水稻抗稻瘟病基因研究进展
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•综述•综述 范学科等：水稻抗稻瘟病基因研究进展水稻抗稻瘟病基因研究进展范学科、张宝林2,郑爱泉1(1.杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100; 2贵州农业职业学院，贵阳551400) Advances in Gene Research on Rice Blast Resistance FAN Xueke1，ZHANG Baolin2，ZHENG Aicjuan1摘要：水稻是世界上重要的粮食作物，然而由子嚢真菌 )引起的稻瘟病是影响稻米产量和品质 的主要病害，大面积应用化学防治不仅会增加生产成本，还容 易造成严重的环境污染。因此，鉴定抗稻瘟病资源，挖掘抗稻 痕病基因，并结合分子标记辅助选择（Markcr-AssistcdSclcc- tionMAS) 育种技术，将多个基因位点聚合到一个品种则是控 制和预防稻瘟病最为经济有效的途径。本文综述了稻瘟病发 病机制、致病因子、鉴定方法和抗病基因定位与克隆等方面的 研究进展，以期为水稻稻瘟病抗病资源筛查与新品种选育提供 理论借鉴。关键词：水稻；稻瘟病；分子标记辅助育种 IX1 编码：10. 6590/jcnki. 100-4 705.2018.05.04 5 中图分类号：S511 文献标志码：A文章编号：1001-4705(2018)05-0045-05水稻是重要的粮食作物之一，全世界三分之一以 上人口以稻米为主食。然而，近年来由子囊真菌 (Magwa〇r/e oyae)引起的稻瘟病常年发生，严重 影响稻米的品质和产量，给粮食生产造成了重大的经 济损失[1]。在我国，随着城市化进程的加速，耕地面积 的减少，病虫害防治难度的增加，对现阶段水稻育种工 作提出了更高的要求。稻瘟病属水稻全生育期病害，不同时期发病程度 不同。因此，在生产上按照稻瘟病发病时期和部位，一 般将稻瘟病分为苗瘟、穗瘟、叶枕瘟等类型，其中苗瘟 和穗瘟是影响水稻产量的主要类型[2]。稻瘟病菌变异 速度快，种类多且具有很强的环境适应能力。稻瘟病 的发生一般受环境温度和湿度的影响，在适宜的温度 条件下，阴雨连绵的天气稻瘟病菌最容易滋生并爆发， 严重时甚至导致绝收[3]。目前生产上主要通过培育抗 稻瘟病新品种和化学防治来抑制病菌繁殖和危害，但收稿日期=2017-12-15基金项目：陕西省农业科技创新与攻关（2015NY121)。作者简介：范学科（966 —），男，陕西长武人；副教授，主要从事农业生 物技术教学与科研工作；E-mail:〖anxueke6 61115@16 3com。 通讯作者：张宝林（982—），男，贵州遵义人；高级农艺师，主要从事农 产品质量安全教学与科研工作；E-mail: 95 6948630 @163. com。以化学防治途径为主要手段。实践表明，使用化学方 法防治稻瘟病不仅增加生产成本，还会对生态环境造 成污染，因此深人挖掘新的抗稻瘟病基因，并结合分子 标记辅助选择育种技术，筛选抗病种质材料并以此培 育抗稻瘟病新品种可能是水稻抑制稻瘟病病原菌繁殖 和危害的有效手段[4]。随着功能基因组学和生物信息 学的发展，水稻和稻瘟病病菌的基因测序和组装工作 已基本完成，同时结合水稻与稻瘟病菌互作的“基因对 基因”假说，研究抗性基因的定位、克隆、互作及功能解 析，不仅能为揭示水稻抗稻瘟病菌的分子机制提供一 定的分子基础，同时也能为稻瘟病防治提供新的思路。 1水稻稻瘟病菌侵染过程稻瘟病菌的侵染过程最先是从研究稻瘟病菌侵染 小麦根部致病机理时发现的，后来Sesma等在此基础 上研究发现稻瘟病菌可以由地下部组织侵染水稻根 部，并通过维管束侵染整个植株，同时指出稻瘟病对寄 主侵染具有组织特异性[5]。