凝胶色谱柱的基本介绍

凝胶色谱柱操作

1、 溶胀

商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。

2、 装柱

由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。

3、 柱均匀性检查

凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。

4、 上样

凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。

1 Sephadex G10 凝胶色谱柱

在药物质量控制中的应用

（大连依利特公司应用实验室）

1.前言

目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。

在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。

中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。2年来用户使用得到很好的效果。 2 2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述

样品或对照品 流动相 蓝色葡聚糖2000评价指标 药典（2000）页码

理论塔板数 拖尾因子

头孢他啶 3.5％硫酸铵的0.01moL/L的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0） 大于900 0.75-1.5 171

头孢哌酮钠 0.01moL/L的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0） 大于700 0.75-1.5 187

头孢噻肟钠

头孢曲松钠 0.1moL/L的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0） 大于700 0.75-1.5 197

173

头孢他啶、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、

使用注意事项：

色谱柱在使用过程中主要应该注意的是：

1、每根色谱柱都有一定的压力范围（说明书有说明），一般要在合适的压力下进行分析使用。

2、色谱柱在制作过程中是在一定的压力下按一定的方向添装 的，因此要求在使用时要按照规定的方向进行连接。如果不小心装反了也不用着急，一般没有超压使用应该影响不是很大。但如果一直使用了很长时间如半年或1-2年，建议你就一直这样使用下去。

3、分析样品和流动相一定要过滤干净，不要让对柱有害的物质通过色谱柱。

4、增加一根保护柱或柱前保护对分析柱是有好处的。

5、色谱柱能不能反冲，在第2中提到了一点，一般咨询厂家时都会告诉你不能反冲，主要是担心反冲会使柱中的填料松散，那样整根柱子就报废了。这一点应该很好理解，就是在一定压力一定方向将填料填充压紧，如果反向冲操作不当很容易就会使原来压紧的填料松散开，这是无法弥补的损坏。但在具体使用中，就我所知可以在压力低一些，也就是流量小一些的条件下进行反冲，只要没有影响到柱内的填料，将堵塞的物质冲出可以有效降低系统压力，改善柱效。

应用：

凝胶色谱柱主要进行大分子样品分子量与分子量分布的检测，如果样品分子量差异较大，应该也可以进行分离。这类样品可以作为宽标的标准样品进行标准曲线的建立。

另外，凝胶色谱柱检测的样品有油性的高分子物质，如树脂类等，还有水溶性的高分子物质如糖类等。

对于不同厂家的色谱柱要说好坏之分，我认为和以上很多内容都有关系，样品是否干净，流动相是否干净，人员有没有误操作，有没有保护柱，每天工作量大小等很多影响因素。总体来说应该差不多。

凝胶色谱柱（水性）的保养与保存：

凝胶色谱柱需要注意防止微生物的生长，被微生物污染后的色谱柱将无法重现原来的分离效果与柱效，严重会使凝胶色谱柱报废。

为了抑制微生物的生长，可以使用低温保存。值得注意的是温度不能过低，以免冻结，为了不冻结可以提高保存时介质的离子强度。

常用的保存抑菌剂有：0.02%叠氮钠、0.002%洗必泰（hibitane，双氯苯双胍己烷）、0.01%-0.02%三氯丁醇、0.1mol/l氢氧化钠。

安捷伦PLOT色谱柱的基本应用

PLOT色谱柱

PLOT色谱柱是分离室温下为气态的化合物的理想色谱柱。安捷伦科技为永久气体、低分子量烃类异构体、挥发性极性化合物和反应性分析物（如气体硫化物、胺、氢化物等）的分析提供了全系列的PLOT色谱柱。我们在尽寸上提供的PLOT固定相色谱柱从0.25到0.53mm内径，为各种检测器和系统需求提供了方便的色谱柱选择。对于GC/MS系统，我们提供了几种真正键合和牢定的固定相细内径色谱柱，消除由于颗粒物的产生而导致的潜在的检测器玷污。

PLOT色谱柱应用建议

色谱柱 固定相 典型应用

HP-PLOT分子筛柱 5A分子筛沸石 永久和惰性气体。备有厚液膜和薄液膜。厚液膜色谱柱可在35℃下分离氩和氧。

HP-PLOT

Al2O3/KCl 用KCl脱活的氧化铝 “极性”最低的氧化铝固定相。与链烷烃相比，烯烃保留最低。C1到C8烃灯异构体。选择准确定量二烯，特别是乙烯和丙烯中的丙二烯和丁二烯的色谱柱。

HP-PLOT

Al2O3/S 用硫酸钠脱活的氧化铝 用于轻质烃的高性能通用氧化铝色谱柱：C1到C8异构体。最适合用于从丁烯中分离乙炔、从异丁烷中分离丙烯。

GS-Alumina 采用专利技术脱活的氧化铝 “极性”最大的氧化铝色谱柱。与链烷烃相比，烯烃的保留最高。用于轻烃的高性能通用氧化铝色谱柱：C1到C8异构体。最适合用于从丙烯中分离环丙烷。在水饱和时具有良好的稳定性和回收率。

HP-PLOT Q 聚苯乙烯-二乙烯基苯 C1到C3异构体、到C12的烷烃、CO2、甲烷、空气/CO、水、含氧化合物、硫化物、溶剂。

HP-PLOT U 二乙烯基苯/乙烯 极性高于HP-PLOT Q和GS-Q。C1到C7烃类、CO2、甲烷、空气/CO、水、二醇二甲基丙烯酸酯氧化物、胺类、溶剂、醇类、酮类、醛类。

GS-GasPro 专利的键合硅胶基 在-80℃下分离C1到C12烃、CO2、痕量硫化物、氢化物气体、无机气体、卤烃、SF6、氧/氮。