《免疫血清的制备》PPT课件

（六）亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物学特 异性，即生物分子间所具有的专一性亲 和力而设计的层析技术。例如抗原和抗 体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、 DNA 和 RNA 、激素和受体等 之间有特 殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧 密地结合成复合物。如果将复合物的已 知一 方固定在固相载体上,则可从溶液 中专一性地分离和提纯另一方。
上清液中含有 可溶性抗原
上清 1万—2万转/分，20到30分钟
沉淀
2. 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或 病理细胞 ( 如肿瘤细胞 )。
(1) 反复冻融法；(2) 超声破碎法；(3) 自溶 法；(4) 酶处理法；(5) 表面活性剂处理法。
( 二 ) 超速离心分离法
绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真 菌抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、 酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗 原。
（一） 组织和细胞粗抗原的制备
1. 组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜
的或低温保存的。
高速组织捣碎机
器官或者组织
处理
粉碎 研磨法
离心3000r/min，10分钟
一、佐剂的种类
1. 具有免疫原性的佐剂 如卡介苗、枯草 分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 革兰阴性杆菌内毒素 ( 脂多糖 ) 和细胞 因子等。
2. 非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、 磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、 藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。

组织和细胞成分混合抗原制备程序
所用材料必须是新鲜或低温保存的
洗去血迹 及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN2
去除包 膜或结 缔组织
冷浴中组织剪碎
装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液
上清液 澄清
去除细胞碎片 及微小组织
3000r／min×10min
取上清液
离心
及评价
细胞破碎技术
1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理
亲和层析法示意图
正常细胞 标记细胞 标记细胞 加入特异 其它蛋白 SDS-PAGE
＋ 洗滴
被酶裂解 性抗体 洗涤流失 分离蛋白
核酸抗原制备
•大分子的核酸具有免疫原性。 •提取核酸的主要步骤：
破碎细胞
核酸从细胞中游离出来 酚和氯仿
酸沉淀核
除去蛋白质 乙醇
类脂多糖抗原制备
•苯酚法提取LPS： 同温的苯酚
• 常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。
• 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 • 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
3．凝胶层析法（凝胶过滤法） •原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种
分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。
干燥菌体 或湿菌体
水中 混匀
加热
Байду номын сангаас
激烈搅匀 冰水 加热5min 急冷

鉴定
水中
一滴 乳剂
乳剂不散 浮于液面
卡介苗
弗氏完全佐剂
•作用大于不完全佐剂 •局部形成肉芽种和溃疡 •不能用于人体
4.佐剂应用原则和评价
•目的:①增强抗原对机体的免疫原性； ②增强抗体的产生能力； ③为制备出高效价的免疫血清； ④增强可溶性抗原的免疫原性； ⑤在某种情况下，改变Ag免疫应答类型； ⑥延长抗原在免疫动物的时间； ⑦改变抗原的分布； ⑧增强局部对变应原的超敏反情况；
2．氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。
3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。
酶水解免疫球蛋白示意图
胃蛋白酶 (pepsin)
Fc段，用 以制备抗 重链血清
F(ab’)2， 常作为抗 体试剂用 于试验
氧化法和还原法评价
1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破坏。
干燥菌体 或湿菌体
水中 混匀
加热
激烈搅匀 冰水 加热5min 急冷
上层的水层(含LPS) 下层的酚层
离心 降至10℃以下
菌体残渣于底部
吸取
透析 浓缩
超速离心
水层
除酚
得纯化LPS 绞出 悬于水中
离心
LPS 在上层 沉淀的透明
胶状部内
免疫球蛋白片段制备
1．酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。
2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物
3.半抗原-载体连接方法:
载体类型
1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。
2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。

抗血清的定义
抗体
一种能够特异性结合抗原的糖蛋白 质分子。
血清
在凝固后除去凝块所得的液体，它 包含了血液中除了血细胞以外的全 部成分。
抗血清
含有大量抗体的血清，可以针对某 种抗原发挥治疗、检测等作用。
制备抗血清的步骤
1
接种抗原
2
采取免疫血清
3
纯化抗体
将抗原注射到动物体内，激发其 免疫反应。
收集动物血液，离心分离血清。
通过酒精沉淀、离子交换、分子 筛等方法纯化抗体。
抗血清的应用
1
生命科学
2
用于生物学研究，如免疫印迹、免疫组化、
酶联免疫吸附实验等。的特异性结合性进行疾 病诊断，如肝炎、梅毒等。
工业应用
广泛用于食品加工、农业生产、环境治理、 水质检测等领域。
抗血清的优势与局限性
• 治疗疑难杂症，可提高治愈率； • 结合简单，易于执行； • 具有广泛的实用性，广泛应用。 • 存在免疫原性危险； • 贮存、使用存在一定的条件和限制； • 存在着存在交叉反应、敏感度、特异性等局限性。
相关研究进展
单克隆抗体技术
可以生产效率更高、可重复性更 好、误检率更低的单抗，逐渐成 为替代抗血清的新型检测技术。
利用生物信息学方法 筛选抗体
近年来，基于大数据和人工智能 技术的抗体筛选方法不断发展， 提高了抗体筛选效率和准确性。
基因工程技术
利用融合基因、亲和受体等技术， 生产出具备高水平特异性结合活 性的重组抗体，开创了实验室制 备抗体的新领域。
总结与展望
1 优势突出
抗血清作为一种具有较长历史的免疫诊断工具，在医学、生命科学、工业等多个领域均 有重要地位。
2 挑战与机遇

根据实验需求和动物体重，合理设置 抗原的剂量，避免剂量不足或过量。
抗原的活性
确保抗原的生物学活性稳定，能够刺 激机体产生有效的免疫反应。
抗体的质量控制
抗体的特异性
确保抗体能够特异性地与目标抗原结合，避免非 特异性结合和其他干扰。
抗体的效价
评估抗体的效价，以确保其能够有效地检测和识 别目标抗原。
抗体的稳定性
3
个性化治疗
针对不同患者和病毒变异情况，开发个性化的疫 血清，以满足不同患者的治疗需求。
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同时，需要确保免疫血清的安全性和有效性。
案例三：破伤风疫血清的制备
破伤风梭菌的特点
破伤风梭菌是一种厌氧菌，在缺氧环境下生长繁殖，产生破伤风痉挛毒素，导致动物出现 肌肉痉挛等症状。
破伤风疫血清制备流程
采集破伤风梭菌样本，进行细菌培养和增殖，提取细菌抗原，与动物免疫原进行免疫反应 ，收集免疫血清，进行纯化和灭活处理。
结构和功能。
02
疫血清的制备过程
抗原的制备
01
02
03
抗原来源
选择适当的病原体作为抗 原来源，如病毒、细菌或 毒素等。
抗原提取
采用物理、化学或生物方 法提取抗原成分。
纯化与标准化
对提取的抗原进行纯化， 确保抗原的纯度和浓度达 到标准。
抗体的制备
免疫原性检测
对制备的抗原进行免疫原 性检测，确保其能够引发 免疫反应。
确保抗体在储存和运输过程中保持稳定，不易降 解或失活。
血清的质量检测
血清学检测
通过血清学检测方法，如ELISA、Western blot等，对血清中的 抗体进行定量和定性分析。