荧光报告载体

pRL家族海肾荧光素酶对照报告基因载体系列产品包装目录号价格pRL-SV40 Vector 20ug E2231pRL-TK Vector 20ug E2241pRL-CMV Vector 20ug E2261pRL-null Vector 20ug E2271描述：pRL家族海肾荧光素酶(Rluc)对照报告基因载体系列是设计应用于双荧光素酶报告基因检测系统的。

pRL载体提供组成性表达的海肾荧光素酶，可与一个萤火虫荧光素酶载体联合共转染哺乳动物细胞。

海肾荧光素酶的表达为使实验的萤火虫荧光素酶报告基因正态化提供内对照值。

pRL载体包含一个编码海肾荧光素酶(Rluc)的cDNA, 这个cDNA从珊瑚虫类腔肠动物海肾(Renilla reniformis)中克隆而来。

目前有四个不同的启动子载体。

其中HSV-胸腺嘧啶核苷激酶启动子(pRL-TK)相对较弱，在提供海肾荧光素酶报告基因载体的组成性表达时特别有用。

早期SV40 增强子/启动子区域(pRL-SV40)和CMV极早期增强子/启动子区域（pRL-CMV）一般提供高水平转录，因此也许不适于应用在实验载体带有强调节因子的辅助报告基因实验中。

一般，我们建议在将要应用的目标细胞中验证一个特定辅助报告基因的性能。

与修饰过的Rluc 基因一样，所有的pRL载体都从dam-/dcm-E.coli K菌株中分离得到，允许使用对dam和dcm 甲基化敏感的限制性内切酶进行消化。

特点：●在紧靠Rluc的上游有一个T7启动子，允许进行海肾荧光素酶的体外合成。

●在Rluc的下游有一个SV40的晚期poly(A)序列，提供有效的转录终止和mRNA的聚腺苷酸化。

●原核复制起点和β-内酰胺酶基因使得pRL载体可在E.coli宿主中进行选择扩增。

●为避免DNA甲基化，所有的pRL载体均从dam-/dcm-E.coli K宿主中分离得到。

操作手册：技术公告：TB237, TB238, TB239, TB240储存条件：载体存于-20℃, 细菌菌株存于-70℃。

荧光蛋白报告载体荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类具有自身天然荧光特性的蛋白质，能够在特定条件下发出可见光。

