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猪源益生枯草芽孢杆菌的分离鉴定及培养条件优化魏姗姗;马红霞;高云航;幺乃全;徐凤宇;李茂辉【摘要】采集健康仔猪肠道，从空肠黏膜分离到23株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌，复筛获得5株拮抗活性较高者；从中筛选出可耐受胆盐、人工胃液和肠液的菌株JN-16，分子生物学和部分生化试验鉴定结果表明：该菌为枯草芽孢杆菌。
对菌株JN-16进行抑菌培养条件优化，结果表明，以葡萄糖为碳源、大豆蛋白胨为氮源、pH为6.5的培养基在33℃或37℃下，培养24 h 时，发酵液的抑菌效果最强。
该菌株可用作饲料添加剂，为微生态制剂的研发奠定了基础。
%A total of 23 Bacillus strains antagonistic to Escherichia coli and Staphylococcus aureus were isolated from jejunal mucosa of healthy piglets,and 5 of them possessed higher antagonistic activity.The strain named JN-16 was isolat-ed and tolerant to bile salts,artificial intestinal juice and gastric juice.The results of molecular biology and biochemical ex-periments demonstrated that JN-16 was Bacillus subtilis.The results of antibacterial experiments showed that the antibacte-rial activity of broth was strongest,when the JN-16 was cultured at 33 ℃ or 37 ℃ for 24 h using glucose as carbon source,soy peptone as nitrogen source,pH=6.5.This strain could be used as feed additives,and laid foundation for devel-opment of probiotics.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】6页(P21-25,28)【关键词】枯草芽孢杆菌;生物学特性;鉴定;条件优化【作者】魏姗姗;马红霞;高云航;幺乃全;徐凤宇;李茂辉【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118;吉林正大实业有限公司，吉林长春 130052【正文语种】中文【中图分类】S816.17益生芽孢杆菌可产生脂肽、肽、磷脂、多烯、氨基酸、核酸等多种抑菌物质（Tan等，2013；Chandraleka 和 Ramya，2011；吕艳艳等，2011），具有广谱抑菌活性，且无毒、无副作用、无残留、无耐药性（Jacquet和Grimal，2012；Huyghebaet等，2011）。
微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选第二小组组长：杨泽升组员：***叶宁霍克枯草芽孢杆菌的分离和筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。
根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。
利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。
然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。
再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
3实验材料3.1选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基，配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整pH至7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
3.2溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。
3.4仪器或其他用品平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。
猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其生物特性研究袁林; 涂熠坤; 曾静; 郭建军【期刊名称】《《中国兽医杂志》》【年(卷),期】2019(055)005【总页数】5页(P9-13)【关键词】枯草芽孢杆菌; 分离; 鉴定; 16S rRNA; 菌株特性; 酶系分布【作者】袁林; 涂熠坤; 曾静; 郭建军【作者单位】江西省科学院微生物研究所江西南昌330096; 南京工业大学化学与分子工程学院江苏南京210000【正文语种】中文【中图分类】S852.42含有益生菌的微生态制剂能够改善因长期使用抗生素药物所带来的副作用,微生态制剂由于具有无药物残留、无毒副作用、细菌不产生耐药性等特点[1],且可以调节肠道微生态环境,防治动物肠道疾病,提高动物的抗病能力和生产性能[2],因此,在养殖行业具有广阔的应用前景。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,因具有改善消化道内环境、促进动物生长、提高动物机体免疫力及产生多种酶类、提高消化酶活性等功能[3],故具有广阔的发展前景,并在饲料添加剂、生物农药、污水处理、疫苗载体等[4]各方面已经得到了广泛的应用。
枯草芽孢杆菌是一类好氧产芽孢的革兰阳性杆状细菌,无荚膜,有鞭毛,能运动,广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表,无致病性[5]。
由于枯草芽孢杆菌具有生长速度快、营养简单以及耐热、可产抗逆芽孢等突出特征,在微生态制剂生产加工等环境中的易存活、定殖与繁殖,成本较低,施用方便,储存期长[6],现作为一种无毒、无害、无残留、无抗药性的绿色饲料添加剂重要菌种之一。
但目前市场上大多数商品化的作为猪饲料添加剂的枯草芽孢杆菌都是从泥土和草地等自然环境中分离出来的,要想筛选出作为猪的饲料添加剂理想的菌种,应优选来源于猪肠道,经过与猪共生长期驯化的枯草芽孢杆菌,才能够更好地适应猪体内环境、发挥更好的效果[7]。
芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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反刍动物源枯草芽孢杆菌的分离与鉴定青岛农业大学毕业论文题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名：学院：动物科技学院专业：动物医学班级： 1001学号：20105254指导教师：温建新2014年6月5日反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定动物医学专业袁如意指导教师温建新摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。
对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。
试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。
本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。
