荧光定量PCR引物设计原则.

荧光定量引物设计原则 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

2. 产物不能形成二级结构（自由能小于mol）。

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无假基因的存在。

假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

值在58-62度之间。

17.引物设计的软件Primer 有专门针对荧光的。

用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！试剂很贵的！荧光定量PCR引物设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无假基因的存在。

假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

16.TM值在58-62度之间。

17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：①引物长度一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。

有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。

PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。

PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。

1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。

为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。

2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。

3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。

二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。

4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。

因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。

1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。

这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。

2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。

3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。

4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。

5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。

引物的互补性会干扰PCR反应的进行。

6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。

7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。

8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。

定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。

在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。

1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。

1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。

1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。

1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。

可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。

此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。

2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。

2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。

2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。

探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。

此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。

2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。

探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。

此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。

总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。

在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。

PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。

必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。

定量P C R引物探针设计原则Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

定量P C R引物探针设计原则TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】定量P C R引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。

然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。

本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。

一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。

引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。

引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。

- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。

- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。

- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。

2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。

这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。

二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。

选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。

TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。

2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。

以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。

- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。

三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。

其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。

PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。

PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。

因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。

以下是PCR引物设计的原理及原则。

一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。

引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。

较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。

2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。

引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。

此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。

3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。

引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。

4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。

引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。

二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。

在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。

2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。

3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。

4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。

5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。

荧光定量引物设计原则1. 引子设计的基础知识引子（或称引物）在荧光定量PCR中就像是厨师做菜时用的调料，缺了它，成品可就大打折扣了。

想象一下，您要做一碗美味的番茄汤，调料不到位，味道就差了。

荧光定量引物的设计也是这个道理，必须精细入微，才能达到预期的效果。

引物的作用就是帮助你找到特定的DNA片段，进而进行放大和检测。

简单来说，引物的好坏直接影响到实验结果的准确性和灵敏度。

1.1 引物的基本特性好的引物一般要有合适的长度，通常在18到25个核苷酸之间，太长了容易出现非特异性结合，太短了则不容易稳定地附着在目标DNA上。

简而言之，就是“短小精悍”才行。

另外，GC含量也是个关键因素，通常在40%到60%之间为佳。

GC含量高的引物会更稳定，因为GC配对有三条氢键，而AT配对只有两条，这就像是把你的“火锅”加了足够的底料，汤才好喝嘛！1.2 特异性与灵敏度引物设计的特异性就好比是你的探险指南，指引你找到真正的“宝藏”，如果不够特异，那你可就可能挖错地方，浪费时间和精力。

在设计引物时，要确保它能专门结合到目标序列上，而不会去“攀附”那些不相关的序列。

灵敏度则是另一回事，好的引物要能在低浓度的DNA样本中也能成功扩增，正所谓“无中生有”，有时甚至要能“柳暗花明又一村”。

2. 设计原则好的引物设计有一些原则，咱们来聊聊那些“黄金法则”。

2.1 避免二聚体在设计引物的时候，要特别注意避免二聚体的形成。

想象一下，你和朋友一起玩，“捉迷藏”，你们两个躲在同一个地方，那就很容易被找到了。

在引物设计中，二聚体就像那两个躲在一起的朋友，导致PCR失败。

所以，设计时要避免引物之间的互补区域，尽量让它们各自“独立行动”，这样才能最大限度地提高扩增效率。

2.2 合适的熔解温度（Tm）熔解温度（Tm）也是一个重要的参数，简单说就是引物在什么温度下才能牢牢地结合到目标DNA上。

通常，前引物和后引物的Tm值要相近，这样可以确保它们能在相同的温度下“工作”，就像两个舞者在同一个节奏下跳舞，才不会出现“踩脚”的情况。

精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

定量PCR引物设计原则定量PCR是一种准确测量目标序列在样本中的数量的分子生物学技术。

与定性PCR不同，定量PCR能够提供目标序列的数量信息，因此在许多实验和临床应用中具有重要意义。

在进行定量PCR时，引物的设计是非常重要的因素之一、下面是一些定量PCR引物设计的原则：1.引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。

