二代和三代测序原理及技术详解

本技术涉及二代测序分析领域的基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。

该方法包括：获取新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最

高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；过滤

与正常样本变异位点集重合的位点；过滤未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点；过滤生殖

细胞突变和高频突变位点。本技术以PON

、以基于石蜡切片组织特征的特异性训练体细胞突

变位点过滤阈值以及以已有数据库过滤生殖细胞突变和高频突变位点作为体细胞突变检测的

过滤条件，能够快速剔除大部分由石蜡切片制备造成的假阳性结果，提高检测效率和特异

性，快速精准检测石蜡切片体细胞突变。

权利要求书

1.

基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取正常组织石蜡切片样本的测序结果，将所述测序结果与人类参考基因组比对，所得比对

数据构建正常组织石蜡切片样本的正常样本变异位点集；

分别获取同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的

测序结果，基于测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；

对比所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，

获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；

分别获取待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测

待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，得到原始变异结果；

过滤所述原始变异结果中与正常样本变异位点集重合的位点，得到第一体细胞突变结果；

过滤所述第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突

变结果；

过滤所述第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，即得待测肿瘤组织石蜡切片

样本的体细胞突变结果；

所述过滤参数包括体细胞变异位点的测序深度总和、变异等位基因频率、链偏好性、Read

朝向偏好性、测序质量值、胚系突变干扰值、污染物干扰值、碱基质量值中位数、平均比对

一代、二代、三代测序技术

(2014-01-22 10:42:13)

转载

第一代测序技术-Sanger链终止法

一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。

第二代测序技术-大规模平行测序

大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析

导读 从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。

摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1， 发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序 技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾 病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

图1：测序技术的发展历程

生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。

第一代测序技术

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森 （Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。 自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年， 完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合 成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分

为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

三代测序原理技术比较

三代测序技术和原理介绍

导读 从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。

摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，

发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序

技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾

病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森 （Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。

自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，

完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合

成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中

分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分 为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。