稻瘟病菌主要从叶茎表皮 和根部侵染水稻，进而形成病斑，其侵染过程可分为以 下几个阶段：1)孢子附着到寄主表皮，即：具有3个细 胞的稻瘟病菌分生孢子飘落到水稻植株叶茎或根部， 然后通过顶端分泌的黏合物使孢子紧紧附在水稻叶片 表面；2)芽管发育，即：分生孢子顶端萌发芽管粘附 在宿主表面外基质上；3)形成附着胞，即：芽管进一 步分化成圆顶状的附着胞，附着胞内含有孢子和芽管 自我分解的营养物质，该过程受细胞周期调控；4)产 生侵人钉，即：在附着胞细胞壁和细胞膜之间有一层黑 色素，黑色素对附着胞的侵染十分重要，如附着胞不能 形成黑色素时，就不能产生足够大的膨压，从而失去致 病力。5)在寄主植物中生长，即：初级侵人菌丝在寄 主细胞中吸收营养后产生次级菌丝，次级菌丝通过寄 主细胞胞间连丝扩散到邻近的细胞，2h后便可产生 明显的坏死症状，即病斑[—7]。2影响水稻稻瘟病发病因素研究表明，影响水稻稻瘟病发病的因素主要是环• 45
•第37卷第5期 2018年5月种子（Seed.)Vol.37 No.5 May. 2018境和栽培管理措施[4]。另有研究表明，稻瘟病菌丝适 宜繁殖及侵染的最佳温度为26〜28°C,湿度为80%〜 90%,因此水稻生育期内若遇阴雨天气，且温度合适， 则易引发稻瘟病。除此以外，光照强度，植株长势等因 素也会影响稻瘟病的发生[8]。综上，依据当地气候条 件和稻瘟病发病规律，选择抗（耐）稻瘟病水稻栽培品 种和优化的栽培管理措施，严格执行品种选择标准，则 对当地水稻产业抵御或回避稻瘟病具有重要的生产意 义。3水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆20世纪60年代以来，国内外研究人员对世界不 同地区的种质资源进行了抗性鉴定，一大批优质抗源 被筛选出来[912]: 1)地方品种主要有黑壳子粳、湘资 3150、Digu、红脚占等；2)籼稻品种主要有窄叶青8 号、Kasalath、Chubu 32、二黄占2号等；3)野生稻品 种主要有小粒野生稻、澳洲野生稻等。其中，来自广西 的籼稻红脚占对B群小种具有抗性，黑壳子粳对江苏 省大部分优势小种具有抗性，水稻品种Tetep具有广 谱的抗病性[1314]。此后丄iang等对74份云南地方水 稻种质资源的稻瘟病抗性进行了鉴定，结果表明，2个 云南地方品种毫弄早、毫玉浪比持久抗病品种Tetep 和Moroberekan对稻瘟病的抗性广谱性更大、稳定性 更强[15]。3.1水稻稻瘟病抗性基因的定位随着分子生物学的发展，利用分子标记构建遗传图谱，并结合全基因组扫描技术对抗 病基因进行定位，并以此开发 分子标记是推动水稻抗稻瘟病 机制研究及快速实现抗病基因 定向转育新品种的重要理论支 撑。截至目前，至少已有69个 抗病位点超过83个主效基因 被鉴定[10-14.16-20]，且大部分抗 病基因分布在水稻的6、11号 和12号3条染色体上，其中 11号染色体分布最多，约占总 数的2%,特别是其长臂末端 区域形成了一个抗病基因簇；6号和12号染色体也分别存 在一个抗病基因簇，这2条染 色体定位到的基因分别占总数 的 14%与 15%。3.2水稻稻瘟病抗性基因的克隆截止目前，共有26个抗稻瘟病基因，包括P61、 Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h、Pi54、Pik-m、Pik- p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、 Pf25、Pf36、Pf37、Pf50、Pf64、Pf56、Pf63 被克隆， Pzz和Pzk位点上存在多个复等位基因，其中11号染 色体上被克隆的基因最多，共8个；此外，6号染色体 上有7个，其中大部分被证明是等位基因 (表2)[10-14,6-8]。