下载文档原格式
利用PCR技术进行基因检测与定量PCR（聚合酶链式反应）技术是一种广泛应用于生物学领域的分子生物学技术，它通过复制和扩增DNA片段，使得微量的DNA可以被放大到足够的数量，从而实现对基因的检测与定量。
PCR技术的应用范围非常广泛，包括基因突变检测、疾病诊断、基因表达定量等。
PCR技术的基本原理是在一系列温度循环中，利用DNA聚合酶酶的催化作用，通过DNA的复制和扩增，从而产生大量的目标DNA片段。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在PCR反应开始时，反应混合物中的DNA双链会经历变性步骤，即高温使得DNA双链解开，形成两个单链DNA模板。
接下来，在退火步骤中，降低温度使得引物与目标DNA片段的互补序列结合，形成引物-目标DNA片段复合物。
最后，在延伸步骤中，将温度升高至DNA聚合酶的最适工作温度，使其能够在引物的引导下，沿着目标DNA片段的模板链合成新的DNA链。
这样，每一个PCR循环后，目标DNA片段的数量就会翻倍，经过多个循环后，可以得到大量的目标DNA。
利用PCR技术进行基因检测时，首先需要设计引物，引物的选择至关重要。
引物应该与目标基因的序列互补，并且不与其他非目标DNA序列互补。
通过合理设计引物，可以确保PCR反应只扩增出目标基因的片段，避免了其他非目标DNA的干扰。
PCR技术在基因突变检测中有着广泛的应用。
基因突变是导致遗传病和肿瘤等疾病发生的重要原因。
通过PCR技术，可以扩增出含有突变位点的DNA片段，并通过测序等方法进行分析，从而确定基因是否存在突变。
这种方法不仅可以用于疾病的诊断，还可以用于基因的遗传性状研究和亲子鉴定等领域。
此外，PCR技术还可以用于基因表达定量。
基因表达是指基因在细胞中转录和翻译的过程，它决定了细胞的功能和特性。
通过PCR技术，可以扩增出目标基因的cDNA（互补DNA），并通过定量PCR等方法，测量目标基因的表达水平。
这种方法可以帮助科研人员研究基因的功能和调控机制，从而深入了解生物体内的生命活动。
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
引物设计的原理与方法引物设计是指为了在PCR、荧光定量PCR、基因克隆、基因表达、基因测序等分子生物学实验中特异性地扩增DNA序列或检测特定DNA序列而设计的一对或多对寡核苷酸。
引物设计的原理是基于两个核心要素：特异性和效能性。
特异性指引物与目标DNA序列完全互补，没有或只有微小的不匹配，以确保扩增或检测的特异性；效能性指引物的长度、GC含量、无特异结构和互补等因素需要优化，以提高PCR的效率和产物的质量。
1.模板DNA序列分析：通过对目标DNA序列进行分析，选择合适的扩增区域。
可根据目标序列的功能域、暴露度、多样性等特点进行选择。
2.引物长度和GC含量的优化：引物的长度通常在18-25个核苷酸之间，GC含量一般在40%-60%之间。
过长或过短的引物可能导致特异性和效率下降。
3.引物间的特异性检测：使用基因组数据库进行BLAST或其他比对算法的分析，检测引物是否有特异性。
确保引物的特异性是避免非特异扩增或检测的重要因素。
4. 引物设计软件的应用：目前市场上有很多引物设计软件，如Primer3、Beacon Designer、OligoAnalyzer等。
这些软件通过输入目标序列，自动生成引物并进行特异性和效能性的评估和预测。
5.引物的互补性检测：引物间的互补性会导致多聚体的形成，降低PCR效率和特异性。
可以使用软件或实验方法，如熔解曲线分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，来检测引物间的互补性。
6.实验证明和优化：设计好的引物需要经过实验证明，通过PCR或其他检测方法来验证引物的特异性和效能性。
如果引物不符合要求，可以进行引物的调整和优化。
综上所述，引物设计的原理是基于特异性和效能性，方法包括模板DNA序列分析、引物长度和GC含量的优化、引物间的特异性检测、引物设计软件的应用、引物的互补性检测和实验证明和优化。
这些方法可以帮助科研人员设计特异性和效能性较好的引物，以提高实验的成功率和准确性。
pcr操作流程测序方法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR操作流程通常包括DNA模板的提取、PCR试剂的配制、PCR反应的进行和PCR产物的分析等步骤。
在PCR反应中，DNA模板通过热循环反复复制，最终得到大量目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
PCR操作流程的第一步是DNA模板的提取。
DNA模板可以是从细胞、组织、血液等样本中提取的DNA。
提取DNA的方法包括酚氯仿法、琼脂糖凝胶法、商业DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要经过定量和纯化处理，以确保PCR反应的准确性和稳定性。
第二步是PCR试剂的配制。
PCR反应需要包括DNA模板、引物、核酸酶、缓冲液、dNTPs等组分。
引物是PCR反应的关键组分，它们是用于引导DNA合成的短寡核苷酸序列。
引物的设计需要考虑到目标DNA片段的长度、GC含量、Tm值等因素。
在配制PCR试剂时，需要根据实验设计和引物设计的要求，精确称量和混合试剂。
第三步是PCR反应的进行。
PCR反应通常在热循环仪中进行，包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系被加热至95℃，使DNA双链解旋成单链。
在退火步骤中，反应体系被降温至引物的Tm值，引物与DNA模板结合。
在延伸步骤中，核酸酶在适温下合成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，每个循环会使目标DNA片段数量倍增。
最后一步是PCR产物的分析。
PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR、测序等方法进行分析。
琼脂糖凝胶电泳可以用于检测PCR产物的大小和纯度。
实时荧光定量PCR可以用于定量PCR产物的数量。
测序可以用于确定PCR产物的序列。
通过这些分析方法，可以验证PCR反应的成功性和准确性。
总的来说，PCR操作流程是一个重要的实验技术，可以用于扩增DNA片段、检测基因变异、诊断疾病等。
熟练掌握PCR技术的操作流程，可以为科研工作和临床诊断提供有力的支持。
临床分子生物学1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。
（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。
