免疫组化的操作流程

免疫组化操作流程

1. 70℃烤片2h（脱蜡）；

2. 石蜡切片浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min（脱蜡）；

3. 取出切片置于100%-70%各级酒精：无水乙醇Ⅰ（5 min）、Ⅱ（5 min）、95%、90%、85%、80%、70%，各3min（水化）；

4. 各级酒精水化后，置于蒸馏水中30min；

5. 高温高压抗原修复（枸橼酸钠PH6.0），水沸后4 min（自然冷却，取出片，防干片）；

切片放在枸橼酸钠盒子在高压锅里待水费后计时煮4 min，约2.5h自然冷却后，取出片，防干片；

6. 蒸馏水静止4min后， PBS静止洗2次（PBS1、2各洗5min）；

7. 3%H2O2 避光孵育30min，阻断内源性过氧化物酶； PBS静止洗2次（PBS1、2各洗一次），5min/次（取切片迅速，防干片）；

8. 5%羊血清封闭（1滴30μl），室温1h，放入湿盒，直接加一抗，无须将封闭液甩掉；

9. 一抗孵育（稀释度需摸条件）20μl, 加薄膜平放于湿盒中，4℃过夜15h；

10. PBS洗3次（PBS3、5、6各洗一次），5 min/次；

11. DAB试剂盒的A液20μl, 37℃ 30min（A液为酶标二抗）；

12. PBS洗3次（PBS4、5、6各洗一次），5 min/次；

13. 滴加预备好的显色剂DAB工作液20μl（ B:C=50:1混匀）,平放于湿盒中，室温孵育2min（B、C为显色液，与A液结合）（B、C显色液反应时间根据组织块颜色终止）；

14. 显色完全后，蒸馏水终止显色（或光镜下控制显色）；

15. 苏木素染色20s，流水洗净（染色时间根据切片染色深度终止）；

16. 1%盐酸酒精分化1-3秒（1下）（切片染色深可以稍微延长分化时间，分化目的：去除细胞膜染色，分化时间长核染色也会变浅）；

17. 水中冲洗泛蓝20 min（冲洗时间延长会使染色变深）；

18. 各级酒精（70%-100%）：70%、80%、85%、90%、95%、无水乙醇Ⅱ、Ⅰ，每级3min（脱水）；

免疫组化染色操作步骤

Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

免疫组织化学染色原理和操作步骤

一、免疫组织化学原理

免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。

免疫组化操作详解

1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右）,再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。

4. 捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.

6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

免疫组化SABC法操作流程

1、洗载玻片

将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37 oC温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2、包埋组织

先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3、切片

将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 oC温水中。

4、捞组织

当组织载玻片置于40 oC温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 oC温箱中烘干。

5、脱蜡

依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min.

6、抗原修复

脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。