较短的引物容易形成非特异性产物，而较长的引物则往往会降低PCR的效率。

2.引物序列选择：引物的序列应尽量选择在目标序列中的特异性区域，以确保引物能够特异性地结合目标序列而不结合其他非特异性序列。

可以通过比对目标序列与相关序列数据库来寻找特异性区域。

3.引物的GC含量：引物的GC含量通常应在40-60%之间。

较高的GC含量可以增加引物与目标序列的特异性结合，但同时也会增加引物之间的二聚体形成；较低的GC含量则可能会导致较差的引物与目标序列的匹配。

4.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度是指引物和目标序列形成稳定双链结构的温度。

引物的Tm应该尽可能接近PCR反应的最佳温度，一般在50-65摄氏度之间。

可以使用在线工具来预测引物的Tm值。

5.引物之间的互补性：引物之间的互补性会导致引物二聚体的形成，从而降低PCR效率。

因此，在设计引物时，应该避免引物之间互补性的存在。

6.引物的扩增效率：在定量PCR中，引物的扩增效率是非常重要的。

扩增效率低的引物会导致不准确的目标序列定量结果。

可以通过序列分析或前期实验来评估引物的扩增效率，并选择高效的引物进行反应。

7.引物与非特异性产物的区别：引物设计时应尽量避免与非特异性产物的区域重叠，以减少非特异性扩增的可能性。

可以通过序列比对和预测工具来评估引物与非特异性产物的区别。

8.引物的检测精度：定量PCR的精度取决于引物的特异性。

应尽量选择能够特异性地放大目标序列的引物，以避免误差的积累。

总之，定量PCR引物的设计原则是尽可能选择特异性序列作为目标，并且要注意引物长度、GC含量、熔解温度、互补性、扩增效率、与非特异性产物的区别以及检测精度。

定量PCR引物探针设计原则1.引物长度：最好控制在18-25个碱基对之间。

过短的引物会导致特异性降低，而过长的引物则会增加杂交的机会，影响PCR的特异性。

2.引物序列：引物应与目标基因序列高度匹配，避免引物与非特异性DNA结合。

引物的GC含量应在40-60%之间，以确保适当的结合力。

3.引物互补性：引物设计时，互补性不应超过3个碱基对。

互补性太高可能会导致杂交产物增多，影响PCR的特异性。

4.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55-65°C之间。

Tm值过高可能导致引物与非特异性DNA杂交，而Tm值过低可能导致引物无法精确结合目标DNA。

5.引物的位置：引物应设计在目标基因的保守区域，避免设计在多态性位点或重复序列区域。

1.引物-探针互补性：引物和探针应该具有很高的互补性，以确保探针与引物结合后能够产生一个稳定的引物-探针结合物。

2.探针设计：探针通常由一个荧光染料和一个QSY抑制剂构成。

荧光染料的选择应是稳定的、不受PCR反应条件的影响的。

QSY抑制剂充当了探针的标记基团，它通过修饰荧光染料对荧光信号进行猝灭。

3.探针-引物适配性：探针和引物之间应该是完全互补的，以确保引物和探针都能够准确结合目标DNA，并且防止任何非特异性杂交的发生。

4.简并位点：在设计探针时应避免引物和探针设计在简并位点上，这样可以确保在PCR过程中特异性扩增。

5.荧光信号强度：探针设计时还应考虑荧光信号的强度。

一般而言，较强的荧光信号会导致更高的检测灵敏度，但较低的信号可能会增加误差。

总而言之，定量PCR引物和探针的设计需要遵循一系列原则，以确保可靠性和准确性。

这些原则包括引物长度、序列、互补性和Tm值的控制，引物的位置选择以及荧光染料和QSY抑制剂的合理选择和设计。

通过遵循这些原则，可以提高定量PCR的特异性和灵敏度，并准确测量样本中的目标基因表达水平。

荧光定量PCR（qPCR）对基因表达的分析一、实验试剂SYBR Green premix（Takara，RR420A）二、试验设备和材料无RNase的离心管、PCR管、枪头。

三、操作步骤（一）引物设计原则（1）设计引物的长度一般为18–28个核苷酸。

（2）扩增产物长度80-150 bp最好，最长是300 bp。

（3）避免重复核苷酸延伸段。

（4）目标为50% GC含量，有助于防止错配稳定化。

（5）选择Tm值匹配的引物（相差在5°C范围内），60℃左右最好。

（6）避免一个Assay中采用的所有引物之间以及各引物内出现序列互补。

（二）总RNA提取（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，9767）准备工作：Buffer RL中加入50×DTT；Buffer RWB中加入无水乙醇；配制70%DEPC乙醇。

1. 动物培养细胞的 RNA 提取（1）细胞的裂解。

①倒出培养液，使用 1×PBS清洗一次。

②向培养细胞中加入适当量（Table 1 中推荐的使用量）的裂解 Buffer RL（使用前请确认已加入 50×DTT Solution），水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。