关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains fromRuminantsStudent majoring in veterinary medicine Yuan RuyiTutor Wen Jianxin Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin,penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification引言枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌[1]，可降低肠道内氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体内致病菌[2]，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。
同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活[3-5]。
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，可将淀粉转化为单糖，能提高动物对饲料中营养的消化和吸收率；其还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参加机体新陈代谢，利于动物机体吸收，使动物保持健康状态；还具有降解碳水化合物的酶如纤维素酶、葡聚糖酶[6-7]。
枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥了巨大作用，并且已经得到广泛的应用。
针对鸡、猪、水产等已有大量报道，丁祥力等利用枯草芽孢杆菌WH-5净化水产养殖厂的水[10]，魏姗姗等从健康仔猪空肠黏膜分离到23 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌[11]，虽然枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物中还没有广泛应用，但近年来，枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物养殖中的研究越来越多。
本试验从健康奶牛粪便中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考，并为枯草芽孢杆菌作为反刍动物微生态制剂的研制和应用提供依据。
1 材料与方法1.1 样品来源新鲜的荷斯坦成年牛牛粪便，取自青岛某奶牛养殖场。
1.2 主要试剂MYP、LB培养基、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、细菌微量生化鉴定管、三糖铁琼脂、革兰氏染色试剂盒均购自北京陆桥技术有限责任公司。
细菌微量生化反应管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。
0.5%沙黄、5%孔雀绿溶液自配。
1.3 仪器和设备SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司LED-2）、电热恒温培养箱（山东龙口市先科仪器公司YY0027-90）、XSP-2C生物显微镜。
1.4 方法1.4.1 菌株的分离纯化取菌液接种于MYP培养基平板上，置于37℃恒温培养箱培养18 h；挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落进行纯化培养，将分离纯化后得到的菌株命名为“菌K”。
1.4.2 染色镜检1.4.2.1染色采用革兰氏染色法，见文献[13]。
1.4.2.2 芽孢染色采用孔雀绿沙黄染色法，见文献[13]。
1.4.3 生化试验按照常规试验方法对菌K进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、产类淀粉化合物测定试验、柠檬酸盐试验、TSI试验、过氧化氢酶（触酶）试验、KOH试验、脲酶试验、明胶液化等试验。
1.4.4 16S rDNA的PCR扩增和序列分析将菌K接种于5 mL LB肉汤中摇菌10 h，取4mL菌液10000r/min离心2min，参考《精编分子生物学实验指南》的方法提取DNA。
在参考了国内外相关文献后[19]，由华大生物工程有限公司合成了一对芽孢杆菌属特异性引物：Primer 1：5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，Primer 2：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'，预期扩增片段长度为1436 bp。
PCR反应体系：总体系25μL ，DNA模板2μL，上下游引物各加1μL，10 ×buffer 2.5μL，dNTP2.5μL，Taq酶0.5μL，ddH2O15.5μL。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，95℃变性45s ，58℃退火50s，72℃延伸1min，72℃，10min，共32个循环，4℃保存。
PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
测序结果采用BLAST 软件和GenBank数据库中的国内外相关芽孢杆菌16S rDNA 的序列对比，用Clustal X Method 进行同源性比较。
1.4.5药敏试验按照扩散法在MYP培养基上进行药敏试验，见文献[13]。
1.4.6安全性试验选取体重为30~40 g的小白鼠10只，每组5只。
取菌液浓度约为1011cfu/mL 的LB肉汤，对空腹8 h的试验小鼠每天一次经口灌胃0.3 mL，同时设空白营养肉汤对照组。
每天观察和记录，14 d后结束试验，剖检观察内脏及组织器官变化。
2 结果2.1 形态学观察观察MYP培养基，为干燥型菌落，灰白色，无光泽，表面粗糙。
革兰氏染色阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形，染色为绿色，菌体呈红色。
芽孢图2-1 菌K菌落形态（1000×）。
图2-2革兰氏染色（1000×）。
图2-3 菌K芽孢染色（100×）。
2.2 生化试验结果菌K的生化试验结果见表2-1。
表2-1菌K生化试验结果菌K 菌K 菌K 葡萄+ 山梨醇+ 明胶液+蔗糖+ MR试验+ 触媒试+乳糖+ VP试验- KOH试-甘醇+ 淀粉水+ 脲酶试+麦芽糖+ 产类淀粉化合+ TSI试验A/A+；-蜜二- 吲哚试+木糖+ 柠檬酸-注：“+”表示阳性，“”表示阴性；TSI（三糖铁培养基）上反应情况：斜面/底面，A：产酸（黄色）；K：产碱（红色）；+：阳性；-：阴性。
产气；H2S根据《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌鉴定手册》[15]，上述结果均属于芽孢杆菌属的生化特性，证明分离菌为芽孢杆菌属。
图2-4甘醇、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验阳性，蜜二糖发酵试验阴性。
1. 接种菌K2.未接菌K对照21 21图2-5 山梨醇发酵试验阳性。
1. 接种菌K2.未接菌K对照图2-6木糖发酵试验为阳性。
1. 接种菌K2.未接菌K对照1 2图2-7 接种菌K的培养基呈红色，MR试验为阳性。
1. 接种菌K2.未接菌K对照图 2-8 枯草芽孢杆菌VP试验为阴性。
1. 接种菌K2.未接菌K对照图2-9在淀粉培养基培养的菌K菌落处滴加革兰氏碘液。
图2-10 5min后，革兰氏碘液消失，菌K淀粉水解试验为阳性。
21 21滴加碘液碘液消图2-11接种菌K 的试管戊醇层呈玫瑰红色，吲哚试验为阳性。
1. 接种菌K2.未接菌K 对照图2-13 接种菌K 的西蒙氏培养基仍为草绿色，柠檬酸盐试验为阴性。
1. 接种菌K 2.未接菌K 对照图2-14 接种菌K 的三糖铁培养基斜面和底面均为黄色，并且产气。
1. 接种菌K 2.未接菌K 对照图2-12 接种菌K 的培养液滴加碘液后为淡蓝色，产类淀粉化合物测定试验阳性。
1. 接种菌K 2.未接菌K 对照2112空白对照21 212.3 PCR 鉴定结果对菌K 进行16S rDNA 的PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500bp 左右有特异性条带（如图2-29）。
图2-17 接种菌K 的尿素酶发酵管呈浅粉红色，脲酶试验阳性。
