０.８６０.８１产孢量８.０５０.１８０.３００.３４０.４３４.６８３.０６２.７３㊀㊀添加有机氮源培养基的ＳＭＦ２和Ｔ３９菌落直径㊁产孢量分别是无氮源添加的１.１１~２.０７㊁１.２５~５７.６４倍ꎮ且两种木霉的菌落直径和产孢量均在有机氮源培养基中达到最大值ꎬ其菌落直径和产孢量的最佳氮源分别为酵母浸膏和牛肉膏ꎬ表明二者对有机氮源的利用情况优于其他氮源ꎮ图１２㊀不同氮源条件下两种木霉菌丝生长和产孢量比较３㊀讨论培养基㊁温度㊁光照㊁酸碱度㊁碳源和氮源均对木霉菌的菌丝生长和孢子形成有不同影响ꎮ３.１㊀不同培养基对两种菌培养的影响培养基是微生物学研究和微生物发酵工业的基础ꎬ其营养组成直接影响微生物生长发育ꎮ目前培养木霉菌常用的培养基有ＰＤＡ㊁ＣＤＡ㊁ＭＥＡ㊁ＰＳＡ㊁糖浆培养基㊁玉米粉葡萄糖培养基㊁小麦汁培养基和玉米培养基[１６]等ꎮ马铃薯是ＰＤＡ的重要组分ꎬ含有丰富的Ｂ族维生素㊁纤维素㊁微量元素㊁氨基酸㊁蛋白质㊁脂肪和优质淀粉等营养元素ꎬ为微生物生长提供充裕碳源㊁氮源㊁维生素和无机盐ꎻ葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物ꎬ能够提供优质碳源ꎮＣＤＡ中葡萄糖和天门冬酰胺为重要的碳源㊁氮源ꎬ含量较高的氯化钠具有抑制细菌和减缓毛霉生长的作用ꎬ其他成分则提供必需离子ꎻＯＭＡ中的燕麦含有丰富的蛋白质㊁脂肪㊁淀粉㊁微量元素和膳食纤维ꎬ是氮源㊁碳源和微量元素等的重要来源ꎻＢＣＭ中的牛肉膏和蛋白胨为碳源㊁氮源㊁磷酸盐和维生素的主要来源ꎬ氯化钠则提供无机盐ꎮ有研究表明ꎬ长枝木霉Ｔ０５在ＰＤＡ㊁ＭＥＡ㊁ＣＤＡ㊁ＢＣＭ上都能生长ꎬ且菌丝在ＰＤＡ上生长最快[１７]ꎻ哈茨木霉ＴＨ－１分别在ＰＤＡ㊁ＭＥＡ㊁ＣＤＡ㊁ＢＣＭ上培养均能产孢ꎬ其中ＰＤＡ为最适培养基[１２]ꎮ本试验中ＰＤＡ㊁ＣＤＡ㊁ＯＭＡ㊁ＢＣＭ四种培养基因营养成分丰富ꎬ成为ＳＭＦ２和Ｔ３９菌丝生长及孢子繁殖的适宜培养基ꎬ以ＰＤＡ和ＣＤＡ最佳ꎬ而ＭＥＡ培养基成分单一ꎬ除凝固剂琼脂外ꎬ仅含有麦芽糖ꎬ故两种木霉在其上生长发育不理想ꎮ这与前人研究结果大体一致ꎬ进一步证明木霉菌株对营养环境的广泛适应性ꎮ３.２㊀不同温度对两种菌培养的影响木霉菌是一种嗜温真菌ꎬ棘孢木霉ＰＺ６在１５~３７ħ均能生长ꎬ２５~３７ħ菌丝生长较好ꎬ以３０ħ菌丝生长最快[１６]ꎻ长枝木霉ＨＱ１㊁非洲哈茨木霉ＢＢ１２菌株适宜培养温度为２８~３３ħ[１８]ꎮ本试验中Ｔ３９㊁ＳＭＦ２在２５~３５ħ范围内生长发育良好ꎻ在高温(４０ħ)或低温(２０ħ及以下)环境条件下ꎬ由于没有达到木霉菌生长发育的起点温度或有效积温积累不足ꎬ或者环境温度过高导致菌体内蛋白质㊁核酸等重要组成物质遭受不可逆的破坏ꎬ致使其生长较差ꎮ３.３㊀不同光照对两种菌培养的影响光为木霉菌菌丝生长和孢子形成提供能量ꎮ光照对哈茨木霉ＴＨ－１菌丝生长影响不大但明显影响菌株产孢量ꎬ光照时间越长产孢量越大[１２]ꎻ全黑暗条件有利于长枝木霉ＧＡＡＳＬ３－１－０.８菌丝的营养生长ꎬ而光暗交替条件则对产孢有利[１９]ꎬ即光照可以促进分生孢子产生ꎮ本试验中２６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀Ｔ３９㊁ＳＭＦ２在全光照㊁光暗交替㊁全黑暗３种条件下均可正常生长ꎬ全黑暗条件对菌丝生长更为有利ꎬ而全光照条件对产孢更有利ꎮ这与前人的研究结果相吻合ꎬ且相同光照条件下ꎬ长枝木霉ＳＭＦ２菌丝生长较快ꎬ而哈茨木霉Ｔ３９产孢量更大ꎮ３.４㊀不同ｐＨ值对两种菌培养的影响ｐＨ值不仅通过影响真菌体内的酶活性而影响酶促反应效率ꎬ而且还通过影响膜结构稳定性和细胞质膜的通透性而影响其对营养物质的吸收ꎮ有研究表明ꎬ棘孢木霉ＰＺ６最适生长和产孢的ｐＨ值为５~９[１６]ꎻ哈茨木霉Ｔｈ－８１㊁短密木霉(Ｔ.ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ)Ｔｂ－５０和长枝木霉Ｔ１－７０在ｐＨ值为２~７时均能生长ꎬ最适生长的ｐＨ值为４[２０]ꎮ本试验中ꎬＴ３９㊁ＳＭＦ２对酸碱度的适应性较强㊁范围较广ꎬ在ｐＨ值为４~１１条件下均生长较好ꎬ且中性至弱碱性(ｐＨ值７~９)为ＳＭＦ２培养的最佳酸碱条件ꎬ其菌丝生长㊁产孢最适ｐＨ值分别为９和７ꎻＴ３９培养的最佳酸碱条件为弱酸和偏酸(ｐＨ值４~６)ꎬ其菌丝生长㊁产孢最适ｐＨ值分别为４和６ꎮ３.５㊀不同碳源对两种菌培养的影响碳源物质是真菌生长的碳素来源ꎮ木霉菌对单糖㊁双糖㊁多糖㊁嘌呤㊁嘧啶和氨基酸等的利用效果均较好[２１]ꎮ不同木霉菌其最适碳源有所差异ꎬ长枝木霉ＧＡＡＳＬ３－１－０.８以葡萄糖㊁麦芽糖㊁果糖和乳糖为碳源时ꎬ菌丝生长和产孢较好ꎬ葡萄糖为最适碳源[１９]ꎻ木糖㊁果糖和蔗糖有利于哈茨木霉Ｔ２１的菌丝生长和产孢ꎬ木糖为最适碳源[２２]ꎮ本试验中ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９在无碳源添加的培养基中虽能生长ꎬ但其菌丝质量和产孢量均不理想ꎮ碳源的加入提供了必要的营养物质ꎬ提升其生长发育质量ꎮ微晶纤维素主要成分为以β－１ꎬ４－葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质ꎬ由于自身不易溶解致使碳源的促生作用较差ꎮ单糖(果糖㊁阿拉伯糖)补充热能的效果比双糖㊁多糖更快ꎬ故以果糖和阿拉伯糖为碳源时ＳＭＦ２和Ｔ３９的生长发育最优ꎬ且ＳＭＦ２的菌丝生长优于Ｔ３９ꎬ但Ｔ３９的产孢能力更强ꎬ这可为二者混合使用以防治病害提供理论基础ꎮ３.６㊀不同氮源对两种菌培养的影响氮源是真菌生长的重要氮素来源ꎬ主要用于合成蛋白质等含氮物质ꎬ有助于产孢ꎮ有机氮源像蛋白胨㊁牛肉膏和酵母浸膏等成分复杂㊁营养丰富ꎬ微生物在其培养基中常表现出生长旺盛㊁菌体增长迅速等特点ꎮ有研究表明ꎬ蛋白胨和酵母膏分别为长枝木霉Ｔ０５和ＧＡＡＳＬ３－１－０.８营养生长和产孢的最适氮源[１７ꎬ１９]ꎬ哈茨木霉Ｔ２１在以牛肉膏为氮源的培养基中菌丝生长和产孢最优[２２]ꎮ氨基酸态氮(甘氨酸)存在于土壤蛋白质和多肽类化合物中ꎬ降解后只释放出相应的氨基酸为微生物生长发育提供单一营养ꎻ硝态氮和铵态氮为无机氮源(硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钠)ꎬ易被菌体直接利用ꎬ促进菌体生长ꎬ但与有机氮源相比ꎬ因其成分简单㊁缺乏营养物质㊁利用效率低致使木霉菌菌丝稀薄㊁产孢量较少ꎮ因此ꎬ相比于氨基酸态氮㊁硝态氮和铵态氮ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９在以有机氮(蛋白胨㊁牛肉膏㊁酵母浸膏)为氮源的培养基中生长发育更优ꎬ有机氮源为ＳＭＦ２和Ｔ３９生长发育的适宜氮源ꎬ这与前人的研究结果一致ꎮ且ＳＭＦ２和Ｔ３９对氮源的要求相较于碳源而言更严格ꎮ４㊀结论本研究结果表明ꎬＳＭＦ２和Ｔ３９具有广泛的适应性ꎬ对环境条件要求不严格ꎬ在常温㊁黑暗㊁非强酸强碱㊁含有碳源和有机氮源的条件下ꎬ二者的菌丝生长和孢子形成状况均较为优良ꎮ光照㊁果糖㊁牛肉膏更有利于二者孢子形成ꎻＰＤＡ和ＣＤＡ最适宜产孢ꎻ且二者对氮源的要求相较于碳源而言更严格ꎬ两种木霉在无碳条件下可产孢ꎬ但产孢量较少ꎬ而在无氮条件下孢子肉眼几乎不可见ꎮＳＭＦ２和Ｔ３９在添加碳源培养基中的菌落直径㊁产孢量是无碳源添加的１.０１~１.５９㊁１.６８~４.６３倍ꎬ而在添加有机氮源培养基中的菌落直径㊁产孢量是无氮源添加的１.１１~２.０７㊁１.２５~５７.６４倍ꎮ相同条件下ꎬＳＭＦ２菌丝生长较快ꎬ而哈茨木霉Ｔ３９产孢能力更高ꎮ３５ħ㊁ｐＨ值为７时最利于ＳＭＦ２产孢ꎬ而３０ħ㊁ｐＨ值为６时最利于Ｔ３９产孢ꎮ人工扩繁时ꎬ可通过调节环境温度和培养基酸碱度调控ＳＭＦ２㊁Ｔ３９的产孢情况ꎻ有机氮和单糖更有利于ＳＭＦ２和Ｔ３９菌丝生长和孢子形成ꎮ３６㊀第８期㊀㊀㊀㊀㊀赵晓彤ꎬ等:不同培养条件对长枝木霉ＳＭＦ２和哈茨木霉Ｔ３９生长与产孢的影响参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀王永阳ꎬ杜佳ꎬ高克祥.苦瓜枯萎病生防木霉的筛选鉴定及其定殖的ｑＰＣＲ检测[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１８ꎬ５０(８):１１０－１１５.[２]㊀ＲａｎｉｍｏｌＧꎬＴｈｕｌａｓｉＶꎬＳｈｉｊｉＧꎬｅｔａｌ.ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌａｃｃａｓｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｙｅｄｅｃｏ￣ｌｏｕｒｉｓａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１６:４００－４０４.[３]㊀ＢｏｒｉｓｏｖａＡＳꎬＥｎｅｙｓｋａｙａＥＶꎬＪａｎａＳꎬｅｔａｌ.ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｉｎＧＨ７ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏ￣ｌａｓｅｓｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅꎬＴ.ｒｅｅｓｅｉａｎｄＴ.ｈａｒｚｉａｎｕｍ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＢｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１８ꎬ１１(１):５. [４]㊀邓薇ꎬ张祖衔ꎬ曹宇航ꎬ等.绿色木霉缓解干旱胁迫对玉米幼苗根系生长的影响[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(２):４０－４５. [５]㊀ＢａｇｅｗａｄｉＺＫꎬＭｕｌｌａＳＩꎬＮｉｎｎｅｋａｒＨＺ.ＲｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｂａｓｅｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｉｓｏｌａｔｅＨＺＮ１２ｕｓｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｆｅａｔｈｅｒｗａｓｔｅａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｅｈａｉｒｉｎｇｏｆｈｉｄｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１８ꎬ６(４):４８２８－４８３９.[６]㊀ｄｅＯｌｉｖｅｉｒａＧＳꎬＡｄｒｉａｎｉＰＰꎬＲｉｂｅｉｒｏＪＡꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎｅｐｏｘｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｕｒｅａｏｒａｍｉｄｅ￣ｂａｓｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１９ꎬ１２９:６５３－６５８. [７]㊀李玲ꎬ刘宝军ꎬ杨凯ꎬ等.木霉菌对小麦白粉病的田间防效研究[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２１ꎬ５３(７):９６－１００. [８]㊀ＰｅｒａｚｚｏｌｌｉＭꎬＭｏｒｅｔｔｏＭꎬＦｏｎｔａｎａＰꎬｅｔａｌ.Ｄｏｗｎｙｍｉｌｄｅｗｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＴ３９ｉｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｇｒａｐｅｖｉｎｅｓｐａｒｔｉａｌｌｙｍｉｍｉｃｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１２ꎬ１３(１):６６０. [９]㊀ＨａｒｅｌＹＭꎬＭｅｈａｒｉＺＨꎬＲａｖ￣ＤａｖｉｄＤꎬｅｔａｌ.Ｓｙｓｔｅｍｉｃｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｃｅｔｏｇｒａｙｍｏｌｄｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｍａｔｏｂｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅａｎｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＴ３９[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ１０４(２):１５０－１５７.[１０]商娜.长枝木霉菌对白三叶草病害的防治机理及其对植物生长影响的研究[Ｄ].聊城:聊城大学ꎬ２０２１.[１１]纪明山ꎬ李博强ꎬ许远ꎬ等.绿色木霉ＴＲ－８菌株的生物学特性研究[Ｊ].沈阳农业大学学报ꎬ２００４ꎬ３５(３):１９５－１９９. [１２]李梅云ꎬ谭丽华ꎬ方敦煌ꎬ等.哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究[Ｊ].微生物学通报ꎬ２００６ꎬ３３(６):７９－８３. [１３]王桂清ꎬ曾路ꎬ马迪ꎬ等.我国近１０年植物致病真菌生物学特性研究综述[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１８ꎬ４６(１９):１－５. [１４]ＨｅｗｅｄｙＯＡꎬＡｂｄｅｌ￣ＬａｔｅｉｆＫＳꎬＢａｋｒＲＡ.ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｉｓｏｌａｔｅｓａ￣ｇａｉｎｓｔＦｕｓａｒｉｕｍｗｉｌｔｏｆｐｅｐｐｅｒ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０２０ꎬ６０(２):１２６－１３５.[１５]马迪.国槐溃疡病致病真菌的生物学特性和致病酶活性的研究[Ｄ].聊城:聊城大学ꎬ２０１８.[１６]覃柳燕ꎬ周维ꎬ李朝生ꎬ等.拮抗镰刀菌香蕉枯萎病木霉菌株ＰＺ６分离鉴定及生物学特性研究[Ｊ].中国南方果树ꎬ２０１７ꎬ４６(１):６６－７０.[１７]池玉杰ꎬ伊洪伟ꎬ刘雷.生防长枝木霉菌株Ｔ０５生物学特性[Ｊ].东北林业大学学报ꎬ２０１６ꎬ４(１):１０７－１０９.[１８]李立平ꎬ段德芳.木霉生物学特性及拮抗作用研究进展[Ｊ].植物医生ꎬ２００６ꎬ１９(４):４－６.[１９]郭成ꎬ张小杰ꎬ徐生军ꎬ等.长枝木霉菌株ＧＡＡＳＬ３－１－０.８对玉米形态学指标影响及其生物学特性[Ｊ].玉米科学ꎬ２０１８ꎬ２６(３):１５３－１５９.[２０]马君瑞.３株木霉菌株的分离鉴定及其生防作用研究[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２０１６.[２１]ＮａｇａｒａｊｕＡꎬＳｕｄｉｓｈａＪꎬＭｕｒｔｈｙＳＭꎬｅｔａｌ.ＳｅｅｄｐｒｉｍｉｎｇｗｉｔｈＴｒｉｃｈｏｄｅｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｉｓｏｌａｔｅｓｅｎｈａｎｃｅｓｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎ￣ｄｕｃｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＰｌａｓｍｏｐａｒａｈａｌｓｔｅｄｉｉꎬａｎｉｎｃｉｔａｎｔｏｆｓｕｎｆｌｏｗｅｒｄｏｗｎｙｍｉｌｄｅｗｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ￣ｏｇｙꎬ２０１２ꎬ４１(６):６０９－６２０.[２２]梁松ꎬ魏甜甜ꎬ张静蕾ꎬ等.辣椒枯萎病生防木霉菌Ｔ２１的分离鉴定及其生物学特性研究[Ｊ].天津农业科学ꎬ２０２２ꎬ２８(５):５９－６６.４６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。