（6 孔细胞培养板每孔加入 350μL）③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

（2）裂解液室温静置2 min。

注：对于基因组含量较多的材料或者材料起始量较大时，可以直接按步骤 7 进行（否则 DNA 含量过高可能造成 gDNA Eraser Spin Column 堵塞），如基因组含量较低或材料起始量较少时，可以按步骤 3-6 进行。

（3）将gDNA Eraser Spin Column放到2 mL 的Collection Tube（试剂盒提供）上。

（4）将裂解液转移入到gDNA Eraser Spin Column中。

定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman 探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

荧光定量PCR引物设计1.靶基因序列选择：首先，需要选择靶基因的序列。

基于目标基因的功能和研究目的，可以选择编码区、非编码区或拷贝数多的部分作为靶基因序列。

同时，需要确保选择的靶基因序列在目标样品中具有适当的表达量。

2.引物长度：荧光定量PCR引物一般设计为20-30个核苷酸长，较短的引物长度可以提高反应的特异性和效率。

引物序列末端应避免过多的二聚体形成，为此通常会避免引物末端的连续相同碱基序列。

3.引物序列选择：引物序列的选择对荧光定量PCR引物设计至关重要。

具体来说，引物序列应遵循以下几个原则：(a)引物互补性：引物序列应该与模板DNA的互补序列完全匹配，以确保引物与模板的特异性结合。

(b)GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。

高GC含量有助于提高引物与模板DNA的互补性，但过高的GC含量可能导致二聚体形成和偏爱结合到AT丰富区域。

(c)引物交叉杂交：引物序列应避免与其他非特异模板DNA序列的交叉杂交，以防止假阳性结果的产生。

(d)引物长度和Tm值：引物的长度和熔解温度（Tm）应该适当。

较长的引物长度和高Tm值可以提高引物与模板DNA的特异性，但过长的引物可能影响PCR反应的效率。

4.引物间的距离：在设计荧光定量PCR引物时，引物间的距离也要考虑。

一般情况下，引物之间的距离应保持在100-200个碱基对之间，以确保引物能够同时与目标序列结合。

5.引物校正：荧光定量PCR使得可以通过相对或绝对定量来测量靶分子的数量。

为了实现准确的定量，荧光定量PCR反应中通常需要一个内部引物或基准品来作为校正。

内部引物可以校正PCR反应过程中的变异性和效率差异，提高定量结果的准确性。

总之，荧光定量PCR引物设计需要综合考虑靶基因序列的选择、引物长度和序列的合适性，以及引物间的距离和校正方法的选择等因素。

合理设计的引物可以提高荧光定量PCR的特异性和效率，实现准确的分子生物学分析结果。

PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。

在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。

引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。

引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。

GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。

通常引物的GC含量应在40%-60%之间。

2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。

引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。

3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。

引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。

在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。

探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。

探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。

常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。

2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。

一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。

3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。

引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。

4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。

精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→的DNA保持GC典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

定量 PCR 引物、探针设计原则自90 年月Taqman探针出生以来，固然荧光探针（引物）不停有新的技术出现，可是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍旧是很多实验研究人员进行定量检测的首选，这主假如因为相对于 SYBR荧光染料， Taqman探针拥有序列特异性，只联合到互补区，并且荧光信号与扩增的拷贝数拥有一一对应的关系，所以特异性强敏捷度高，并且条件优化简单；而相对于杂交探针， Taqman 探针只需设计一条探针，所以探针设计较廉价方便，并且也能达成基本的定量PCR要求。

自然 Taqman定量方法因为仍是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般 Taqman定量 PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反响系统→反响参数→重复实验，优化条件→获取曲线数据，比对标准曲线→再重复考证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中能够利用 NCBI genbank 序列以及DNAstar 等软件达成目的 DNA或许 RNA的查找与比对——这在剖析测序报告的时候相信好多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所剖析的序列在一个contig （重叠群，即染色体的一些地区中毗邻 DNA片段重叠的状况）内。

第二步：假如其余条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就能够说是定量 PCR成败的重点了，经过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，而后设计引物使其尽可能的凑近探针。

所选序列应当高度特异，尽量选择拥有最小二级构造的扩增片段——这是因为二级构造会影响反响效率，并且还会阻挡酶的扩增。

建议先进行二级构造检测，假如不可以防止二级构造，那么就要相应提升退火温度。

扩增添度应不超出 400bp，理想的最好能在 100-150bp 内，扩增片段越短，有效的扩增反响就越简单获取。

较短的扩增片段也简单保证剖析的一致性。

保持 GC含量在 20％和 80％之间， GC富含区简单产生非特异反响，进而会致使扩增效率的降低，以及出此刻荧光染料剖析中非特异信号。