6号染色体已克隆的稻瘟病抗病基 因有 Pi 9、Pi 2、Pit、Pigm、Pd2、Pd3 和 Pi 25，其 中Pid2、Pi-2、PZ-t、Pi9、Pigm是5个抗病等位基 因，来自不同的抗病品种。P^2和P以均属于NPS- LRR类基因，其中Pr 2含有2个内含子，互补试验证 明Pi-2基因即为：Nbs4,其编码产物约含有1 032个 氣基酸残基，与Pi—t基因编码的蛋白质序列仅有8 个氨基酸残基的差异；Pr2、P^基因编码的蛋白质序 列同样也是由1 032个氨基酸残基组成，其中Nb2- Pd为Pd基因编码蛋白质序列羧基端由17个不完 整的含有富亮氨酸重复域（IRRs)组成[9]。11号染色 体上已被克隆的稻瘟病抗病基因有Pa、P—〇39、 P61、P—、Pkh、Pkm、Pkp 等，其中 Pa 和 PZco39 是等位基因，另外，采用经典遗传学方法，经功能基因 组学验证Pa由2个相邻的NPS-LRR基因组成。其次，研究表明，P—、Pkh、Pkm、PkP等4个基因是 表1已克隆的水稻抗稻瘟病相关基因基因位点染色体基因长度蛋白质类型无毒菌株（小种）Pish.丄丄289NPS-LRRKyu 77-07 APit丄989NPS-LRRV 86010Pi 37丄1290NPS-LRRCHL 1405 等Pi64丄3 864NPS-LRRYangmaoguPib2丄25丄NPS-LRRPN209bsr-d 13C2H 2-type transcription factorDigup24266Proline-C'ontaining protein-Pi 634-NPS-LRR-Pi 2/Pi 961032NPS-LRRPO 6-6Piz-i61033NPS-LRR-Pid2644丄Receptor kinaseZP15Pid3/pi 256923NPS-LRRZhong-10-8-14Pi368105 6NPS-LRRCHL39Pi 5 / Pi 39丄025NPS-LRRPO6-6pi5691566NPS-LRRPO6-6Pia / Pi~co 3911966NPS-LRRP90002Pik11丄丄43、056NPS-LRRPO6-6Pi11丄丄43、丄02丄NPS-LRRIK 81-3，PO 6-6 等Pikh11丄丄43、丄02丄NPS-LRRH0b-56-1 等Pikm11丄丄43、丄02丄NPS-LRRIna 86-137 等Pikp11丄丄43、丄02丄NPS-LRR-pb1111296NPS-LRR-Pita12928NPS-LRRIK 81-3，K 8125• 46
•综述 范学科等：水稻抗稻瘟病基因研究进展等位基因，对稻瘟病具有较强的抗病性，随后利用基因 组学技术对朽4研究分析发现，该位点的抗病性主要 由2个基因共同协同表达决定，二者缺一不可。通过 进化树分析发现与其他NBS-LRR类基因亲缘 关系较远。此外，和21是目前唯一在水稻中被克隆的 隐性稻瘟病抗病基因，来自Owarihatamochi，对稻瘟 病具有中等抗性，属于功能丧失性突变。此外，朽21 编码的蛋白质由266个氨基酸构成，且结构复杂，可能 含有重金属结合和蛋白质互作2个结构域，富含脯氨 酸。与感病品种相比，抗病亲本中扣21基因中碱基的 缺失导致其具备抗病能力[21]。这一基因的发现及克 隆，更加有助于水稻抗稻瘟病机理的研究。4抗稻瘟病分子育种水稻育种工作在经历2次绿色革命（矮化育种和 杂交育种)后，其育种目标发生了较大的改变，现阶段 新品种选育工作主要围绕提高品质、产量及抗病性等。 然而，水稻的抗病育种大多仍采用常规育种方法，即杂 交、回交、轮回选择等，同时结合田间农艺性状选择和 抗性鉴定，将抗病品种所携带抗稻瘟病基因导人目标 株系，进而育成新的抗病品种，如广东省的优质稻主栽 品种粵晶丝苗2号、黄华占、齐粒丝苗、特籼占25和沈 阳农业大学选育的沈农系列水稻等，但是，传统水稻抗 稻瘟病育种主要凭经验，往往在选育过程中会出现选 择效率较低，抗病性丢失的现象[9]。