link appraisement山东省临沂生态环境监测中心宋保德究分析可知，Mg－4Al－4RE－0.3Si合金经过固溶处理后，原来合金中的Al11RE3相部分发生了相转变，生成块状相的Al2RE相，并且合金中还大量存在着Mg2Si相。

而Mg－4Al－4RE合金经过固溶18h后，合金形貌发生了很大的变化，增强相主要分布在晶界附近，分布在晶界附近的增强相对合金起到较好的增强作用。

Mg－Al－RE－0.3Si和Mg－Al－RE合金通过固溶时效处理后，材料的硬度值发生变化。

经过热处理后，Mg－Al－RE－0.3Si的硬度均高于Mg－Al－RE合金，其中Mg－Al－RE－0.3Si的硬度最高达到83.4，最低为77；Mg－Al－RE合金在固溶6h时效6h硬度为69.6，固溶12h时效10h硬度达到75.2。

偏析相Al2Mg在固溶处理后明显的溶解掉，晶粒经过固溶处理后明显长大，α－Mg基体中溶解了部分（Mg17Al12）相。

通过固溶处理，网状结构开始出现断网现象，直至基本溶解。

依据镁铝合金二元相图可知，固溶处理的结果即合金进入了固液两相区，473℃为β－（Mg17Al12）的存在温度，此温度下保温，晶界开始溶解，也就是第二相会逐渐的向基体中溶解。

添加Si元素后合金硬度值显著提高。

显微组织发生了明显变化，硅元素的加入改变了第二相分布的位置，通过元素的添加，在合金的基体上有第二相的分布，呈现比较均匀分散的状态，同时晶界处共晶相开始消失，并伴随少量的类似针状相形成，相由Al11RE3相转变为Al2RE相，可以达到良好的弥散强化效果，并且合金中还存在Mg2Si相，两种增强相的共同作用提高了合金硬度。