由于其独特的特性，荧光蛋白被广泛应用于生物学研究、医学诊断和生物工程等领域。

而荧光蛋白报告载体则是指将荧光蛋白基因与其他基因融合，使得该基因在表达时能够产生可见荧光信号，从而实现基因表达的可视化和定量化。

下面将介绍荧光蛋白报告载体的构建和应用过程。

1.荧光蛋白的选择荧光蛋白有多种类型可供选择，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。

在选择荧光蛋白时，需考虑其荧光强度、稳定性、激发波长和发射波长等因素，并根据实验需要进行合适的选择。

2.载体的构建将荧光蛋白基因与目标基因进行融合，需要使用合适的载体来实现。

常用的载体包括质粒、病毒载体等。

质粒载体是最常用的载体之一，可以通过分子克隆技术将荧光蛋白基因与目标基因连接起来，形成报告载体。

3.载体的转染将构建好的荧光蛋白报告载体导入到目标细胞内，实现基因的转染。

转染方法有多种，如瞬时转染、稳定转染等。

根据实验需要和细胞类型的不同，选择合适的转染方法。

4.荧光成像与分析转染后的细胞可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。

根据荧光蛋白的特性，可以通过激发荧光信号，观察细胞内目标基因的表达情况。

同时，可以利用图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，实现基因表达的定量化和定位。

5.应用领域荧光蛋白报告载体在生物学研究、医学诊断和生物工程等领域有广泛的应用。

在生物学研究中，荧光蛋白报告载体可以用于研究基因的表达和调控机制，观察细胞的生理和病理过程，探究蛋白质的定位和交互作用等。

在医学诊断中，荧光蛋白报告载体可以用于检测病原体的存在和活性，实现早期诊断和治疗。

在生物工程中，荧光蛋白报告载体可以用于基因工程的监测和优化，提高基因表达的效率和产量。

总结：荧光蛋白报告载体通过将荧光蛋白基因与目标基因融合，实现了基因表达的可视化和定量化。

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

2.有哪些海肾荧光素酶载体海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。

这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。

pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。

B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。

a pRL-TK载体pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。

b pRL-null载体pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。

3.用双报告基因有何优点一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。

将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。

海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。

在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：•快速•DLR测试不需保温或对样品作预处理。

荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。

主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法：1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。

酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-nVector or DNA x Vector mNEB Buffer I或IV 2 DNA nSpe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1Pme I 1 T4 DNA Ligase 1Total voloume 20 Total voloume 101.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。

连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。

Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。

并扩繁阳性克隆。

重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A 液B液pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μlpRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μlMimic/NC 100 nM终浓度OPTI-MEM 25 μl6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

双荧光素酶基因法载体构建双荧光素酶基因法是一种常用的基因标记技术，可以在细胞或物种中标记特定基因，方便研究基因的表达和功能。

该技术将荧光素酶基因和荧光素酶底物相结合，并通过酶学反应产生强烈的荧光信号，从而实现基因标记和检测。

本文将介绍双荧光素酶基因法载体的构建方法。

1、材料双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）双荧光素酶基因调控元件载体（pGL4.32）限制酶EcoRI和XhoIT4连接酶琼脂糖PCR扩增产物模板PCR引物大肠杆菌DH5α感受态细胞2、方法1) 双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）的构建a、制备pGL4.31载体的线性质粒选取pGL4.31载体，使用限制酶EcoRI和XhoI对其进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化出所需大小的线性DNA片段。

b、连接荧光素酶基因将线性质粒与荧光素酶基因进行T4连接酶酶切和连接，构建成双荧光素酶基因报告载体。

a、PCR扩增产物的准备选择所需的基因调控元件序列作为PCR扩增产物的模板，设计一对前后引物，在PCR 反应条件下扩增所需大小的DNA片段。

a、验证载体的构建将构建好的双荧光素酶基因报告载体和基因调控元件载体进行测序验证，确定所构建载体序列的准确性。

将所构建好的载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行筛选和扩增。

通过测序验证构建的载体与所需载体相符，符合要求的荧光素酶基因法载体已构建成功。

二、结论通过双荧光素酶基因法载体的构建，成功将荧光素酶基因和基因调控元件结合构建成标记组合载体，为后续研究基因表达和功能提供了多种方法和途径，有助于深入探究生物学领域的多项研究内容。

荧光素酶报告基因实验步骤
荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学实验，用于检测基因表达水平。

