微生物的培养和应用
【学习目标】
1、掌握培养基的分类、组成、功能及配制。
2、掌握无菌技术的内容和无菌操作技术。
3、研究培养基对微生物的选择作用
4、掌握分离、纯化特定微生物的研究思路和方法，掌握从土壤中分理处能够分解尿素的细菌并进行技术的操作过程。
【要点梳理】
要点一、微生物的实验室培养
1、培养基：
（1）培养基的配制原则
①目的要明确（根据微生物的种类、培养目的等）。如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养则可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定培养基必须加入已知化学成分的物质。
②营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同。如细菌、放线菌和真菌生长的最适pH分别为：6.5～7.5、
7.5～8.5和5.0～6.0。
（2）培养基的种类和用途
（3）选择培养基和鉴别培养基应用实例
（4）培养基中的营养要素
要点诠释：
①微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。
②对异养微生物来说。含C、H、O、N的化合物既是碳源．又是氮源。
③有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，原因是它们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
2、无菌技术
（1）无菌技术的概念
在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯培养的技术，其中包括在微生物的分离、转接、保存等过程中防止其他微生物污染的手段。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的，主要包括以下几方面：
①对实验操作的空间，操作者的手和衣着，进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近或接种箱内进行。
④应避免已经灭菌处理的材料用具与周围其他物品相接触。
（2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法见下表：
注意：灭菌所依据的原理基本上都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。
（3）消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：在100℃煮沸5 min～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：在70℃～75℃煮30 min或在80℃煮15 min。可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营
养成分不被破坏。
③化学药剂消毒：使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
④紫外线消毒。
要点二、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基及纯化大肠杆菌
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
（1）培养基需冷却至50℃左右时开始倒平板
①原因：琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。
②估计培养基温度的方法：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。（2）平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）注意事项：倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。
2．纯化大肠杆菌
可以选用下述方法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯化大肠杆菌。
（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（如图所示）。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
培养基表面平行或分区划线
划线时要注意：
①几次灼烧接种环及目的：
a．取菌种之前灼烧的目的：杀死接种环上原有的微生物。
b．每次划线之前灼烧的目的：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少。
c．划线结束灼烧的目的：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
①酒精灯与培养皿的距离要合适。
②吸管头不要接触任何其他物体。 ③吸管要在酒精灯火焰周围使用。
要点三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1. 实验原理
（1）以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选尿素分解菌；有些微生物能产生并分泌脲酶，降解环境中的尿素做为其生长的氮源。
（2）尿素分解菌的鉴定——酸碱指示剂法
酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4～8.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色
（3）液体稀释涂布平板法测定微生物活菌数目 2.培养基
LB 全营养细菌培养基配方：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖 尿素培养基配方：葡萄糖、NaCl 、K 2HPO 4 、尿素、琼脂糖、酚红
要点诠释：琼脂糖和琼脂一样都是作为凝固剂来使用的，不要误以为是和葡萄糖一样提供碳源的。只是因为琼脂里还含有含氮的物质会对实验的结果造成影响。
3.实验流程
要点四、分解纤维素的微生物的分离 1.纤维素酶的作用机理
纤维素1
x C C +????