结语（1）Mg-4Al-4RE合金由α-Mg相和Al11RE3组成；Mg-4Al-4RE-0.3Si合金由α-Mg相和Mg2Si相和Al11RE3相组成。

经过热处理的Mg-4Al-4RE合金相转变为α-Mg相和Al2RE相；经过热处理的Mg-4Al-4RE-0.3Si相转变为α-Mg相、Mg2Si相和Al2RE相；（2）Mg－Al－RE－Si合金固溶时间为12h时效时间为6h时其硬度值最佳，硅元素的加入改变了第二相分布的位置，合金的基体上有第二相的分布，呈现比较均匀分散的状态，晶界处共晶相开始消失，少量的类似针状相形成，Al11RE3相转变为Al2RE相，可以达到良好的弥散强化效果，并且合金中还存在Mg2Si相，两种增强相的共同作用提高了合金硬度；（3）合金中加入Si元素使其硬度有所增大，Mg－4Al－4RE－0.3Si合金和Mg－4Al－4RE合金的硬度在时效6h时为最低，在时效10h时硬度最高，使合金硬度最大的最佳的热处理工艺为固溶12h时效10h，硬度最高为83.4HBW、最低为69.0HBW。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(４):１１~２３ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０４.００２收稿日期:２０２２－０７－１９基金项目:山东省农业良种工程项目(２０２０ＬＺＧＣ００２)ꎻ国家自然科学基金项目(３１９０１４２２)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２１Ａ４６)作者简介:陈义珍(１９９０ )ꎬ女ꎬ助理研究员ꎬ主要从事棉花抗衰老及遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｃｈｅｎｙｉｚｈｅｎ０＠１２６.ｃｏｍ通信作者:柳展基(１９７２ )ꎬ男ꎬ研究员ꎬ主要从事棉花遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｓｃｒｃｌｉｕｚｈａｎｊｉ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析陈义珍ꎬ李浩ꎬ傅明川ꎬ王立国ꎬ刘任重ꎬ柳展基(农业部黄淮海棉花遗传改良与栽培生理重点实验室/山东省农业科学院经济作物研究所ꎬ山东济南㊀２５０１００)㊀㊀摘要:膜结合脂肪酸去饱和酶(ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅꎬＦＡＤ)是生物合成不饱和脂肪酸的关键酶ꎮ本研究以陆地棉基因组数据为基础ꎬ利用生物信息学方法对棉花ＦＡＤ基因家族进行全基因组鉴定和进化分析ꎮ结果表明ꎬ陆地棉基因组中共含有３７个ＦＡＤ基因ꎬ进化分析发现这些基因分为４个亚家族ꎬ各亚家族成员数量不一ꎬ但相同亚家族成员含有相似的基因结构和保守基序ꎮ共线性分析发现２８对复制基因全为片段复制基因ꎬ且都经历了严格的纯化选择作用ꎮ此外ꎬ在陆地棉ＦＡＤ基因的启动子区域ꎬ发现了丰富的响应植物激素信号和逆境胁迫的顺式作用元件ꎮ转录组分析表明ꎬ陆地棉ＦＡＤ基因家族响应干旱和盐胁迫ꎬ定量ＰＣＲ分析表明施加外源褪黑素显著影响了ＦＡＤ基因的表达ꎮ本研究结果为进一步解析ＦＡＤ家族基因的功能奠定了基础ꎮ关键词:陆地棉ꎻ膜结合脂肪酸去饱和酶ꎻ全基因组鉴定ꎻ生物信息学分析ꎻ基因表达ꎻ干旱和盐胁迫ꎻ褪黑素中图分类号:Ｓ５６２:Ｑ７８㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０４－００１１－１３Ｇｅｎｏｍｅ￣ＷｉｄｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｅｍｂｒａｎｅ￣ＢｏｕｎｄＦａｔｔｙＡｃｉｄＤｅｓａｔｕｒａｓｅＧｅｎｅＦａｍｉｌｙｉｎＵｐｌａｎｄＣｏｔｔｏｎ(ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ.)ＣｈｅｎＹｉｚｈｅｎꎬＬｉＨａｏꎬＦｕＭｉｎｇｃｈｕａｎꎬＷａｎｇＬｉｇｕｏꎬＬｉｕＲｅｎｚｈｏｎｇꎬＬｉｕＺｈａｎｊｉ(ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｏｔｔｏｎＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＨｕａｎｇ￣Ｈｕａｉ￣ＨａｉＰｌａｉｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ/ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌｃｒｏｐｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ｂｏｕｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｓ(ＦＡＤｓ)ａｒｅｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｆｏｒｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｏｆＦＡＤｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｄａｔａｏｆｕｐｌａｎｄｃｏｔｔｏｎ(ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ.).Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅ３７ＦＡＤｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｕｐｌａｎｄｃｏｔｔｏｎｇｅｎｏｍｅ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｓｅＦＡＤｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓꎬａｎｄｅａｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｕｍｂｅｒｓｏｆＦＡＤｇｅｎｅｓꎬｂｕｔｔｈｅｍｅｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｓｕｂｆａｍｉｌｙｃｏｎｔａｉｎｅｄｓｉｍｉｌａｒｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆｓ.Ｃｏｌｌｉｎｅａｒａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅ２８ｐａｉｒｓｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓｗｅｒｅｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓａｎｄｈａｄｕｎｄｅｒｇｏｎｅｒｉｇｏｒｏｕｓｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬａｂｕｎｄａｎｔｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｓｏｆＦＡＤｇｅｎｅｓ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＦＡＤｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｏｆｕｐｌａｎｄｃｏｔｔｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｄｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｅｘｏｇｅｎｏｕｓｍｅｌａｔｏｎｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅＦＡＤｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｌａｉｄａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＦＡＤｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＵｐｌａｎｄｃｏｔｔｏｎꎻＭｅｍｂｒａｎｅ￣ｂｏｕｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅꎻＧｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＢｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻＤｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻＭｅｌａｔｏｎｉｎ㊀㊀脂肪酸去饱和酶(ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅꎬＦＡＤ)能够在脂肪酸链的特定位置引入双键ꎬ是产生不饱和脂肪酸的关键酶[１ꎬ２]ꎮ植物中的不饱和脂肪酸主要包括油酸㊁亚油酸㊁亚麻酸和花生四烯酸等ꎬ不仅是储藏油脂的重要组分ꎬ还是植物细胞膜脂的主要成分[３]ꎮＦＡＤ包括ＦＡＤ２㊁ＦＡＤ３㊁ＦＡＤ４㊁ＦＡＤ５㊁ＦＡＤ６㊁ＦＡＤ７和ＦＡＤ８ꎬ其中ＦＡＤ２和ＦＡＤ６为ω－６(也称Δ１２)去饱和酶ꎬ能够在油酸脂肪酸链的Δ１２处引入第二个氢键ꎬ催化油酸转变为亚油酸ꎻＦＡＤ３㊁ＦＡＤ７和ＦＡＤ８为ω－３(Δ１５)去饱和酶ꎬ能够在亚油酸脂肪酸链的Δ１５处添加第三个氢键ꎬ进而产生亚麻酸ꎻＦＡＤ４㊁ＦＡＤ５和ＦＡＤ６的催化底物为棕榈酸[４ꎬ５]ꎮ１９９２年ꎬＡｒｏｎｄｅｌ等从拟南芥中图位克隆了ＦＡＤ３基因[６]ꎬ其后ＦＡＤ基因相继在油菜㊁水稻㊁大豆㊁玉米等作物中被分离[７]ꎮ棉花是世界上最重要的天然纤维作物ꎬ同时也是重要的食用油和蛋白来源[８]ꎮ棉仁中油分含量高达３０％~４０％ꎬ棉籽油富含多种不饱和脂肪酸ꎬ其中油酸和亚油酸含量约占８０％ꎮＦＡＤ２是脂肪酸去饱和反应的限速酶ꎬ决定了油脂中油酸和亚油酸的比例和油脂品质ꎬ抑制ＦＡＤ２基因的表达ꎬ能够降低Δ１２－脂肪酸去饱和酶的活性ꎬ致使种子中油酸含量增加ꎮ利用ＴＡＬＥＮｓ技术靶向敲除大豆ＦＡＤ２－１Ａ和ＦＡＤ２－１Ｂ基因ꎬ纯合双基因突变体的油酸含量显著上升ꎬ由２０％提高到８０％ꎬ而亚油酸含量大幅下降ꎬ由５０％降至４％[９ꎬ１０]ꎮＬｉｕ等利用ＲＮＡｉ技术抑制棉花ＦＡＤ２－１基因的表达ꎬ获得的棉花高油酸品系Ｈｉｇｈ－Ｏｌｅ￣ｉｃ和Ｍｏｎｏ－Ｃｏｔｔ的油酸含量分别达到７７％和８１％[１１]ꎮ近年来ꎬ棉花基因组研究进展迅速ꎬ二倍体棉种雷蒙德氏棉(Ｄ５)和亚洲棉(Ａ２)以及四倍体棉种陆地棉(ＡＤ１)和海岛棉(ＡＤ２)的基因组相继被破译[１２－１５]ꎬ为利用生物信息学在全基因组范围内进行重要基因家族的鉴定和分析提供了可能ꎮ目前ꎬ已知拟南芥基因组中含有１７个ＦＡＤ基因ꎬ水稻中有１０个ꎬ油菜中多达８４个[１６]ꎮ在雷蒙德氏棉基因组中ꎬＬｉｕ等鉴定了１９个ＦＡＤ基因[４]ꎮ然而ꎬ陆地棉中ＦＡＤ基因家族的系统分析尚未见报道ꎮ本研究利用最新发布的陆地棉标准系ＴＭ－１的基因组数据[１４]ꎬ对膜结合ＦＡＤ基因家族进行全基因组鉴定ꎬ分析其基因结构㊁染色体定位㊁保守基序㊁基因复制和顺式作用元件ꎬ并分析其在干旱胁迫㊁盐胁迫及施加外源褪黑素下基因的表达模式ꎬ为进一步研究棉花ＦＡＤ基因家族各成员的功能奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试材料供试陆地棉(ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ.)品种为Ｋ８３６ꎬ种子由本实验室保存ꎮ采用１/２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液水培法将棉花幼苗培养至两叶一心ꎮ用１００μｍｏｌ/Ｌ褪黑素进行处理ꎬ分别于处理后０㊁３㊁６㊁１２ｈ对棉花叶片进行取样ꎬ每个样品３次生物学重复ꎬ置于液氮中冻存备用ꎮ１.２㊀陆地棉ＦＡＤ基因鉴定与注释陆地棉标准系ＴＭ－１的基因组序列数据来自于ＣｏｔｔｏｎＦＧＤ数据库[１７](ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｏｔｔｏｎｆｇｄ.ｏｒｇ/)ꎮ利用拟南芥的１７个ＦＡＤ基因的氨基酸序列作为查询序列ꎬ检索棉花基因组蛋白数据库(ＢｌａｓｔｐꎬＥɤｅ－１０)ꎮ同时ꎬ从Ｐｆａｍ数据库(ｈｔｔｐ://ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ/)下载ＦＡＤ蛋白保守结构域ＦＡ＿ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ(ＰＦ００４８７)的隐马尔可夫模型文件ꎬ利用ＨＭＭＥＲ３.０软件搜索陆地棉的蛋白数据库[１８]ꎮ将获得的候选序列提交Ｐｆａｍ和ＳＭＡＲＴ(ｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/)数据库ꎬ确认是否具有ＦＡＤ蛋白保守结构域ꎮ利用ＥｘＰＡＳｙ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ/)分析棉花ＦＡＤ基因家族成员的分子量和等电点[１９]ꎮ利用ＣＥＬＬＯ(ｈｔｔｐ://ｃｅｌｌｏ.ｌｉｆｅ.ｎｃｔｕ.ｅｄｕ.ｔｗ/)对棉花ＦＡＤ基因家族成员进行亚细胞定位预测[２０]ꎮ１.３㊀陆地棉ＦＡＤ的系统进化和染色体定位分析利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件对拟南芥和陆地棉ＦＡＤ蛋白序列进行多重序列比对ꎬ利用ＭＥＧＡ－Ｘ软件中的邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)构建系统进化树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ值设置为１０００[２１]ꎮ根据陆地棉基因组提供的基因注释信息ꎬ获得ＦＡＤ基因在各染色体上的位置ꎬ利用ＭａｐＣｈａｒｔ２.３２软件绘制其染色体分布图[２２]ꎮ２１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀１.４㊀陆地棉ＦＡＤ基因结构、保守基序和上游顺式作用元件分析首先从棉花基因组注释文件(ｇｆｆ文件)获得ＦＡＤ基因的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ信息ꎬ利用ＧＳＤＳ２.０软件(ｈｔｔｐ://ｇｓｄｓ.ｃｂｉ.ｐｋｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/)绘制棉花ＦＡＤ基因家族成员的基因结构图[２３]ꎻ利用在线软件ＭＥＭＥ(ｈｔｔｐ://ｍｅｍｅ－ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/ｍｅｍｅ)分析ＦＡＤ蛋白的保守基序[２４]ꎬ基序数值设定为１０ꎮ利用陆地棉基因组数据ꎬ提取ＦＡＤ基因转录起始位点上游１５００ｂｐ序列ꎬ在ＰｌａｎｔＣＡＲＥ数据库(ｈｔｔｐ://ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ/ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ｐｌａｎｔｃａｒｅ/ｈｔｍｌ/)中检索ꎬ鉴定上游启动子区域可能存在的顺式作用元件[２５]ꎮ１.５㊀陆地棉ＦＡＤ基因复制分析利用ＭＣＳｃａｎＸ软件分析陆地棉基因组内的同源基因[２６]ꎬ如比对上的序列长度超过长序列长度的７５％且序列的相似性超过７５％ꎬ则认为此同源基因为复制基因ꎬ并利用可视化工具Ｃｉｒｃｏｓ(ｈｔ￣ｔｐ://ｃｉｒｃｏｓ.ｃａ/)展示复制的同源关系[２７ꎬ２８]ꎮ采用ＫａＫｓ＿Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ２.０计算复制基因的Ｋａ(非同义替换率)和Ｋｓ(同义替换率)值ꎬ通过Ｋａ/Ｋｓ值分析环境选择压力[２９]ꎮ１.６㊀ＲＮＡ－ｓｅｑ分析利用前期试验得到的陆地棉干旱(ＰＥＧ)和盐胁迫(ＮａＣｌ)处理３㊁６㊁１２㊁２４ｈ后的转录组数据(未发表)ꎬ筛选得到ＦＡＤ基因表达量数据ꎮ利用ＦＰＫＭ(ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｍｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ)对原始表达数据进行标准化处理ꎬ并利用ＴＢｔｏｏｌｓ软件绘制表达量热图ꎮ以ｌｏｇ２(ＦＣ)绝对值大于１为差异基因的筛选标准ꎮ１.７㊀基因表达分析采用北京艾德莱生物科技(Ａｉｄｌａｂ)有限公司植物ＲＮＡ快速提取试剂盒(ＲＮ３８０２)提取叶片总ＲＮＡꎬ分别取１μｇ总ＲＮＡ进行反转录ꎬ反应体系和操作程序参照ＴＲＵＥｓｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｏｎ￣ｅＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌ)一步法基因组清除反转录试剂盒(ＰＣ７０)说明ꎮ将反转录产物稀释１０倍ꎬ选择Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ(ＧｅｎＢａｎｋＮｏ.ＡＹ１８９９７２)基因作为内参基因ꎬ进行定量ＲＴ－ＰＣＲꎬ所用引物见表１ꎬ由北京六合华大基因科技有限公司合成ꎮ选用㊀㊀表１㊀定量ＰＣＲ引物序列序号基因正向引物(５ᶄ－３ᶄ)反向引物(３ᶄ－５ᶄ)１ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８０ＧＧＧＡＧＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＧＴＴＡＴ２ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８２ＧＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＡＣＣＣＡＡＡＣＧＣＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣ３ＧＨ＿Ａ０４Ｇ１１１１ＡＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＧＴＣＧＧＧＡＣＡＡ４ＧＨ＿Ａ０５Ｇ０４２４ＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＣＣ５ＧＨ＿Ａ０５Ｇ１２４８ＡＡＡＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴ６ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１１４４ＣＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＴＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧ７ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１５２２ＡＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧ８ＧＨ＿Ａ０９Ｇ１０７６ＧＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣ９ＧＨ＿Ａ１０Ｇ２６２９ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＧＴＡＡＧＣ１０ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８ＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡ１１ＧＨ＿Ａ１１Ｇ３５８８ＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣ１２ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８ＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＡＴＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ１３ＧＨ＿Ａ１３Ｇ０６７８ＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＡＴＴＡＣＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧ１４ＧＨ＿Ａ１３Ｇ２１２６ＴＡＴＡＧＧＣＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＡＣＣＧＣ１５ＧＨ＿Ｄ０１Ｇ１４６４ＧＣＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡ１６ＧＨ＿Ｄ０４Ｇ１４５４ＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＧＴＴＧＴＣＴＧＡＧＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＡＡＣＣＡＣＴＣＴＴ１７ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ０４２６ＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡ１８ＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４ＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴ１９ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１１２５ＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡ２０ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１５２６ＧＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴ２１ＧＨ＿Ｄ０８Ｇ２８１１ＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧ２２ＧＨ＿Ｄ０９Ｇ１０２８ＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧ２３ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ２７３４ＧＡＡＧＣＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＣＡ２４ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９ＡＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡ２５ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ３６０８ＴＧＣＡＡＣＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧＴ２６ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＧＡＣＡＣＴＣ３１㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析Ａｉｄｌａｂ公司的２ˑＳｙｂｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭｉｘ试剂盒ꎬ反应体系为２０μＬ:２ˑＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ１０μＬꎬ基因特异性上下游引物各０.４μＬ(１０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ模板ｃＤＮＡ０.８μＬꎬ补ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬꎮ使用Ｔｈｅｒ￣ｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５荧光定量ＰＣＲ仪ꎬ反应程序:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９５ħ１５ｓꎬ６０ħ１５ｓꎬ４０个循环ꎻ熔点曲线程序为９５ħ１５ｓꎬ６０ħ１ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎮ每个样品进行３次重复试验ꎬ采用２－әәＣｔ法计算基因的表达量ꎮ利用Ｇｒａｐｈｐａｄ进行差异显著性分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族成员的鉴定在陆地棉基因组中共鉴定出３７个ＦＡＤ基因(表２)ꎬ均含有保守的ＦＡ＿ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ结构域(ＰＦ００４８７)ꎮＦＡＤ蛋白的氨基酸序列长度差异较大ꎬＧＨ＿Ａ１３Ｇ０６７８最短ꎬ为３０８个氨基酸ꎬ而ＧＨ＿Ａ１０Ｇ２６２９和ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ２７３４最长ꎬ均为４５０个氨基酸ꎻＧＨ＿Ａ１３Ｇ０６７８的分子量最小ꎬ为３５.４１ｋＤａꎬＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８的分子量最大ꎬ为５１.８７ｋＤａꎻＦＡＤ蛋白的等电点差异较大ꎬＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４的等电点最小ꎬ为６.９５ꎬ其余ＦＡＤ蛋白的等电点均在７.２９及以上ꎬ为碱性ꎬ以ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ１２４５的等电点最大(９.３７)ꎮ大多数ＦＡＤ蛋白定位在内质网和质膜上ꎬ少数ＦＡＤ蛋白位于叶绿体中ꎬ仅ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４位于溶酶体中(表２)ꎮ㊀㊀表２㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族基本信息基因染色体定位亚家族外显子数量氨基酸序列长度分子量(ｋＤａ)等电点亚细胞定位ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８０Ａ０１:５２４３７２５８－５２４３８４０９Ｏｍｅｇａ１３８３４４.３７８.９７内质网ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８２Ａ０１:５２７９３６７６－５２７９４８２７Ｏｍｅｇａ１３８３４４.３７９.０６内质网ＧＨ＿Ａ０１Ｇ２４５３Ａ０１:１１７６６１８８５－１１７６６４８７９Ｏｍｅｇａ８４２７４９.５３８.１７叶绿体ＧＨ＿Ａ０４Ｇ１１１１Ａ０４:７６６７９８５５－７６６８１８５７Ｏｍｅｇａ８４４６５０.９６８.４７叶绿体ＧＨ＿Ａ０５Ｇ０４２４Ａ０５:３９３２２８４－３９３３６２７Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.１６８.４３质膜ＧＨ＿Ａ０５Ｇ１２４８Ａ０５:１１３４２４６８－１１３４４４５３Ｆｉｒｓｔ５４０５４６.２８９.２６质膜ＧＨ＿Ａ０６Ｇ１４３５Ａ０６:８９１４６２６４－８９１４７９５２Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ２３３０３８.４０７.２９质膜ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１１４４Ａ０７:１８０１４５７９－１８０１６２８０Ｏｍｅｇａ８３７６４３.５０８.８４内质网ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１５２２Ａ０７:３０４３２５１２－３０４３３８５５Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.１８８.３６质膜ＧＨ＿Ａ０８Ｇ２８１８Ａ０８:１２４５７７５２８－１２４５７８８７１Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.２０８.６４质膜ＧＨ＿Ａ０９Ｇ１０７６Ａ０９:６２９５７８６６－６２９５９６１４Ｏｍｅｇａ８３８８４５.０３９.０５内质网ＧＨ＿Ａ１０Ｇ０２６０Ａ１０:２１４７３９０－２１４９４４９Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ２３３１３８.６２８.８２质膜ＧＨ＿Ａ１０Ｇ２６２９Ａ１０:１１４４１１６７３－１１４４１４２８８Ｏｍｅｇａ８４５０５１.１９８.９１叶绿体ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８Ａ１１:８７６４８４０－８７６６１８３Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.３８８.９４质膜ＧＨ＿Ａ１１Ｇ３５８８Ａ１１:１１９６８０９８０－１１９６８２１３４Ｏｍｅｇａ１３８４４４.２５８.９６内质网ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８Ａ１２:８０８７２６８０－８０８７５０３４Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ２４４９５１.８７７.９８质膜ＧＨ＿Ａ１３Ｇ０６７８Ａ１３:１４２５３４３３－１４２５５０５６Ｏｍｅｇａ８３０８３５.４１８.６９质膜ＧＨ＿Ａ１３Ｇ２１２６Ａ１３:１０５０４５５７０－１０５０４９３８６Ｏｍｅｇａ１０４４５５１.５９９.０９叶绿体ＧＨ＿Ａ１３Ｇ２４２３Ａ１３:１０８６０９３７６－１０８６１０５３３Ｏｍｅｇａ１３８５４４.０６９.０９内质网ＧＨ＿Ｄ０１Ｇ１４６３Ｄ０１:３０７８３１６４－３０７８４３１５Ｏｍｅｇａ１３８３４４.２８８.９４内质网ＧＨ＿Ｄ０１Ｇ１４６４Ｄ０１:３０８２４７５１－３０８２５９０２Ｏｍｅｇａ１３８３４４.１８９.０４内质网ＧＨ＿Ｄ０１Ｇ２５２９Ｄ０１:６４２４５４０６－６４２４８４０８Ｏｍｅｇａ８４３５５０.４０７.４２叶绿体ＧＨ＿Ｄ０４Ｇ１４５４Ｄ０４:４７８３２９２０－４７８３４９１９Ｏｍｅｇａ８４４６５０.７２８.５２叶绿体ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ０４２６Ｄ０５:３４１９７９０－３４２１１３３Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.２０８.６８质膜ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ１２４５Ｄ０６:１０３２７２０４－１０３２９１４２Ｆｉｒｓｔ５３８６４４.２４９.３７质膜ＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４Ｄ０７:４４７７４８９２－４４７７６５６２Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ２３３０３８.３５６.９５质膜ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１１２５Ｄ０７:１４０２９８６６－１４０３１５６８Ｏｍｅｇａ８３７６４３.５６８.８３内质网ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１５２６Ｄ０７:２２７３７９９０－２２７３９３３３Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.１９８.５５质膜ＧＨ＿Ｄ０８Ｇ２８１１Ｄ０８:６８６０４５７０－６８６０５９１３Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.２７８.６１质膜ＧＨ＿Ｄ０９Ｇ１０２８Ｄ０９:３５４９７４５４－３５４９９２１６Ｏｍｅｇａ８３８８４５.１１９.０５内质网ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ０２７３Ｄ１０:２１５７５１５－２１５９４７４Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ２３２３３７.７９７.３０质膜ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ２７３４Ｄ１０:６６２６０６１４－６６２６３２９５Ｏｍｅｇａ８４５０５１.１５８.９１叶绿体ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９Ｄ１１:８２８８９８２－８２９０３２５Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ１４４７５１.３７８.９４质膜４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀㊀㊀表２(续)基因染色体定位亚家族外显子数量氨基酸序列长度分子量(ｋＤａ)等电点亚细胞定位ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ３６０８Ｄ１１:６９７１５４６１－６９７１６６１５Ｏｍｅｇａ１３８４４４.２７９.０４内质网ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４Ｄ１２:３９９３３６１９－３９９３５９６０Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ３３９５４５.１３７.３０溶酶体ＧＨ＿Ｄ１３Ｇ２１０７Ｄ１３:５９０１５８２１－５９０１９６２６Ｏｍｅｇａ１０４４２５１.３２９.１７叶绿体ＧＨ＿Ｄ１３Ｇ２４１４Ｄ１３:６２４５６４５４－６２４５７６０５Ｏｍｅｇａ１３８３４３.８９８.９５内质网２.２㊀陆地棉ＦＡＤ基因的系统进化和染色体定位分析为了研究陆地棉ＦＡＤ基因家族成员之间的进化关系ꎬ我们利用陆地棉和拟南芥ＦＡＤ蛋白序列构建了系统进化树ꎮ按照亲缘关系的远近ꎬ将陆地棉ＦＡＤ基因家族分为４个亚家族ꎬ分别为Ｆｉｒｓｔ㊁Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ㊁Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ和Ｏｍｅｇａ亚家族(图１)ꎮ４个亚家族中的ＦＡＤ成员数量差异较大ꎬ其中ꎬＦｉｒｓｔ亚家族中陆地棉ＦＡＤ成员最少ꎬ仅有２个ꎬ而拟南芥ＦＡＤ成员多达９个ꎻＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族中仅含有１个拟南芥ＦＡＤ成员ꎬ却含有４个陆地棉成员ꎻＦｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族中陆地棉和拟南芥的ＦＡＤ成员分别为１０个和２个ꎻＯｍｅｇａ亚家族中陆地棉ＦＡＤ成员数量最多ꎬ为２１个ꎬ拟南芥ＦＡＤ成员为５个ꎮ图１㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族的系统进化树５１㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析㊀㊀根据陆地棉标准系ＴＭ－１的基因组注释信息ꎬ将３７个ＦＡＤ基因定位在２２条染色体上ꎬ其中Ａ０１㊁Ａ１３和Ｄ０１染色体上分别含有３个ＦＡＤ基因ꎻＡ０５㊁Ａ０７㊁Ａ１０㊁Ａ１１㊁Ｄ０５㊁Ｄ０７㊁Ｄ１０㊁Ｄ１１和Ｄ１３染色体上分别含有２个ＦＡＤ基因ꎻ其余１０条染色体上分别含有１个ＦＡＤ基因(图２)ꎮ图２㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族的染色体分布２.３㊀陆地棉ＦＡＤ基因结构和保守基序分析陆地棉ＦＡＤ基因４个亚家族呈现不同的结构特征(图３)ꎮＦｉｒｓｔ亚家族的ＦＡＤ成员具有相同的基因结构ꎬ均含有５个外显子ꎻＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族的ＦＡＤ基因亦具有相同的基因结构ꎬ均含有２个外显子ꎻＦｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族的基因结构也比较保守ꎬ１０个ＦＡＤ成员中ꎬ８个ＦＡＤ基因含有１个外显子ꎬ其余２个ＦＡＤ成员含有２个或３个外显子ꎻＯｍｅｇａ亚家族的基因结构存在３种方式ꎬ１１个ＦＡＤ成员含有８个外显子ꎬ２个成员含有１０个外显子ꎬ剩余的８个成员含有１个外显子ꎮ利用ＭＥＭＥ分析陆地棉ＦＡＤ蛋白的保守基序ꎬ共发现３个保守组氨酸基序(Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ１㊁Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ２和Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ３)ꎬ但不同亚家族成员的组氨酸基序的序列不同(图４)ꎮＯｍｅｇａ亚家族的Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ１为Ｈ[Ｄ/Ｅ]Ｃ[Ｇ/Ａ]ＨꎬＨｉｓ￣ｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ２为Ｈ[Ｒ/Ｄ][Ｒ/Ｔ/Ｉ]ＨＨꎬＨｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ３为Ｈ[Ｖ/Ｉ][Ｉ/Ａ/Ｐ]ＨＨꎬ尽管中间的氨基酸残基不同ꎬ但两侧均为保守的组氨酸残基ꎮＦｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族的Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ１和Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ２序列十分保守ꎻＨｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ３为Ｑ[Ｌ/Ｉ/Ｖ]ＥＨＨꎬ其起始氨基酸为谷酰胺ꎮＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族成员的３个组氨酸基序都十分保守ꎬ且基序两侧皆为保守的组氨酸ꎮＦｉｒｓｔ亚家族Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ３为典型的组氨酸基序ꎬＨｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ１的最后一个氨基酸残基为亮氨酸ꎬ而Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｂｏｘ２不具有典型的组氨酸基序特征ꎮ２.４㊀陆地棉ＦＡＤ基因复制分析基因复制在基因家族扩张过程中发挥重要作用ꎮ利用ＭＣＳｃａｎＸ对陆地棉基因组中的基因复制事件进行分析ꎬ发现ＦＡＤ基因家族共存在２８对片段复制基因ꎬ无串联复制基因ꎮ其中ꎬ２１对基因复制发生在Ａ和Ｄ亚基因组之间ꎬ４对发生在Ａ亚基因组之内ꎬ剩余３对发生在Ｄ亚基因组之内(图５)ꎬ表明片段复制是棉花ＦＡＤ基因家族扩张的主要方式ꎮ随后ꎬ利用ＫａＫｓ＿Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ分析复制基因的Ｋａ/Ｋｓ值ꎬ结果显示所有复制基因的Ｋａ/Ｋｓ值均小于０.５５(表３)ꎮ６１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀陆地棉ＦＡＤ基因结构分析图４㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族的３个保守组氨酸富集区７１㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析图５㊀陆地棉ＦＡＤ基因家族的共线性分析㊀㊀表３㊀陆地棉ＦＡＤ家族基因的复制分析复制基因对ＫａＫｓＫａ/Ｋｓ复制类型ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８０:ＧＨ＿Ｄ０１Ｇ１４６３０.００９０.０２２０.４１３片段复制ＧＨ＿Ａ０４Ｇ１１１１:ＧＨ＿Ｄ０４Ｇ１４５４０.０１１０.０５６０.１９９片段复制ＧＨ＿Ａ０５Ｇ０４２４:ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ０４２６０.００９０.０３１０.２７７片段复制ＧＨ＿Ａ０５Ｇ１２４８:ＧＨ＿Ｄ０５Ｇ１２４５０.０１００.０２００.５１７片段复制ＧＨ＿Ａ０６Ｇ１４３５:ＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４０.００８０.０４００.２１４片段复制ＧＨ＿Ａ０６Ｇ１４３５:ＧＨ＿Ａ１０Ｇ０２６００.０７１０.６３００.１１３片段复制ＧＨ＿Ａ０６Ｇ１４３５:ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ０２７３０.０７１０.６６４０.