该实验利用荧光素酶作为报告基因，通过荧光素酶催化荧光素底物的反应，产生荧光信号，从而反映基因表达水平。

下面是荧光素酶报告基因实验的步骤：
1.构建荧光素酶报告基因载体
首先需要构建荧光素酶报告基因载体，该载体包含荧光素酶基因和目标基因的启动子区域。

在构建载体时，需要选择适当的启动子区域，以确保荧光素酶基因能够被有效表达。

2.转染细胞
将构建好的荧光素酶报告基因载体转染到目标细胞中。

转染方法可以选择化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。

转染后需要进行筛选，以获得稳定表达荧光素酶的细胞株。

3.添加荧光素底物
将荧光素底物添加到细胞培养基中，荧光素底物会被荧光素酶催化产生荧光信号。

荧光素底物的选择可以根据实验需要进行调整，常用的荧光素底物有Luciferin和Coelenterazine等。

4.测定荧光信号
使用荧光显微镜或荧光分析仪等设备测定荧光信号。

荧光信号的强度反映了荧光素酶的活性，从而反映了目标基因的表达水平。

荧光信号的测定需要注意控制实验条件，如荧光素底物的浓度、荧光素酶的表达水平等。

5.数据分析
根据荧光信号的强度，可以计算出目标基因的表达水平。

数据分析需要注意控制实验组和对照组的一致性，以确保实验结果的可靠性。

荧光素酶报告基因实验是一种简单、快速、灵敏的基因表达检测方法，广泛应用于分子生物学、细胞生物学、药物筛选等领域。

在实验过程中，需要注意控制实验条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。

荧光素酶报告载体
荧光素酶是一种广泛应用于生物学和医学研究中的分子探针，
可以用于检测生物学样品中特定的化合物或分子的表达和活性。

在荧光素酶应用的过程中，报告载体的选择和设计对于检测结果
的敏感度和准确性起着决定性的作用。

一、化学特性
荧光素酶因其高度特异性和灵敏度而被广泛应用，其基本结构
为蛋白质和荧光素。

荧光素酶与荧光素底物发生作用时，底物分
子被酶催化分解，从而释放光子并产生强烈的荧光信号。

荧光素
酶的荧光信号可以通过荧光显微镜或荧光光度计进行定量测量，
因此可用于监测细胞信号通路的激活、病毒感染状态、DNA合成
以及酶促反应等。

二、报告载体设计
荧光素酶报告载体是一种基因转染载体，在这种载体中，荧光
素酶基因与目的基因被连接在一起，当目的基因被激活或表达时，荧光素酶基因也随之激活或表达，从而产生荧光信号报告。

常用
的载体包括质粒和病毒载体等，具体的载体设计应根据目的基因
和实验需求进行筛选和修改。

三、应用案例
荧光素酶报告载体在生物学和医学研究中具有广泛的应用价值。

例如，在癌症研究中，荧光素酶报告载体可用于研究肿瘤细胞增
殖的机制和信号通路；在免疫学研究中，荧光素酶报告载体可用
于检测免疫细胞活性和细胞因子释放的水平；在基因治疗中，荧
光素酶报告载体可用于监测基因修饰效果和治疗效果。

综上所述，荧光素酶报告载体是一种重要的分子探针，其设计
和选择对于实验结果的准确性和敏感性具有关键性的影响。

在未
来的研究中，将会有更多的载体被设计和应用，并为生命科学和
医学领域带来更多的技术突破和创新。

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用韩芙蓉;王令;徐坤;张智英;王昕【摘要】报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效，并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆，而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。

基于非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)后，经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复；而单链退火(Single strand annealing，SSA)修复机制在引入DSBs后，理论上可以实现报告基因100%的修复，具有更高的灵敏度，有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测，为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

本研究设计并构建了3套基于 SSA 修复机制的双荧光报告载体系统，并应用mRFP-eGFP系统检测了3对ZFNs的有效活性，其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%，该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

%Reporter vector system has become an important method for measuring activity of specific nucleas-es because of its fast construction, simple modification, easy operation, economic effectiveness as well as its role in enriching positive cells with genomic modification through mediating screen of specific nucleases positive cells. After in-troducing double strand breaks (DSBs), a reporter system based on non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair can only repair maximally two thirds of reporter genes after optimization, while single strand annealing (SSA)-mediated repair can repair all reporter genes theoretically which has higher sensitivity and facilitates the de-tection ofspecific nuclease with low activity and provides an effective way to detect specific nuclease activity in genome modification studies. In this study, we designed and constructed three sets of dual-fluorescence reporter systems based on SSA repair mechanism and applied the mRFP-eGFP system in measuring the effective activity of three pairs of ZFNs, which was 8.9%,9.3%and 5.0%, respectively. Our study provides an effective way to detect the activity of nucleases.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2015(000)010【总页数】8页(P1053-1060)【关键词】SSA;双荧光报告载体系统;特异性核酸酶【作者】韩芙蓉;王令;徐坤;张智英;王昕【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100; 陕西理工学院生物科学与工程学院，汉中 723000;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100【正文语种】中文基因组编辑的传统方法有自发同源重组和逆转录病毒介导法，但应用效果不佳。