?→酶酶纤维二糖?????→葡萄糖苷酶
葡萄糖 纤维素酶是一种复合酶，由三种酶组成：C 1酶、C x 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第
三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，只有在这三种酶的协同作用下，纤维素才能被彻底水解成葡萄糖。 2.纤维素分解菌的筛选 （1）筛选原理
纤维素+刚果红→红色复合物，刚果红不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 （2）筛选方法：刚果红染色法。
在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 3.分离分解纤维素的微生物的实验设计
分离分解纤维素的微生物的实验流程示意图如下图所示：
【典型例题】
类型一：培养基的配制和微生物的营养
例1、（2014 全国大纲卷）某同学在①、②、③三种条件下培养大肠杆菌，这三种条件是：
①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物
②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
③以葡萄糖和乳糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
根据培养结果绘制的一段时间内菌体数的对数随时间变化的趋势图如下：
假设三种培养基中初始总糖量相等，则①、②、③三种条件依次对应的趋势图是
A.甲、乙、丙
B.乙、丙、甲
C.丙、甲、乙
D.丙、乙、甲
【答案】C
【解析】以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不除去代谢产物，随着营养物质的消耗和次级代谢产物的积累，大肠杆菌的生长环境不断恶化，生存阻力增大，因此种群数量达到稳定期后会出现衰亡期，故甲图对应②，反之丙图则对应①；若培养基里加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌先利用葡萄糖，葡萄糖消耗完以后，大肠杆菌会经过短期的调整，诱导合成乳糖苷酶，接着继续分解利用乳糖，最后衰亡，因此乙图对应③，故选C答案。【点评】本题考查微生物种群数量变化的相关实验。
【举一反三】：
【变式一】
（2015 江苏卷）做“微生物的分离与培养”实验时,下列叙述正确的是（）
A. 高压灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖
B. 倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C. 为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D. 用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上
【答案】D
【解析】高压灭菌加热后，先切断电源，使灭菌锅温度降至100摄氏度以下，压力表的指针归零，再打开锅盖，A错误。倒平板时，培养皿打开缝隙即可，不能完全打开，B错误。接种环需冷却后再挑取菌落，C错误。
土壤取样选择培养梯度稀释
将样品涂布到鉴别纤维素
分解菌的培养基上
挑选产生透
明圈的菌落
类型二：无菌操作技术和接种技术
例2、细菌培养过程中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌 ( )
A．接种针、手、培养基B．高压锅、手、接种针
C．培养基、手、接种针 D．接种针、手、高压锅
【答案】C
【解析】高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
【点评】此题考查学生对无菌技术的掌握。
【举一反三】：
【变式一】
下列操作与灭菌无关的是（）
A．接种前用火焰灼烧接种环
B．接种前用酒精擦拭双手
C．将平板倒置，放入培养箱中培养
D．接种在酒精灯的火焰旁完成
【答案】C
【变式二】
培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是（）
①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤
【答案】A
【变式三】
关于平板划线操作正确的是（）
A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞
C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可
D．最后将平板倒置，放在培养箱中
【答案】D
【解析】在平板划线时，已灭过菌的接种针在每次划线后，都必须用灼烧灭菌法灭菌，以防杂菌污染，A错；盛有菌种的试管在打开或重新塞棉塞前，都需通过火焰灼烧灭菌，B错；在划线过程中，培养皿盖应打开一条缝隙，进行接种，接种完毕后，迅速盖上培养皿盖，以防止杂菌污染，C错；平板凝固后，须将平板倒置。
类型三：利用选择培养基筛选菌株的实验方法和步骤
例3、探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数。
实验原理
农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下。只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。
材料用具
农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干。无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。
方法步骤
（1）倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在________操作。
（2）制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液1 mL，转至9 mL无菌水的大试管中，依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰________cm处。
（3）涂布。按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个平板。
（4）培养放人恒温箱内，在适宜温度条件下培养3 d～4 d。一般每隔________小时统计一次，选取________时的记录作为结果，这样可以防止________。
（5）细菌的计数。当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是________。（稀释度是105）
（6）预期结果。相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数________（填“多于”或“少于”）无氮培养基上的数目。理由是________。
【答案】
（1）酒精灯火焰旁
（2）1～2
（3）3 1
（4）24 菌落数目稳定因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（5）30～300 5×107
（6）多于无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存
【解析】考查微生物的分离及计数。要分离自生固氮菌，采用选择培养基分离的方法，缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物，而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是：配制无氮培养基→灭菌→倒平板→系列稀释→涂布平板→培养→观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照实验等。
【点评】本题考查微生物分离实验中对照实验的设计。
【举一反三】：
【变式一】
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（）
A．涂布了2个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是2l、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
【答案】D
【解析】在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B 不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单用3个平板的计数值来求平均值。