１０６片段复制ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１１４４:ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１１２５０.０１００.０３２０.３２２片段复制ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１１４４:ＧＨ＿Ａ０９Ｇ１０７６０.１５５０.７１００.２１８片段复制ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１１４４:ＧＨ＿Ｄ０９Ｇ１０２８０.１５５０.７４３０.２０８片段复制ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１５２２:ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１５２６０.００１０.０３７０.０２６片段复制ＧＨ＿Ａ０７Ｇ１５２２:ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８０.１６５２.１８２０.０７６片段复制ＧＨ＿Ａ０９Ｇ１０７６:ＧＨ＿Ｄ０９Ｇ１０２８０.００２０.０２４０.０９３片段复制ＧＨ＿Ａ０９Ｇ１０７６:ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１１２５０.１４５０.７５６０.１９２片段复制ＧＨ＿Ａ１０Ｇ０２６０:ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ０２７３０.００４０.０５８０.０６９片段复制ＧＨ＿Ａ１０Ｇ２６２９:ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ２７３４０.００６０.０５８０.１００片段复制ＧＨ＿Ａ１０Ｇ０２６０:ＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４０.０７５０.６７００.１１１片段复制ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８:ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８０.１３６１.９４９０.０７０片段复制ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８:ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１５２６０.０９３０.８２９０.１１２片段复制８１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀㊀㊀表３(续)复制基因对ＫａＫｓＫａ/Ｋｓ复制类型ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８:ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９０.００５０.０２００.２３７片段复制ＧＨ＿Ａ１１Ｇ０９６８:ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４０.１４２１.８９１０.０７５片段复制ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８:ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１５２６０.１６７１.９６７０.０８５片段复制ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８:ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９０.１３９１.９０００.０７３片段复制ＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８:ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４０.０１６０.０８４０.１９４片段复制ＧＨ＿Ａ１３Ｇ２１２６:ＧＨ＿Ｄ１３Ｇ２１０７０.００３０.０３１０.０９２片段复制ＧＨ＿Ｄ０６Ｇ１４７４:ＧＨ＿Ｄ１０Ｇ０２７３０.０７３０.７０５０.１０３片段复制ＧＨ＿Ｄ０７Ｇ１１２５:ＧＨ＿Ｄ０９Ｇ１０２８０.１４５０.７９２０.１８４片段复制ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９:ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４０.１４５１.８８５０.０７７片段复制２.５㊀陆地棉ＦＡＤ基因上游顺式作用元件分析利用陆地棉ＦＡＤ基因转录起始位点上游１５００ｂｐ序列分析顺式作用元件ꎬ结果发现棉花ＦＡＤ基因的上游序列除了存在启动子核心元件ＴＡＴＡ－ｂｏｘ和ＣＡＡＴ－ｂｏｘ外ꎬ还存在许多激素和逆境胁迫响应元件(图６)ꎮ其中ꎬ植物激素响应元件有９种ꎬ分别是ＡＢＲＥ㊁ＡｕｘＲＥ㊁ＣＧＴＣＡ－ｍｏ￣ｔｉｆ㊁ＴＧＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ㊁ＥＲＥ㊁ＧＡＲＥ－ｍｏｔｉｆ㊁Ｐ－ｂｏｘ㊁ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ和ＴＧＡＣＧ－ｍｏｔｉｆꎻＡＢＲＥ㊁ＥＲＥ和ＴＣＡ－ｅｌｅ￣ｍｅｎｔ分别响应脱落酸㊁乙烯和水杨酸ꎬＴＧＡＣＧ－ｍｏｔｉｆ和ＣＧＴＣＡ－ｍｏｔｉｆ为茉莉酸甲酯响应元件ꎬＡｕｘＲＥ和ＴＧＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ为生长素响应元件ꎬＧＡＲＥ－ｍｏｔｉｆ和Ｐ－ｂｏｘ为赤霉素响应元件ꎮ逆境胁迫响应元件有６种ꎬ包括ＡＲＥ㊁ＤＲＥ㊁ＬＴＲ㊁ＭＢＳ㊁ＷＵＮ－ｍｏｔｉｆ和ＴＣ－ｒｉｃｈꎬ分别是缺氧胁迫㊁冷害㊁低温㊁干旱㊁损伤和防御响应元件ꎮ图６㊀陆地棉ＦＡＤ基因启动子区域顺式作用元件示意图９１㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析２.６㊀陆地棉ＦＡＤ家族基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达特征为明确ＦＡＤ基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式ꎬ基于转录组数据对３７个ＦＡＤ基因在两种胁迫处理不同时间点陆地棉叶片中的表达量进行聚类分析ꎬ结果如图７所示ꎮ图中ｌｏｇ２(ＦＣ)代表ｌｏｇ２(ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ)ꎻＮａＣｌ－３ｈ㊁ＮａＣｌ－６ｈ㊁ＮａＣｌ－１２ｈ㊁ＮａＣｌ－２４ｈ分别代表盐处理３㊁６㊁１２㊁２４ｈ后的样品ꎻＰＥＧ－３ｈ㊁ＰＥＧ－６ｈ㊁ＰＥＧ－１２ｈ㊁ＰＥＧ－２４ｈ分别代表干旱处理３㊁６㊁１２㊁２４ｈ后的样品ꎮ图７㊀陆地棉３７个ＦＡＤ基因在盐胁迫和㊀㊀㊀干旱胁迫下的表达分析㊀㊀盐胁迫下ꎬ３７个ＦＡＤ基因呈现不同的表达模式ꎬ其中有２８个ＦＡＤ基因在不同处理时间均有表达ꎬ７个ＦＡＤ基因未检测到表达信号ꎬ而ＧＨ＿Ａ０６Ｇ１４３５基因仅在处理后６ｈ检测到表达量增加ꎬＧＨ＿Ｄ０１Ｇ２５２９仅在处理后２４ｈ检测到表达量增加ꎮ另外ꎬ２８个ＦＡＤ基因呈现不同的表达模式ꎬ１７个ＦＡＤ基因表达量降低ꎬ７个ＦＡＤ基因表达量增加[ｌｏｇ２(ＦＣ)>１]ꎬ４个基因的表达量先增后降ꎬ２个基因的表达量先降后增(ＧＨ＿Ｄ０８Ｇ２８１１和ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９)ꎮ干旱胁迫下ꎬ３７个ＦＡＤ基因中有２７个在不同处理时间均有表达ꎬ有６个未检测到表达量变化ꎬ有４个仅在两个处理时间点下表达量增加ꎮ另外ꎬ２７个ＦＡＤ基因中仅ＧＨ＿Ｄ０４Ｇ１４５４表达量增加ꎬ１７个基因在干旱胁迫下表达量降低ꎬ９个基因仅在一个或两个处理时间(６ｈ或１２ｈ)点下表达量增加ꎬ其他时间点的表达量降低ꎮ褪黑素作为一种重要的多效性抗氧化分子ꎬ能帮助植物抵御不利环境的危害ꎬ而且外源褪黑素能显著缓解逆境胁迫引起的伤害[３０ꎬ３１]ꎮ因此ꎬ本研究基于干旱胁迫和盐胁迫下ＦＡＤ基因的转录组结果ꎬ选出２５个ＦＡＤ基因(包括Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族的８个ꎬＯｍｅｇａ亚家族的１５个ꎬＦｉｒｓｔ亚家族的１个ꎬＳｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族的１个)ꎬ通过在棉花苗期施加外源褪黑素ꎬ进一步探究ＦＡＤ基因在外源褪黑素下的表达特征ꎮ定量分析结果显示ꎬ在褪黑素处理后ꎬ１个ＦＡＤ基因(ＧＨ＿Ａ０１Ｇ１３８０)未检测到表达量的变化ꎬ另外２４个ＦＡＤ基因与对照相比ꎬ有７个基因表达量增加ꎬ１７个基因表达量降低ꎬ且上调表达的ＦＡＤ基因均在处理后６ｈ表达量增加最多ꎮＦｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族８个ＦＡＤ基因中有６个基因在褪黑素处理后表达量增加ꎬ２个基因表达量降低ꎻＯｍｅｇａ亚家族表达的１４个ＦＡＤ基因中仅有１个在处理后表达量增加ꎬ其他基因都呈现表达量降低趋势ꎻＦｉｒｓｔ㊁Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族的各１个基因则均在处理后表现为表达量降低(图８)ꎮ３㊀讨论与结论植物脂肪酸作为储藏油脂和细胞膜脂的重要组分ꎬ既为植物的生长发育提供能量ꎬ也在响应多种逆境胁迫中发挥重要作用[３]ꎮＦＡＤ是植物脂肪酸进一步去饱和反应中的关键酶ꎬ目前已在拟南芥㊁水稻㊁花生㊁大豆和油菜等物种中相继完成了全基因组水平上的鉴定和分析[１６]ꎮ本研究从陆地棉基因组中鉴定出３７个ＦＡＤ基因ꎬ而二倍体雷蒙德氏棉仅含有１９个ＦＡＤ成员[４]ꎬ是其１.９５倍ꎬ造成这种差异的原因可能是棉花进化过程中的异源多倍化现象ꎮ棉属植物进化分析表明ꎬ在１７０万~１９０万年前ꎬ陆地棉由Ａ基因组供体亚洲棉和Ｄ基因组供体雷蒙德氏棉种间杂交加倍而成[１４]ꎮ另外ꎬ陆地棉ＦＡＤ基因数量远多于模式植物拟南芥和水稻ꎬ分别是其２.１８倍和３.７０倍ꎮ０２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀柱上∗㊁∗∗分别表示同一基因在不同处理时间与处理０ｈ相比差异显著(Ｐ<０.０５)㊁极显著(Ｐ<０.０１)ꎮ图８㊀陆地棉２４个ＦＡＤ基因在褪黑素处理不同时间后的表达分析㊀㊀进化分析将陆地棉和拟南芥的ＦＡＤ基因分为４个亚家族ꎬ且每个物种的ＦＡＤ基因在４个亚家族中均有分布ꎬ表明ＦＡＤ基因的分化可能早于棉花和拟南芥的物种分化ꎮ除了Ｆｉｒｓｔ亚家族ꎬ其他３个亚家族中陆地棉ＦＡＤ基因的数量远多于拟南芥ꎬ预示Ｏｍｅｇａ㊁Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ和Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ亚家族中的陆地棉ＦＡＤ基因可能在进化过程中发生了物种特异性扩张ꎮ这一结果与之前二倍体雷蒙德氏棉中的报道一致[４]ꎮ基因复制是植物进化的主要动力ꎬ主要包括１２㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析串联复制㊁片段复制和全基因组复制[２８]ꎮ本研究在陆地棉ＦＡＤ基因家族中发现了２８对复制基因ꎬ来源于４个亚家族ꎬ且全为片段复制ꎬ表明在陆地棉进化过程中ＦＡＤ基因由于片段复制发生了基因家族扩张ꎮＫａ/Ｋｓ值常用来检验同源基因是否经历了选择作用ꎬＫａ/Ｋｓ>１ꎬ认为有正选择作用ꎻＫａ/Ｋｓ<１ꎬ为纯化或负选择作用ꎻＫａ/Ｋｓ＝１ꎬ则认为存在中性选择作用ꎮ本研究中所有复制基因的Ｋａ/Ｋｓ值均小于１ꎬ表明陆地棉ＦＡＤ基因在进化过程中经历了纯化选择作用ꎮ顺式作用元件分析发现ꎬ陆地棉ＦＡＤ基因的启动子区含有植物激素和逆境胁迫响应元件ꎬ预示其可能在激素信号响应和防御逆境胁迫中起作用ꎮ目前ꎬ已知雷蒙德氏棉中有７个ＦＡＤ基因受低温诱导表达ꎬ５个ＦＡＤ基因受低温抑制表达[４]ꎮ部分ＦＡＤ基因呈现组织特异性表达ꎬ如ＦＡＤ２－１在发育的种子中特异表达[３２]ꎬＦＡＤ２－２和ＦＡＤ２－３在种子发育过程中组成型表达ꎬ在叶片中少量表达[３３]ꎮ植物中位于质膜上的脂肪酸大部分是不饱和脂肪酸ꎬ而植物对环境胁迫的抗性与质膜上脂肪酸的不饱和程度密切相关ꎬ膜结合基因对维持植株在多种胁迫下的正常生长起着非常重要的作用ꎮ在拟南芥中ꎬＦＡＤ２和ＦＡＤ６是提高幼苗早期生长耐盐性的重要基因[３４ꎬ３５]ꎬＦＡＤ７基因的反义表达则降低了对盐胁迫和干旱胁迫的耐性[３６]ꎮ在番茄中超表达ＬｅＦＡＤ３基因增强幼苗早期生长的耐盐性[３７]ꎮ为探究陆地棉ＦＡＤ基因在逆境胁迫下的表达模式ꎬ利用盐胁迫和干旱胁迫的转录组数据对陆地棉３７个ＦＡＤ基因进行分析ꎬ发现７０％以上的ＦＡＤ基因对两种胁迫均有应答ꎬ其中下调表达的ＦＡＤ基因分别占５４％和６３％ꎮ值得注意的是ꎬ本研究Ｆｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族包含的１０个基因中除了亚细胞定位预测在溶酶体的ＧＨ＿Ｄ１２Ｇ１２７４基因外ꎬ其余９个基因全部定位于质膜ꎬ干旱胁迫后７个基因都是下调表达ꎬＧＨ＿Ａ１２Ｇ１２５８和ＧＨ＿Ｄ１１Ｇ０９９９基因也仅在６ｈ或２４ｈ表达量增加ꎬ说明干旱胁迫可能会抑制质膜上ＦＡＤ基因的表达ꎮ褪黑素在植物非生物胁迫防御系统中发挥重要作用ꎬ且几乎所有非生物胁迫引起的过氧化伤害都能被褪黑素缓解ꎮ褪黑素提高植物对环境胁迫抗性机制主要是通过提高抗氧化物质含量和抗氧化酶活性ꎬ改善光合系统ꎬ调控激素合成和代谢ꎬ调控植物细胞中初级和次级代谢ꎬ刺激细胞合成更多的保护物质等方式[３８]ꎮ通过定量ＰＣＲꎬ进一步分析了２５个ＦＡＤ基因在施加外源褪黑素后的表达特征ꎬ发现１７个基因下调表达ꎬ７个基因上调表达ꎬ１个基因没有表达变化ꎮ值得注意的是ꎬＦｒｏｎｔ－ｅｎｄ亚家族中的５个基因在干旱胁迫后下调表达而在褪黑素处理后上调表达ꎬ且在处理后６ｈ表达量显著增加ꎬ它们可作为候选基因用于后续基因功能的进一步探究ꎮ本研究结果可为进一步揭示陆地棉ＦＡＤ基因逆境响应机理提供参考ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀戴晓峰ꎬ肖玲ꎬ武玉花ꎬ等.植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展[Ｊ].植物学通报ꎬ２００７ꎬ２４(１):１０５－１１３. [２]㊀阮建ꎬ单雷ꎬ李新国ꎬ等.花生ＦＡＤ基因家族的全基因组鉴定与表达模式分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１８ꎬ５０(６):１－９. [３]㊀曹福亮ꎬ王欢利ꎬ郁万文ꎬ等.高等植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展[Ｊ].南京林业大学学报(自然科学版)ꎬ２０１２ꎬ３６(２):１２５－１３２.[４]㊀ＬｉｕＷꎬＬｉＷꎬＨｅＱꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ１９ｇｅｎｅｓｅｎｃｏ￣ｄｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ￣ｂｏｕｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍｒａｉｍｏｎｄｉｉｕｎｄｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１５ꎬ１０(４):ｅ０１２３２８１.[５]㊀ＬｅｅＫＲꎬＬｅｅＹꎬＫｉｍＥＨꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｅａｔｅ１２￣ｄｅｓａｔｕｒａｓｅａｎｄω￣３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍＰｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓｖａｒ.ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ３５(１２):２５２３－２５３７.[６]㊀ＡｒｏｎｄｅｌＶꎬＬｅｍｉｅｕｘＢꎬＨｗａｎｇＩꎬｅｔａｌ.Ｍａｐ￣ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｇｅｎｅｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｏｍｅｇａ￣３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐ￣ｓｉｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９２ꎬ２５８(５０８６):１３５３－１３５５. [７]㊀杨志刚ꎬ郭子好ꎬ姚琴琴ꎬ等.脂肪酸去饱和酶基因的研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１３(１２):２１－２６. [８]㊀宋俊乔ꎬ孙培均ꎬ张霞ꎬ等.棉仁高油分材料筛选及其脂肪酸发育分析[Ｊ].棉花学报ꎬ２０１０ꎬ２２(４):２９１－２９６. [９]㊀ＨａｕｎＷꎬＣｏｆｆｍａｎＡꎬＣｌａｓｅｎＢＭꎬｅｔａｌ.Ｉｍｐｒｏｖｅｄｓｏｙｂｅａｎｏｉｌｑｕａｌｉｔｙｂｙｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ２ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１４ꎬ１２(７):９３４－９４０.[１０]王福军ꎬ赵开军.基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１８ꎬ５１(１):１－１６. [１１]ＬｉｕＱꎬＳｉｎｇｈＳＰꎬＧｒｅｅｎＡＧ.Ｈｉｇｈ￣ｓｔｅａｒｉｃａｎｄｈｉｇｈ￣ｏｌｅｉｃｃｏｔ￣ｔｏｎｓｅｅｄｏｉｌｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２００２ꎬ１２９:１７３２－１７４３.２２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀[１２]ＰａｔｅｒｓｏｎＡＨꎬＷｅｎｄｅｌＪＦꎬＧｕｎｄｌａｃｈＨꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｅａｔｅｄｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｏｓｓｙｐｉｕｍｇｅｎｅｏｍｅｓａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎｎａｂｌｅｃｏｔｔｏｎｆｉｂｒｅｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１２ꎬ４９２:４２３－４２７. [１３]ＬｉＦꎬＦａｎＧꎬＷａｎｇＫꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔ￣ｅｄｃｏｔｔｏｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍａｒｂｏｒｅｔｕｍ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１４ꎬ４６(６):５６７－５７２.[１４]ＨｕＹꎬＣｈｅｎＪꎬＦａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅａｎｄＧｏｓ￣ｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍｇｅｎｏｍｅｓｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｎｄｅ￣ｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｃｏｔｔｏｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ５１(４):７３９－７４８.[１５]ＷａｎｇＭꎬＴｕＬꎬＹｕａｎＤꎬｅｔａｌ.ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｃｏｔｔｏｎｓꎬＧｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍａｎｄＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ５１(２):２２４－２２９.