因此，随着生物技 术的发展，育种家们将分子育种技术（转基因技术和分 子标记辅助选择技术）与传统育种技术相结合很大程 度上提高了水稻抗稻瘟病新品种选育的效率和水平。 4.1转基因抗病新材料的选育近年来，水稻遗传转化技术得到了迅猛发展，其主 要有：农杆菌介导技术、基因打靶技术以及通过原生质 体导人外援DNA技术。随着上述分子生物学研究手 段的完善，水稻转基因育种技术慢慢兴起，并取得了显 著的成效。转基因育种，即在不改变受体作物其他遗传背景 的情况下，使控制单一或多个性状的基因被导人受体 作物，从而有效的克服受体作物的遗传缺陷，利用常规 育种技术进行杂交选育，最终获得性状稳定的转基因 株系。在水稻抗稻瘟病育种方面，育种家往往利用转 基因技术将一些可以诱导或刺激参与对病原菌生存不 利的化合物合成基因或直接抑制病原菌生长的基因转 人受体水稻，并进行杂交选育，从而筛选出新的抗稻瘟 病新材料，其关键性基因主要有，如：几丁质酶基因，植 物抗毒素基因，几丁质酶-葡聚糖酶基因，天花粉素基 因，山葵植物抗毒素基因，核糖体失活蛋白基因，葡萄糖氧化酶基因，溶菌酶基因和水稻PmJV9、JV2 基因等[2223]。研究表明，上述基因转人水稻植株后，对 增强受体材料的稻瘟病抗性具有明显的作用。4.2分子标记辅助选择育种（MAS)分子标记辅助选择育种主要利用DNA分子标记 技术筛选目的基因，并在育种后代进行准确选择，主要 技术有限制性片段长度多态性（RFLPs)、随机扩增多 态性DNA(RAPDs)、简单重复序列（SSR)、酶切扩增 多态性序列（C APS )、扩增片段长度多态性（AFLP )、 核苷酸多态性（SNP)等。水稻抗稻瘟病育种主要采用 回交和轮回选择技术，既费时费力，又对环境条件有较 高的要求，因此结合分子标记辅助选择育种技术，可大 幅度减少抗病育种周期，且安全可靠。目前，Ashkani 等开发的SSR分子标记（RM 1 68, RM 8225 , RM 1233,RM 6836,RM 5961和RM413)已广泛应用到水 稻抗病新品种选育的分子标记选择实践中[2-25]。同 时，分子标记辅助选择育种技术也已被成功用于追踪 P—、Pi-k、Pi-i、Pi-z、Pit、Pi9 等一些抗瘟病基因 在后代群体内的渗人和在个体内的累加状况，并筛选 出多个具有广谱抗性的水稻抗稻瘟病新品系，如马文 清等[26]利用分子标记辅助选择育种技术将抗稻瘟病 基因Pd和抗褐飞虱基因B#n8t)导人到恢复系测 679中，且获得了稳定的转基因抗病株系；罗彦长等利 用分子标记辅助选择育种技术，在水稻品种9311内成 功聚类了稻瘟病抗性基因P * 9、枯萎病抗性基因 Xa21、Xa27以及耐渍基因SwbA ,且培育出了新的 综合抗性较好的水稻新品种49311[27]。总体而言，随 着分子生物学的发展和越来越多抗病基因的鉴定与克 隆，分子标记辅助选择育种将在培育优质、稻瘟病抗性 持久的水稻品种中发挥着重要作用。4.3基因编辑技术在水稻抗稻瘟病中的运用转基因技术已广泛应用于水稻育种工作，但该技 术自身也具有一定的缺陷。一方面，外源基因随着“基 因漂流”而非人为的转人其他机体内，在植物基因组内 随机整合，容易诱发突变，造成基因库的污染。另一方 面，转基因农作物作为一种新的人造品种，在一定程度 上会破坏原有的食物链结构，引发生态环境的失衡。 此外，转基因农作物的遗传具有不稳定性，难以保障粮 食生产，进而引发社会在健康和环境安全方面对转基 因技术的怀疑，从而在社会上受到一定程度的排斥。 针对上述问题，基因编辑技术应运而生。基因编辑技 术是利用序列特异性核酸酶促使基因组内部出现 DNA双链断裂，进而诱导细胞行使内源修复功能，最 终实现对DNA特定序列的精确修饰（替换、插人或缺• 47
