PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

授课教师常祖明学生人数55课题PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测授课类型新授课授课方法讲授、演示教学用具多媒体、实验室设备教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学会琼脂糖凝胶电泳的操作技术教学重点琼脂糖凝胶的制备及点样操作教学难点理解琼脂糖凝胶电泳的原理教学过程一、实验目的1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法二、实验原理1.DNA琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

（1）电荷效应DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。

【等电点】在某一pH的溶液中，DNA分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该DNA分子的等电点，用pI表示。

当DNA溶液pH＞pI，-当DNA溶液pH＜pI，+当DNA溶液pH=pI。

溶解度最小。

（2）分子筛效益在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比，所以不同相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。

2.溴化乙锭对DNA分子进行染色的原理观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。

三、实验器材1.电泳仪北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN型2.移液枪：5µl3.微波炉4.锥形瓶：250ml5.线手套6.容量瓶：1000ml7.紫外分析仪四、实验材料与药品实验材料：实验五中鸡血DNA PCR产物1.DNA Marker作用：主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

PCR扩增产物的电泳分析凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.(一)凝胶浓度:凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.10XTBE缓冲液的配制Tris硷，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH应为8.0～8.2)临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳1.电泳装置:电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.2.电泳方法:(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA 片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V 电压，电泳20～40min即可.(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA 序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.3.10%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.4.1XTBE电泳缓冲液5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳:根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.。

pcr扩增产物电泳条带PCR扩增产物电泳条带是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析DNA的扩增产物。

本文将详细介绍PCR扩增产物电泳条带的相关内容。

首先，PCR（聚合酶链反应）是一种体外合成DNA的技术，它可以在短时间内扩增一小段特定的DNA序列。

PCR扩增通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，DNA模板被加热至高温，使其双链解开成两条单链。

在退火步骤中，引物（即DNA扩增的起始序列）与DNA模板的互补序列结合。

在延伸步骤中，DNA聚合酶通过合成新的DNA链，从引物延伸到模板的末端。

重复这个循环多次，就可以扩增出大量的目标DNA序列。

在PCR扩增反应中，扩增产物通常是以目标DNA序列的形式存在，但也可能包含其他非特异性产物。

为了检测和分析PCR扩增产物，需要进行电泳分析。

电泳是一种利用电场作用下的DNA分子迁移性差异进行分离和检测的技术。

通常使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR产物的分离。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的PCR产物分离方法。

在琼脂糖凝胶电泳中，PCR产物被加载到琼脂糖凝胶孔中，然后施加电场，使DNA分子在凝胶中迁移。

琼脂糖凝胶的孔径大小可以调整，以实现不同大小的DNA分子的分离。

在电泳过程中，DNA分子会根据其大小和电荷迁移速率的差异，在凝胶中形成不同的条带。

较小的DNA分子迁移更快，较大的DNA分子迁移更慢。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是另一种常用的PCR产物分离方法。

与琼脂糖凝胶电泳不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质。

聚丙烯酰胺凝胶具有更高的分辨率和更好的分离效果，能够分离更小的DNA片段。

通过PCR扩增产物电泳条带的分析，可以确定PCR反应是否成功，以及目标DNA序列的大小。

通常，PCR扩增产物电泳条带会显示为明亮的条带，而非特异性产物可能显示为模糊的或多个条带。

通过与分子量标记物比较，可以确定PCR扩增产物的大小。

总之，PCR扩增产物电泳条带是一种常用的DNA分析技术，可以用于检测和分析PCR扩增产物。

实验4转基因植物PCR检测四、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测一、实验目的1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。

2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

二、原理PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。

由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一，而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。

故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。

三、试验材料提取的甘薯基因组DNA。

四、试剂4.1 PCR反应引物序列35S：5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3，//5，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，；NOS：5，-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3，//5，-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3，。

4.2 PCR反应试剂：无菌去离子水；模板DNA；20 μmol / LPCR 引物；5U/μL Taq DNA 聚合酶；2.5 mmol / L dNTPs；10×PCR 缓冲液；25 mmol / L MgCl2，25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白4.2 核酸电泳相关试剂（见实验6）五、仪器5.1 PCR扩增仪。

5.2 微量移液器。

5.3 吸头。

5.4 电泳仪。

5.5 电泳槽。

5.6 凝胶成像仪。

5.7 PCR管。

六、实验步骤6.1 转基因植物PCR基因扩增6.1.1.1 按待检样品数（每一个样品分设35S和NOS两个检测反应）并加空白对照、阴性对照、阳性对照，取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管，按下表用记号笔在管壁上编号：6.1.1.2 之后按上述顺序依次加入各PCR反应液。

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1. 掌握PCR扩增技术的基本原理2. 掌握PCR的常规操作3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用4. 了解PCR技术的应用5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1. PCR基本原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2. PCR反应体系3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。

pcr扩增实验报告篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。

2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。

二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。

在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。

降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。

溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。

如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA 的量按指数方式扩增。

经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

三、实验材料仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。