[１６]ＸｕＹꎬＣｈｅｎＢꎬＷａｎｇＲꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｓｕｒｖｅｙａｎｄｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａ￣ｐｕｓａｎｄｉｔｓｐａｒｅｎｔａｌｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１８４(２):５８２－５９８.[１７]ＺｈｕＴꎬＬｉａｎｇＣＺꎬＭｅｎｇＺＧꎬｅｔａｌ.ＣｏｔｔｏｎＦＧＤ:ａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｄａｔａｂａｓｅｆｏｒｃｏｔｔｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１７ꎬ１７:１０１.[１８]ＦｉｎｎＲＤꎬＣｏｇｇｉｌｌＰꎬＥｂｅｒｈａｒｄｔＲＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＰｆａｍｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｉｅｓｄａｔａｂａｓｅ:ｔｏｗａｒｄｓａｍｏｒｅｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｆｕｔｕｒｅ[Ｊ].Ｎｕ￣ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ４４:Ｄ２７９－Ｄ２８５.[１９]ＡｒｔｉｍｏＰꎬＪｏｎｎａｌａｇｅｄｄａＭꎬＡｒｎｏｌｄＫꎬｅｔａｌ.ＥｘＰＡＳｙ:ＳＩＢｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｒｅｓｏｕｒｃｅｐｏｒｔａｌ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１２ꎬ４０:Ｗ５９７－Ｗ６０３.[２０]ＹｕＣＳꎬＣｈｅｎＹＣꎬＬｕＣＨꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｃｅｌ￣ｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｒｏｔｅｉｎｓ:ＳｔｒｕｃｔｕｒｅꎬＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００６ꎬ６４(３):６４３－６５１.[２１]ＫｕｍａｒＳꎬＳｔｅｃｈｅｒＧꎬＬｉＭꎬｅｔａｌ.ＭＥＧＡＸ:ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕ￣ｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓａｃｒｏｓｓｃｏｍｐｕｔｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ３５(６):１５４７－１５４９. [２２]ＶｏｏｒｒｉｐｓＲ.ＭａｐＣｈａｒｔ:ｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｔｈｅｇｒａｐｈｉｃａｌｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｋａｇｅｍａｐｓａｎｄＱＴＬｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｒｅｄｉｔｙꎬ２００２ꎬ９３(１):７７－７８.[２３]ＨｕＢꎬＪｉｎＪꎬＧｕｏＡＹꎬｅｔａｌ.ＧＳＤＳ２.０:ａｎｕｐｇｒａｄｅｄｇｅｎｅｆｅａ￣ｔｕｒｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｓｅｒｖｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１５ꎬ３１(１):１２９６－１２９７.[２４]ＢａｉｌｅｙＴＬꎬＪｏｈｎｓｏｎＪꎬＧｒａｎｔＣＥꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＭＥＭＥＳｕｉｔｅ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１５ꎬ４３:Ｗ３９－Ｗ４９.[２５]ＬｅｓｃｏｔＭꎬＤｅｈａｉｓＰꎬＴｈｉｊｓＧꎬｅｔａｌ.ＰｌａｎｔＣＡＲＥꎬａｄａｔａｂａｓｅｏｆｐｌａｎｔｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｄａｐｏｒｔａｌｔｏｔｏｏｌｓｆｏｒｉｎｓｉｌｉｃｏａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２００２ꎬ３０(１):３２５－３２７.[２６]ＷａｎｇＹꎬＴａｎｇＨꎬＤｅＢａｒｒｙＪＤꎬｅｔａｌ.ＭＣＳｃａｎＸ:ａｔｏｏｌｋｉｔｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｓｙｎｔｅｎｙａｎｄｃｏｌ￣ｌｉｎｅａｒｉｔｙ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１２ꎬ４０(７):ｅ４９. [２７]ＫｒｚｙｗｉｎｓｋｉＭꎬＳｃｈｅｉｎＪＥꎬＢｉｒｏｌＩꎬｅｔａｌ.Ｃｉｒｃｏｓ:ａｎｉｎｆｏｒｍａ￣ｔｉｏｎａｅｓｔｈｅｔｉｃｆｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００９ꎬ１９(９):１６３９－１６４５.[２８]ＬｉｕＺꎬＦｕＭꎬＬｉＨꎬｅｔａｌ.ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＡＣｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅｕｎｃｏｖｅｒｓｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｗｉｌｔ[Ｊ].ＰｅｅｒＪꎬ２０１９ꎬ７:ｅ７９９５. [２９]ＺｈａｎｇＺꎬＬｉＪꎬＺｈａｏＸＱꎬｅｔａｌ.ＫａＫｓ＿Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ:ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇＫａａｎｄＫｓｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｅｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｍｏｄｅｌａｖｅｒａｇｉｎｇ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１３ꎬ４(４):２５９－２６３. [３０]ＬｉＨꎬＣｈａｎｇＪꎬＣｈｅｎＨꎬｅｔａｌ.Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｍｅｌａｔｏｎｉｎｃｏｎｆｅｒｓｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｂｙｉｍｐｒｏｖｉｎｇｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｄｏｘｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ８:２９５.[３１]ＬｉＨꎬＧｕｏＹꎬＬａｎＺꎬｅｔａｌ.ＭｅｌａｔｏｎｉｎａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓＡＢＡａｃｔｉｏｎｔｏｐｒｏｍｏｔｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＣａ２＋ｅｆｆｌｕｘａｎｄＨ２Ｏ２ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ３０３:１１０７６１. [３２]ＬｉｕＱꎬＢｒｕｂａｋｅｒＣＬꎬＧｒｅｅｎＡＧꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＦＡＤ２￣１ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｉｎｔｒｏｎａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｙｓｔｅｍａｔ￣ｉｃｓｏｆＧｏｓｓｙｐｉｕｍ(Ｍａｌｖａｃｅａｅ)[Ｊ].ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｏｔａ￣ｎｙꎬ２００１ꎬ８８(１):９２－１０２.[３３]ＰｉｒｔｌｅＩＬꎬＫｏｎｇｃｈａｒｏｅｎｓｕｎｔｏｒｎＷꎬＮａｍｐａｉｓａｎｓｕｋＭꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｆｏｒａｃｏｔｔｏｎΔ￣１２ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ(ＦＡＤ２)[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａꎬ２００１ꎬ１５２２(２):１２２－１２９.[３４]ＺｈａｎｇＪＴꎬＺｈｕＪＱꎬＺｈｕＱꎬｅｔａｌ.Ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ￣６(Ｆａｄ６)ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２００９ꎬ３９０(３):４６９－４７４.[３５]ＺｈａｎｇＪꎬＬｉｕＨꎬＳｕｎＪꎬｅｔａｌ.ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅＦＡＤ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｄｕｒｉｎｇｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｅａｒｌｙｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１２ꎬ７(１):ｅ３０３５５. [３６]ＩｍＹＪꎬＨａｎＯꎬＣｈｕｎｇＧＣꎬｅｔａｌ.ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｏｍｅｇａ￣３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｇｅｎｅｒｅｄｕｃｅｓｓａｌｔ/ｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌꎬ２００２ꎬ１３(２):２６４－２７１.[３７]ＷａｎｇＨＳꎬＹｕＣꎬＴａｎｇＸＦꎬｅｔａｌ.Ａｔｏｍａｔｏｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅ￣ｔｉｃｕｌｕｍ(ＥＲ)￣ｔｙｐｅｏｍｅｇａ￣３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ(ＬｅＦＡＤ３)ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｅａｒｌｙｓｅｅｄｌｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１４ꎬ３３(１):１３１－１４２.[３８]ＡｒｎａｏＭＢꎬＨｅｒｎáｎｄｅｚ￣ＲｕｉｚＪ.Ｍｅｌａｔｏｎｉｎａｇａｉｎｓｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ￣ｔａｌｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｏｒｓ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ２２(５):４１３－４２９.３２㊀第４期㊀㊀㊀㊀陈义珍ꎬ等:陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１４５~１５０ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.０１８收稿日期:２０２３－０６－０７基金项目:山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ１５２)ꎻ山东省重点研发计划农业良种工程项目(２０２２ＬＺＧＣ００９)ꎻ中央引导地方科技发展专项资金项目(ＹＤＺＸ２０２２１３６)作者简介:苏晓梅(１９８８ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事番茄遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｓｘｍ１９８８４６＠１２６.ｃｏｍ通信作者:侯丽霞(１９７０ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事番茄遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｏｕｌｘ２００６＠１２６.ｃｏｍ番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选苏晓梅ꎬ王梦蕊ꎬ吕宏君ꎬ刘淑梅ꎬ王施慧ꎬ侯丽霞(山东省农业科学院蔬菜研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心ꎬ山东济南㊀２５０１００)㊀㊀摘要:番茄颈腐根腐病是设施番茄冬春生产中最严重的病害之一ꎬ严重威胁我国设施番茄的安全生产ꎮ近年来番茄颈腐根腐病在我国番茄主产区发生日益严重ꎬ培育抗病品种是防治该病最经济有效的方法ꎮ本试验采集典型症状的发病植株进行病原菌分离纯化ꎬ综合运用形态学观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法ꎬ确定病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉꎬＦｏｒｌ)ꎮ之后利用分离的病原菌通过苗期人工接种鉴定结合抗性基因分子标记方法ꎬ对３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定分析ꎬ结果显示有１８个表现抗病ꎬ与分子标记Ｆｒｌ－ＺＬ的鉴定结果一致ꎬ可用于番茄抗颈腐根腐病育种或生产ꎮ关键词:番茄ꎻ颈腐根腐病ꎻ抗性鉴定ꎻ分子标记中图分类号:Ｓ４３６.４１２.１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０１４５－０６ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＣａｕｓｉｎｇＦｕｓａｒｉｕｍＣｒｏｗｎａｎｄＲｏｏｔＲｏｔａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇＲｅｓｉｓｔａｎｔＶａｒｉｅｔｉｅｓｉｎＴｏｍａｔｏＳｕＸｉａｏｍｅｉꎬＷａｎｇＭｅｎｇｒｕｉꎬＬｙｕＨｏｎｇｊｕｎꎬＬｉｕＳｈｕｍｅｉꎬＷａｎｇＳｈｉｈｕｉꎬＨｏｕＬｉｘｉａ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＢｒａｎｃｈｏｆＮａｔｉｏｎａｌＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒｆｏｒＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔ(ＦＣＲＲ)ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｓｅｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｔｈｒｅａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｅｄｔｏｍａｔｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａ.ＩｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＦＣＲＲｉｓｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｔｈｅｍａｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｒｅａｓｏｆｔｏｍａｔｏｉｎＣｈｉｎａ.Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｓｔ￣ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓｂｙｔｉｓｓｕｅ￣ｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ.Ｂａｓｅｄｏｎｍｏｒｐｈｏ￣ｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｅｓｔꎬｔｈｅｃａｕｓａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ(Ｆｏｒｌ).ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔＦｏｒｌｉｎｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎꎬｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ３２ｖａｒｉｅｔｉｅｓｔｏＦｏｒｌｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｔｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔａｇｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｒｌｇｅｎｅ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ１８ｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｃｅｔｏＦＣＲＲꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒＦｒｌ￣ＺＬ.Ｔｈｅｓｅｓｅ￣ｌｅｃｔｅｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｗｉｔｈＦＣＲＲｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔꎻＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＭｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ㊀㊀番茄颈腐根腐病(ＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔꎬＦＣＲＲ)ꎬ俗称 死棵病 ꎬ是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉꎬＦｏｒｌ)引起的番茄土传性真菌病害[１]ꎬ能够造成番茄黄化萎蔫㊁发育不良和根茎腐烂ꎮ该病害在设施栽培地区发生严重ꎬ尤其是连作栽培导致病原菌在土壤中富集ꎬ对设施番茄生产造成严重影响[２－５]ꎮ近年来ꎬ番茄颈腐根腐病已成为威胁我国设施番茄冬春生产的最重要病害之一ꎬ侵染后可造成番茄严重减产甚至绝收[６－８]ꎮ此病侵染周期相对较长ꎬ早期不易发现ꎬ目前还没有十分安全有效的物理和化学防治方法[９]ꎮ相对来说ꎬ培育和利用抗病品种是防治该病害最为经济有效的措施ꎮ国外开展番茄颈腐根腐病抗性鉴定工作较早ꎬ并且在抗性基因定位和分子标记开发应用方面也取得一定的进展[１０－１４]ꎮ然而我国有关番茄颈腐根腐病的研究报道较少ꎬ且多数集中在该病害的发生和病原菌鉴定方面ꎬ而在抗性资源筛选研究方面还相对落后ꎬ抗病育种工作进展也较为缓慢ꎮ本研究采集山东省内不同地区番茄发病植株进行病原菌分离纯化ꎬ之后采用形态学观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法对其进行鉴定ꎬ确定其为番茄颈腐根腐病菌后再利用苗期人工接种鉴定结合分子标记分析方法ꎬ对不同来源的３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定分析ꎬ以期为番茄抗颈腐根腐病育种和生产提供理论和技术依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试病株材料:于２０２０ ２０２２年对山东省济南市㊁聊城市㊁青岛市和威海市四地番茄颈腐根腐病田间发病症状进行调查ꎬ采集番茄颈腐根腐病病株组织ꎬ带回实验室进行病原菌分离鉴定ꎮ抗性鉴定材料:试验所用鉴定材料共３２个番茄商品种ꎬ由育种公司惠赠或市场购买ꎮ抗病对照ＬＡ３２７３和感病对照Ｈｅｉｎｚ１７０６来自番茄遗传资源中心(ＴｏｍａｔｏＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒꎬＴＧＲＣ)ꎬ由山东省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组收集保存ꎮ试验于２０２３年４ ５月在蔬菜所实验楼土培室中进行ꎮ以上材料各选取１２粒饱满无病种子ꎬ在２８ħ恒温箱中催芽ꎬ待露白后播种于基质土中ꎬ每个品种播种８株ꎬ２４~２８ħ培养室内育苗ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀病原菌分离与形态观察㊀采用常规组织分离法对病原菌进行分离纯化[１５]ꎮ将染病植株根部冲洗干净ꎬ于超净工作台中将植株病健交界处组织切为大小约３ｍｍˑ３ｍｍ的茎段ꎬ用７５％酒精消毒２０ｓ后无菌水冲洗１次ꎬ然后用１％Ｎａ￣ＣｌＯ对病茎消毒５ｍｉｎ后无菌水冲洗４~５次ꎬ最后将该组织置于马铃薯葡萄糖琼脂(ＰＤＡ)培养基上ꎬ每皿放置２~３块ꎬ于２５ħ恒温培养箱中黑暗培养ꎮ病原菌长出后ꎬ选取疑似番茄颈腐根腐病病原菌菌落转接至新的ＰＤＡ培养基上ꎬ于２５ħ培养箱内黑暗培养ꎬ直至菌落外观均一ꎮ将纯化的病原菌于显微镜下观察鉴定ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２.２㊀病原菌分子生物学鉴定㊀将分离纯化后的病原菌挑至马铃薯葡萄糖(ＰＤ)液体培养基中ꎬ２５ħ条件下１２０ｒ/ｍｉｎ振荡培养４ｄꎬ过滤收集菌丝体ꎬ冻干后提取菌株基因组ＤＮＡꎮ利用ＩＴＳ通用引物(ＩＴＳ１:ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧꎻＩＴＳ４:ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ)和根据ＮＣＢＩ中Ｆｏｒｌ序列设计引物(Ｆ:ＣＴＣＣＧＡＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＣ￣ＴＡＴＧꎻＲ:ＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＴＧＴＡＡ)对病原菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增产物经１.５％琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京六合华大基因科技有限公司测序ꎮ利用ＮＣＢＩ数据库的Ｂｌａｓｔ程序对测序结果进行比对ꎮ１.２.３㊀病原菌致病性测定㊀病原菌在ＰＤ培养基中振荡培养４ｄ后ꎬ用无菌水配成浓度为１ˑ１０７个/ｍＬ的孢子悬浮液ꎮ以感病番茄材料Ｈｅｉｎｚ１７０６为接种对象ꎬ采用浸根法回接番茄幼苗ꎬ同时以清水接种作为对照ꎮ接种后控制温度为２０ħꎬ相对湿度为５０％~６０％ꎬ正常栽培管理ꎮ待植株发病后再次进行病原菌分离与纯化ꎬ观察其菌落外观形态ꎬ镜检菌丝与孢子形态ꎮ１.２.４㊀番茄品种抗病性鉴定㊀分别以ＬＡ３２７３和Ｈｅｉｎｚ１７０６为抗感病对照ꎬ参照王梦蕊等[１５]的浸根法对３２个番茄商品种进行接种鉴定ꎮ接种后置于１８~２２ħ室内环境中培养ꎬ４周后调查发病情况ꎮ１.２.５㊀番茄品种分子标记检测㊀每个编号的番茄品种混合取样ꎬ采用ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡꎬ使用与Ｆｒｌ基因连锁的分子标记ＰＮＵ－６４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｄ４[１３](Ｆ:ＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＣＡꎻＲ:ＴＧＡＴ￣ＣＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡ)和Ｆｒｌ－ＺＬ[１６](Ｆ:ＡＣＡＡＴ￣ＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧꎻＲ:ＣＣＴＡＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧ)对番茄品种进行ＰＣＲ扩增分析ꎮＰＮＵ－Ｄ４的ＰＣＲ产物经ＭｂｏⅠ酶切后用２％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄颈腐根腐病发病症状调查发现ꎬ番茄颈腐根腐病常发生于保护地冬春季番茄生产中ꎬ成株期发生时出现植株下部叶片黄化和植株直立而萎蔫的症状ꎬ萎蔫最早出现在一天最暖和的时候ꎬ晚上恢复ꎮ该病最明显的特征为茎基部缢缩且呈深褐色ꎬ主根部分或全部腐烂脱落ꎻ病株根部纵向剖面可以看到广泛的褐变和腐烂现象ꎬ维管束呈褐色并向地上部延伸ꎬ高度不超过土壤线上２５ｃｍ(图１)ꎮ２.２㊀病原菌鉴定２.２.１㊀病原菌形态学鉴定㊀在ＰＤＡ培养基中于２５ħ黑暗条件下进行恒温培养ꎬ结果(图２)看出ꎬ病原菌呈灰白色或粉紫色ꎬ菌落圆形㊁平铺生长ꎬ菌丝绒毛状ꎬ培养５ｄ菌落直径６０ｍｍ左右ꎮ病原菌主要产生三种类型的孢子:小分生孢子㊁大分生孢子和厚垣孢子ꎮ小分生孢子数量最多ꎬ呈长椭圆形或纺锤形ꎻ大分生孢子呈镰刀形ꎬ有２~４个分隔ꎻ厚垣孢子为透明状球形ꎬ顶生或间生于短侧枝上ꎬ多为单独生长ꎬ偶尔也对生或串生ꎮ该形态与其他研究者[１７－１８]描述的尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型相一致ꎬ可初步确定该病原菌为尖孢镰刀菌ꎮ图１㊀番茄颈腐根腐病田间病株(左)和根茎纵切面(右)Ａ:菌落形态ꎻＢ:分生孢子ꎻＣ:厚垣孢子与孢子梗ꎮ图２㊀菌株的菌落形态与显微形态２.２.２㊀病原菌分子生物学鉴定㊀使用真菌ＩＴＳ通用引物和Ｆｏｒｌ基因设计的引物对病原菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增ꎬ经检测分别获得５２０ｂｐ和１４００ｂｐ左右的条带(图３)ꎮ将ＰＣＲ产物测序后提交至ＮＣＢＩ进行Ｂｌａｓｔ比对ꎬ结果表明ꎬＩＴＳ１/４扩增产物与尖孢镰刀菌(ＫＹ０７３２５８.１)同源性为９９％以上ꎻＦｏｒｌ扩增产物与尖孢镰刀菌颈腐根腐病专化型(ＡＢ２０８０７３.１)的同源性为９９％以上ꎮ２.２.３㊀病原菌致病性测定㊀从不同地区分离到的４个菌株分别接种到感病番茄Ｈｅｉｎｚ１７０６上ꎬ接种后两周番茄幼苗下部叶片黄化ꎬ根部与茎基部褐化腐烂ꎬ表现为典型的番茄颈腐根腐病症状(图４)ꎮ从病株发病组织再次分离病原菌进行观察ꎬ其菌落形态和孢子形态与２.２.１中描述的菌株一致ꎮ结合病原菌形态观察和分子生物学鉴定ꎬ确认分离的病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐ￣ｅｒｓｉｃｉꎮ７４１㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀苏晓梅ꎬ等:番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选Ａ:ＩＴＳ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱ꎻＢ:Ｆｏｒｌ－１扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱ꎻ１~４:不同地区分离出的病原菌菌株ꎮ图３㊀颈腐根腐病病原菌分子生物学鉴定图４㊀接种病原菌的番茄幼苗发病情况２.３㊀品种接种鉴定与分子标记检测采用苗期人工接种鉴定方法对３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定ꎬ接种后４周进行病情调查ꎬ确定抗性级别ꎬ鉴定结果如表１所示ꎮ其中ꎬ表现抗病的品种有１８个ꎬ包括来自伟丽公司的４个砧木以及其他公司选育的栽培品种ꎬ这些材料可用于番茄抗颈腐根腐病生产ꎮ使用基因连锁标记ＰＮＵ－Ｄ４和Ｆｒｌ－ＺＬ对３２个番茄商品种进行分析ꎬ结果(图５)显示ꎬ标记ＰＮＵ－Ｄ４检测结果中有２８个与接种鉴定结果一致ꎬ该标记的准确率为８７.５％ꎻ标记Ｆｒｌ－ＺＬ检测结果与接种鉴定结果完全一致ꎬ准确率为１００％ꎬ表明该标记可用于番茄抗颈腐根腐病辅助育种ꎮ表１㊀３２个番茄品种人工接种鉴定与分子标记检测结果序号品种名称来源类型果重/ｇ标记ＰＮＵ－Ｄ４标记Ｆｒｌ－ＺＬ人工接种鉴定结果１天妃十一沈阳谷雨粉果２５０~２８０ＨＨ抗病２卓粉一号沈阳谷雨粉果２５０ＨＳ感病３天宝３２６沈阳谷雨粉果２５０~３００ＨＳ感病４天赐５９５沈阳谷雨粉果３００~３５０ＳＳ感病５冠群七号南澳绿亨粉果２８０ＨＨ抗病６吉丽二号南澳绿亨粉果２５０~２８０ＳＳ感病７喜旺二号南澳绿亨粉果２８０~３００ＨＨ抗病８粉抗四号南澳绿亨粉果２６０~２８０ＳＳ感病９普金９０１南澳绿亨粉果２４０~２６０ＳＳ感病１０鲜美五号南澳绿亨口感１２０ＨＳ感病１１罗拉海泽拉粉果２４０~２７０ＨＨ抗病１２安纳西海泽拉粉果２４０~２６０ＳＨ抗病１３桃乐丝海泽拉红果２００~２４０ＨＨ抗病１４圣罗兰海泽拉粉果２００~２４０ＨＨ抗病１５瑞拉海泽拉粉果２２０~２４０ＳＳ感病１６齐达利先正达红果２２０ＳＳ感病１７瑞菲先正达红果２００ＳＳ感病１８冬暖先正达红果２００ＳＳ感病１９凯利３号先正达红果２００ＨＨ抗病２０思贝德先正达红果２００ＳＳ感病２１丰收１２８宁夏巨丰粉果２００~２５０ＨＨ抗病２２意佰芬－５宁夏巨丰粉果２５０ＨＨ抗病８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀表１(续)序号品种名称来源类型果重/ｇ标记ＰＮＵ－Ｄ４标记Ｆｒｌ－ＺＬ人工接种鉴定结果２３沃粉２号宁夏巨丰粉果２５０ＳＳ感病２４凯德雅丽８７３６０宁夏巨丰粉果２８０ＨＨ抗病２５砧如意伟丽种苗砧木 ＲＲ抗病２６砧爱一号伟丽种苗砧木 ＨＨ抗病２７ＲＴ１７０３伟丽种苗砧木 ＲＲ抗病２８Ｄ６０９伟丽种苗砧木ＨＨ抗病２９诺粉３０９艾维特粉果２８０ＨＨ抗病３０京番３０９京研益农口感８０~１２０ＳＳ感病３１喜来德１号纽内姆粉果２２０~２７０ＨＨ抗病３２托瑞德澳特粉果１６０~１８０ＨＨ抗病３３ＬＡ３２７３ＴＧＲＣ抗病对照 ＲＲ抗病３４Ｈｅｉｎｚ１７０６ＴＧＲＣ感病对照 ＳＳ感病㊀㊀注:Ｈ表示杂合抗病ꎬＲ表示抗病ꎬＳ表示感病ꎬ 表示无数据ꎻ果重为单一数值时表示果重为该数值左右ꎮＭ:ＤＮＡｌａｄｄｅｒꎬ１００ｂｐꎻＨ:杂合型ꎬＲ:抗病型ꎬＳ:感病型ꎻＬＡ３２７３(３３)和Ｈｅｉｎｚ１７０６(３４)分别为抗感病对照ꎻ１~３２为番茄商品种ꎮ图５㊀分子标记ＰＮＵ－Ｄ４(Ａ)和Ｆｒｌ－ＺＬ(Ｂ)在３２个番茄商品种中的扩增检测结果３㊀讨论与结论我国是番茄生产大国ꎬ近年来随着设施栽培面积的不断增大ꎬ多地出现颈腐根腐病危害番茄生产的报道ꎬ该病已成为威胁我国设施番茄生产的重要病害之一ꎮ目前生产上对番茄颈腐根腐病认识不足ꎬ常与枯萎病㊁青枯病等混称为 死棵 病ꎬ难以采取针对性的防治措施ꎮ病原菌的分离鉴定是确定病害类型并进行有效防治的前提ꎮ本研究对在山东省不同地区采集的疑似番茄颈腐根腐病病株进行病原菌分离ꎬ通过形态学特征观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法鉴定分离得到的病原菌为番茄颈腐根腐病专化型Ｆｏｒｌꎮ随着分子生物学的发展ꎬ分子标记辅助选择已成为番茄育种过程中不可或缺的一种技术手段ꎬ可以有效缩短育种时间ꎬ提高育种效率ꎮ然而其准确性取决于分子标记与目标基因的连锁程度ꎮ目前应用于番茄抗颈腐根腐病育种的分子标记有Ｃ２－２５和ＰＮＵ－Ｄ４ꎮ程琳等[６]通过人工接种结合分子标记Ｃ２－２５方法对２５份番茄种质材料进行鉴定ꎬ结果表明标记Ｃ２－２５的准确率为１００％ꎬ然而在王梦蕊等[１５]的研究中ꎬ该标记的准确率仅为５９％ꎬ其原因可能在于不同研究者使用的材料遗传背景不同ꎮ２０１６年ꎬＫｉｍ等[１３]筛选获得一个ＣＡＰＳ标记ＰＮＵ－Ｄ４ꎬ其在Ｆ２群体及６０份商品种番茄中的准确率分别为９２.８％和９０％ꎬ在王梦蕊等[１５]的研究中ꎬＰＮＵ－Ｄ４在５１份杂交种中鉴定的准确率为８６％ꎬ在本研究中该标记的准确率为８７.５％ꎬ与前人结果基本一致ꎮ随着Ｆｒｌ基因定位与克隆的研究进展ꎬ李传友等[１６]开发了一个ＳＣＡＲ标记Ｆｒｌ－ＺＬꎬ本研究中该标记在３２个商品种抗病鉴定中的准确率为１００％ꎬ表明该标记可用于番茄抗颈腐根腐病辅助育种ꎮ接下来还需进一步加强Ｆｒｌ基因的克隆研究ꎬ为明确番茄抗颈腐根腐病分子机理和加快新品种选育奠定基础ꎮ９４１㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀苏晓梅ꎬ等:番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＪａｒｖｉｓＷＲꎬＳｈｏｅｍａｋｅｒＲＡ.ＴａｘｏｎｏｍｉｃｓｔａｔｕｓｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｏｘ￣ｙｓｐｏｒｕｍｃａｕｓｉｎｇｆｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣ｇｙꎬ１９７８ꎬ６８(１２):１６７９－１６８０.[２]㊀ＳｏｎｏｄａＲＭ.ＯｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａＦｕｓａｒｉｕｍｒｏｏｔ￣ｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏｅｓｉｎＳｏｕｔｈＦｌｏｒｉｄａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒꎬ１９７６ꎬ６０:２７１－２７４.[３]㊀ＪａｒｖｉｓＷＲꎬＴｈｏｒｐｅＨＪꎬＭｅｌｏｃｈｅＲＢ.ＳｕｒｖｅｙｏｆｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｐｒａｃｔｉｃｅｓｉｎＥｓｓｅｘＣｏｕｎｔｙꎬＯｎｔａｒｉｏꎬｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｆｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅꎬ１９８３ꎬ６７:３８－４０.[４]㊀ＫｉｍＪＴꎬＰａｒｋＩＨꎬＨａｈｍＹＨꎬｅｔａｌ.ＣｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｔｏｍａｔｏｃａｕｓｅｄｂｙＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉ￣ｃｅｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｉｎＫｏｒｅａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ１７(５):２９０－２９４.[５]㊀Ｐｏｒｔａ￣ＰｕｇｌｉａＡꎬＴａｎｔｉＲꎬＭｉｆｓｕｄＤ.ＡｓｅｖｅｒｅｏｕｔｂｒｅａｋｏｆｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏｃａｕｓｅｄｂｙＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｉｎＭａｌｔａ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａꎬ２００５ꎬ４４(３):３１９－３２１.[６]㊀程琳ꎬ张生ꎬ李艳青ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原菌鉴定与抗病种质材料的筛选[Ｊ].园艺学报ꎬ２０１６ꎬ４３(４):７８１－７８８. [７]㊀张尚卿ꎬ韩晓清ꎬ缪作清ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及２种接种方法的评价[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１７ꎬ３２(５):１２４－１２９.[８]㊀李潇ꎬ李雪萍ꎬ漆永红ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及其品种抗性鉴定[Ｊ].甘肃农业大学学报ꎬ２０１９ꎬ５４(５):１２１－１２７.[９]㊀ＬｉｕＪＢꎬＧｉｌａｒｄｉＧꎬＳａｎｎａＭꎬｅｔａｌ.ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏａｎｄｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｂａｃ￣ｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｅｃｙｃｌｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｌｅｓｓｃｒｏｐｓ[Ｊ].Ｐｈｙ￣ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａꎬ２０１０ꎬ４９(２):１６３－１７１. [１０]ＦａｚｉｏＧꎬＳｔｅｖｅｎｓＭＲꎬＳｃｏｔｔＪＷ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ(Ｆｒｌ)ｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ１９９９ꎬ１０５:２０５－２１０.[１１]ＳｔａｎｉａｓｚｅｋＭꎬＳｚｃｚｅｃｈｕｒａＷꎬＭａｒｃｚｅｗｓｋｉＷ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒＣ２￣２５ｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏ￣ｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＦｒｌｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＣｚｅｃｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇꎬ２０１４ꎬ５０(４):２８５－２８７.[１２]ＭｕｔｌｕＮꎬＤｅｍｉｒｅｌｌｉＡꎬＩｌｂｉＨꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｏ￣ｄｏｍｉ￣ｎａｎｔＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅＦｕｓａｒｉ￣ｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ[Ｊ].ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐ￣ｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１５ꎬ１２８(９):１７９１－１７９８.[１３]ＫｉｍＢꎬＫｉｍＮꎬＫｉｍＪＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｈｉｇｈ￣ｒｅｓｏｌｕ￣ｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇｍａｒｋｅｒｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｎｇＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅꎬ２０１６ꎬ５９(３):１７３－１８３. [１４]ＤｅｖｒａｎＺꎬＫａｈｖｅｃｉＥꎬＨｏｎｇＹꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＦｒｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏｂｒｅｅｄｉｎｇ[Ｊ].Ｔｈｅｏ￣ｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１３１(１０):２０９９－２１０５. [１５]王梦蕊ꎬ刘淑梅ꎬ侯丽霞ꎬ等.番茄颈腐根腐病抗性鉴定技术的建立及抗性种质资源筛选[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(４):７０７－７１８.[１６]李传友ꎬ赵伟ꎬ邓磊ꎬ等.与番茄抗颈腐根腐病基因Ｆｒｌ紧密连锁的分子标记及其应用:ＣＮ１１３９４３８２６Ｂ[Ｐ].２０２３－０５－０５.[１７]耿丽华ꎬ李常保ꎬ迟胜起ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响[Ｊ].植物病理学报ꎬ２０１２ꎬ４２(５):４４９－４５５.[１８]李景富ꎬ孙亚莉ꎬ赵婷婷ꎬ等.番茄颈腐根腐病菌分离鉴定与生物学特性研究[Ｊ].东北农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４９(２):２２－３０.０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。

科研课题合作单位合作协议模板科研课题合作单位合作协议模板一、双方基本信息甲方：（单位名称、注册地址、联系人、电话、传真、邮箱、统一社会信用代码）乙方：（单位名称、注册地址、联系人、电话、传真、邮箱、统一社会信用代码）二、各方身份甲方是科研课题的牵头单位，负责课题的组织、管理和实施；乙方是科研课题的合作单位，根据课题的研究内容和要求，独立或配合甲方进行研究。

三、权利和义务甲方的权利和义务：1.组织科研课题的实施，制定研究计划和进度安排，协调各合作单位的合理利用和分配；2.按照协议约定向乙方提供课题研究资金，并按照规定使用课题研究资金；3.负责课题的成果管理、保密和发布，并按照约定与乙方分享知识产权成果及获得的经济利益；4.协调解决科研课题实施过程中发生的问题和纠纷；5.其他根据协议必须承担的义务。

乙方的权利和义务：1.接受甲方的委托，按照协议约定参与科研课题的实施；2.严格按照研究计划和进度安排，保质保量完成课题研究工作；3.按时提交课题研究成果，保证成果的准确性和真实性，并协助甲方完成课题成果的管理、保密和发布；4.未经甲方授权，不得将课题研究成果向第三方公开或转让；5.遵守中华人民共和国的法律法规和科研课题管理规定；6.其他根据协议必须承担的义务。

四、履行方式和期限甲乙双方应明确科研课题的实施方式、串讲和沟通机制，并制定具体实施方案。

实施期限根据协议约定确定。

五、违约责任1.本协议的任何一方违反协议规定，给对方造成损失的，应承担相应的赔偿责任；2.在课题实施过程中，若因乙方的原因导致课题无法完成、推迟进度等影响研究成果的，应承担相应的赔偿责任；3.当一方违约或履行不到位时，另一方有权提出解除本协议的要求。

六、法律效力和可执行性本协议生效后，即具有法律约束力，各方应严格履行协议约定。

如因本协议发生争议，各方应友好协商解决；如协商不成，则应向有管辖权的人民法院起诉解决。

七、其他本协议一式两份，甲乙双方各执一份，自双方签字盖章之日起生效。

山东省重点研发计划资金管理办法第一章总则第一条为规范山东省重点研发计划资金（以下简称重点研发计划资金）管理和使用，提高资金使用效益，根据《省委办公厅省政府办公厅印发〈关于完善财政科研项目资金管理政策的实施意见〉的通知》（鲁办发〔2016〕71号），以及国家和省有关财经法规和财务管理制度规定，制定本办法。

第二条重点研发计划资金由省级财政设立，面向全省经济社会发展及新旧动能转换的重大科技需求，重点支持基础性、公益性的科学研究及成果转化，推动重点领域关键核心技术实现新突破，培育科技人才队伍后备力量，支持科技领军人才开展深度研究，推进创新创业深入开展，为建设现代化经济体系提供科技创新支撑。

第三条重点研发计划资金的使用和管理，遵循“突出重点、分类支持、科学安排、注重绩效”的原则。

第四条重点研发计划资金实行分级管理、分级负责。

省财政厅负责资金预算编制、下达拨付和绩效监管。

省科技厅负责项目评审立项、资金分配和组织验收，对资金支出进度、绩效、安全性和规范性等负责。

省直有关部门（单位）、各市（含黄河三角洲农业高新技术产业示范区）科技局、国家级高新区管委会以及中央驻鲁单位作为项目主管部门，负责项目资金日常监管。

项目承担单位是项目资金管理使用的责任主体，负责项目资金的日常管理和监督。

项目管理专业机构接受委托为项目预算申报、评估和项目验收等提供服务。

第二章项目资金支持方式第五条重点研发计划资金采取多种支持方式，包括无偿资助、后补助、股权投资、风险补偿、贷款贴息等，具体支持方式在制发年度项目申报通知和项目指南时予以明确。

第六条无偿资助，是指对科研项目等活动所需成本，在开展前直接给予部分或全部补助的财政资助方式。

后补助，是指从事研究开发和科技服务活动的单位先行投入资金，取得成果或服务绩效，通过验收或绩效考核后，给予资金补助的财政资助方式。

股权投资（含资本金注入），是指财政资金对开展重大科技成果转化和产业化的项目相关的科技企业以股权形式进行权益性投资的财政支持方式。

山东省科学技术厅、山东省财政厅关于印发《山东省重点研发计划（科技示范工程）项目管理暂行办法》的通知文章属性•【制定机关】山东省科学技术厅,山东省财政厅•【公布日期】2022.02.10•【字号】鲁科字〔2022〕15号•【施行日期】2022.02.10•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】科学技术综合规定正文山东省科学技术厅、山东省财政厅关于印发《山东省重点研发计划（科技示范工程）项目管理暂行办法》的通知各市科技局、财政局，省直有关部门，各有关单位：现将《山东省重点研发计划（科技示范工程）项目管理暂行办法》印发给你们，请遵照执行。

山东省科学技术厅山东省财政厅2022年2月10日目录第一章总则第二章管理与职责第三章项目立项第四章组织实施与过程管理第五章监督管理第六章资金管理第七章附则山东省重点研发计划（科技示范工程）项目管理暂行办法第一章总则第一条为规范和加强山东省重点研发计划（科技示范工程）（以下简称科技示范工程）组织实施，依据《山东省重点研发计划管理办法》等有关规定，结合我省实际，制定本办法。

第二条本办法所称科技示范工程是山东省重点研发计划的重要组成部分，旨在聚焦重点产业中的重大需求，实行重大关键技术突破、工程化中试到产业化应用示范的全链条设计，推动重大集成性创新，打通由技术到产品的通道，培育具有牵引性、支柱性的重大产品和装备，孵化高成长性科技型中小微企业，壮大创新型产业集群，带动区域和行业创新能力和水平的整体跃升。

第三条科技示范工程坚持聚焦关键问题、对标一流目标、突出创新驱动、体现效益效应的总体思路，采取“技术攻关+产业化应用”项目形式，按照“成熟一项、启动一项”的原则组织实施。

第二章管理与职责第四条省科技厅是科技示范工程的委托方，负责研究提出科技示范工程布局建议及任务设置，编制并发布项目指南；直接组织或委托专业管理机构开展项目申报受理、形式审查、评审立项、过程管理、绩效评价和评估监督等工作。

山东省审计厅关于2020至2021年度重点科研课题立项的通知文章属性•【制定机关】山东省审计厅•【公布日期】2020.06.08•【字号】•【施行日期】2020.06.08•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】基础研究与科研基地正文山东省审计厅关于2020至2021年度重点科研课题立项的通知各市审计局，厅机关各处室、各直属事业单位，各有关高等院校、单位：按照年度工作安排，省审计学会和省审计科学研究所组织开展了省审计厅2020至2021年度重点科研课题立项评审工作。

经省审计厅批准，对16项委托课题予以立项（各项课题名称等见附件1）。

各课题组在课题研究中，要以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，坚持用学术讲政治，紧密结合审计工作实际，注重研究质量，力求有深度和创新，确保成果有参考价值和应用价值。

各课题组所在单位要为课题研究提供必要的条件和支持，加强对课题研究的监督管理。

各课题组负责人要切实履行职责，认真参与课题研究，发挥好课题带头人作用。

各课题组要合理搭配成员，注意做好审计科研人员、一线业务人员及专家学者的密切结合，围绕审计工作实践需求，精心组织、按时完成课题研究。

请各单位收到立项通知后，尽快制定完善课题研究方案（见附件2），于2020年6月15日前将电子件发至联系人内网邮箱或互联网邮箱。

各课题组应于2021年10月30日前将课题研究报告报省审计学会秘书处。

研究报告要观点明确，论据充分，论证严密，研究方法得当，符合规范和学术道德要求，一般不少于2万字（报告格式要求见附件3）。

省审计学会和省审计科学研究所要认真组织立项课题的中期调度及结项评审，确保课题研究成果的质量。

联系人：王丽丽、李晓贤，*************互联网邮箱：*******************附件： 1.山东省审计厅2020至2021年度重点科研课题立项情况表.doc2.山东省审计厅重点科研课题研究方案（模板）.doc3.研究报告撰写格式说明.doc山东省审计厅2020年6月8日。

山东省发展和改革委员会关于对我省社会信用体系建设试点示范城市创建工作进行总结的通知文章属性•【制定机关】山东省发展和改革委员会•【公布日期】2018.09.29•【字号】鲁信用办〔2018〕20号•【施行日期】2018.09.29•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】行政法总类综合规定正文山东省发展和改革委员会关于对我省社会信用体系建设试点示范城市创建工作进行总结的通知鲁信用办〔2018〕20号有关市社会信用体系建设牵头单位，省有关部门：为认真贯彻落实《山东省社会信用体系建设工作方案》（鲁厅字〔2015〕7号）和《山东省社会信用体系建设规划（2015—2020年）》精神，发挥示范带动和表率引领作用，我省于2016年启动了社会信用体系建设试点示范城市创建工作。

按照创建工作安排，省社会信用体系建设联席会议办公室拟于近期对我省社会信用体系建设试点示范城市创建工作进行总结。

现将有关事项通知如下：一、参与总结城市范围根据2016年创建工作通知，对试点示范城市创建工作进行总结的城市包括：济南市、济宁市、莱芜市、聊城市，青岛即墨区、青岛西海岸新区、平度市、滕州市、垦利县、利津县、烟台牟平区、海阳市、诸城市、寿光市、宁阳县、威海经济开发区、乳山市、五莲县、宁津县、无棣县。

由于机构调整等原因，省有关部门不参与总结。

二、总结程序（一）自评。

请有关市(县、区)认真梳理总结创建工作情况，形成自评报告，具体包括：总体情况、组织保障体系、信用法规制度、信用平台和网站、信用信息应用、行业信用建设、重点领域失信专项治理、信用宣传教育、创新特色亮点等，附相关证明材料。

请于10月31日前，将上述材料一式三份报送省社会信用体系建设联席会议办公室。

（二）初审。

省社会信用体系建设联席会议办公室将组织相关人员对自评报告进行初步审核，确定初选入围市（县、区）。

（三）召开总结会议。

按照“初选入围城市限时展示汇报、评委打分”的方式，从初选入围城市中择优确定“山东省社会信用体系建设示范城市”。

山东省发展和改革委员会关于建立信用理论研究专家
库的通知
文章属性
•【制定机关】山东省发展和改革委员会
•【公布日期】2018.08.03
•【字号】
•【施行日期】2018.08.03
•【效力等级】地方规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】专业技术人员管理
正文
山东省发展和改革委员会关于建立信用理论研究专家库的通
知
各市发展改革委，省有关部门，有关高等院校、科研单位：
为推动我省社会信用体系建设理论研究，为我省社会信用体系建设提供理论支撑和智力支持，经研究，我委决定建立信用理论研究专家库。

在我省范围内，从事社会信用体系建设理论研究工作，已经取得一定学术研究成果的专家学者，可自愿申请加入。

请有意向的专家学者，按照附表格式，填写个人申请表，提供有关研究成果材料，经所在单位审核盖章上报。

请各市发展改革委、省有关部门、有关单位协助做好通知推荐事宜。

有关申请表格和材料，请在2018年8月底前，发送到省发展改革委信用管理处，邮寄、传真、邮件均可。

联系人：杨仁华
联系电话：0531－86191814，86191788（传真）
电子邮箱：********************
地址：济南市省府前街１号省发改委信用处
附件：信用理论研究专家库个人申请表.docx
山东省发展和改革委员会
2018年8月3日。

文章编号：2095－6835（2022）14－0080－04产业革新背景下财经类仿真实验的“ADSEI”人才培养模式研究＊陶虎，毕继东，刘晓菁，梁雨婷（山东财经大学，山东济南250014）摘要：近年来，产业转型升级成为推动经济高质量增长的动力，经济、社会的发展对高校人才培养也提出了更高的要求。

针对高校人才培养与社会需求不协调的矛盾，在分析高校人才培养不足的基础上，从产业革新视角，基于创新型、复合型、应用型人才培养的需求，构建了以财经类虚拟仿真实验为核心的“ADSEI”人才培养模式，基于模拟运营结果进行了教学效果评价，并给出了提升学生的理论水平与实践能力的建议。

关键词：产业革新；人才培养模式；财经高校；虚拟仿真实验中图分类号：G712文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.14.026当前，中国经济由高速增长阶段转向高质量发展阶段，这是国家经济发展的根本要求，而实现高质量的产业体系离不开高水平的产业人才。

产业技术的融合与发展对产业型人才的需求进一步扩大，同时对产业型人才能力要求也进一步提高。

高校作为高等人才培养的主阵地，应当承担起产业型人才培养这一发展要务，主动适应国家战略发展新需求[1]。

当前中国人才队伍存在结构性过剩与短缺并存的问题，高质量应用型人才紧缺。

采用传统的高校人才培养模式从学科视角制定培养目标与方案，缺乏对企业实务工作需求的综合考量，导致高质量应用型产业人才匮乏。

作为财经类高校，在此背景下应当完善人才培养理念，创新人才培养模式，强化实践教学，培养适应社会变革的高素质人才。

1相关文献综述1.1产业革新背景下的人才需求研究随着人才强国战略的实施，中国产业人才队伍的建设卓有成效，但存在的问题依然突出，当前，中国高校产业型人才供给与市场经济需求无论在规模还是在质量上均存在缺口与错位[2]，产业革新使社会分工进一步细化。

从人才缺口的角度分析，拥有过硬的专业能力的人才在人才市场中能够获得更强的竞争力。