同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。
理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。
荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。
在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。
为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。
基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。
基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。
荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。
（2）方法：1、引物设计遵守的原则2、探针设计遵守的原则3、RNA提取4、逆转录逆转录成cDNA5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。
PCR实验的深度解析引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学中广泛使用的体外核酸扩增技术。
自1983年由Kary Mullis首次提出以来，PCR技术已经在生物医学研究、临床诊断和法医鉴定等领域发挥了重要作用。
本文将详细阐述PCR实验的相关知识点，以期帮助读者深入理解并掌握这一关键技术。
一、PCR的基本原理PCR过程主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性阶段，双链DNA被加热至90-95℃，使两条互补链分开；在退火阶段，温度降低至40-60℃，引物与模板DNA通过碱基配对结合；在延伸阶段，DNA聚合酶在适宜的温度下催化dNTPs加入到引物3'端，形成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，使得目的基因得以指数级扩增。
二、PCR实验的主要步骤1. 设计引物：根据需要扩增的目标区域设计一对正反向引物，引物长度通常为18-25个核苷酸，Tm值一般在55-65℃之间。
2. 制备反应体系：包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和热稳定DNA聚合酶等成分。
3. PCR程序设置：设定各步的温度和时间，如变性95℃ 30s，退火55℃30s，延伸72℃ 1min，循环30-35次。
4. PCR产物检测：常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR等。
三、影响PCR的因素1. 引物的设计：引物的特异性和亲和力直接影响PCR的效率和准确性。
2. 反应条件：包括Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板浓度和循环次数等因素，需根据实际情况进行优化。
3. 污染控制：PCR实验对污染极为敏感，操作过程中应严格遵守无菌操作规程。
四、PCR的应用1. 基因克隆：通过PCR扩增特定基因片段，用于后续的基因克隆和表达。
2. 基因测序：通过PCR扩增目标基因，进行序列分析。
3. 病原体检测：利用PCR技术检测病毒、细菌等病原体。
4. 法医鉴定：利用STR分型技术进行个体识别。
实时荧光定量PCR的应用和进展实时荧光定量PCR是一种先进的生物技术，广泛应用于各个研究领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR的应用领域、技术原理、实验流程以及应用前景。
实时荧光定量PCR在许多领域都有广泛的应用，如基因表达研究、病毒检测、基因突变分析、基因克隆和定量分析等。
基因表达研究：实时荧光定量PCR可以用于检测特定基因在不同组织或处理条件下的表达情况，有助于了解基因的功能和调控机制。
病毒检测：实时荧光定量PCR是一种非常灵敏的病毒检测方法，可快速、准确地检测出病毒的复制和含量，对于疫情防控和治疗具有重要意义。
基因突变分析：实时荧光定量PCR结合特异性探针技术，可以用于检测基因突变，对于遗传学研究和疾病诊断具有重要价值。
基因克隆和定量分析：实时荧光定量PCR可以用于基因克隆和定量分析，帮助研究人员了解基因的序列和功能，为基因治疗和药物研发提供支持。
实时荧光定量PCR的技术原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号进行检测和分析。
在PCR扩增过程中，特异性荧光探针与目标DNA序列结合，探针上的荧光基团在特定光源的照射下发出荧光，通过检测荧光信号的强度可以确定目标DNA的含量。
同时，通过对起始模板的定量，可以计算出目标DNA的起始拷贝数。
由于荧光信号的特异性，该技术具有高灵敏度、高准确性和高特异性。
实时荧光定量PCR的实验流程包括以下几个步骤：设计特异性引物和荧光探针：根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针，以确保引物和探针能够与目标DNA准确结合。
样品处理：将待测样品进行处理，提取出其中的DNA。
配置PCR反应液：将PCR反应液进行配置，包括dNTPs、Taq酶、特异性引物、荧光探针和DNA模板等。
PCR扩增：在PCR仪中进行扩增，记录每个循环中的荧光信号强度。
数据分析和解释：通过对荧光信号强度的分析和解释，可以得到目标DNA的起始拷贝数和相对表达量。
在设计引物和探针时，要确保其与目标DNA序列的特异性结合，避免非特异性结合造成的误差。
基因测序和基因表达的定量分析随着现代科技的飞速发展，人类对于基因的研究也有了重大进展。
其中，基因测序和基因表达定量分析是当前最具有前瞻性和研究价值的两个方向。
本文将分别介绍基因测序和基因表达定量分析的相关知识，并探讨其在医学、生物学等领域的应用前景。
一、基因测序基因测序是指利用现代科技手段，对人类基因组或者其他生物体的基因进行全面或局部的测定、分析和解码。
目前，常用的基因测序技术包括Sanger测序法、Illumina测序法、Ion Torrent测序法、PacBio测序法、Nanopore测序法等。
其中，Illumina测序法是目前使用最广泛的基因测序技术之一。
该技术具有高通量、高精度、低成本等优点，已经被广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等研究领域。
通过对某一生物体基因组进行全面测序，可以揭示出其基因结构、基因编码信息、重要的调控元件等相关信息。
这些信息对于深入研究人类疾病、基因进化、种群遗传学等方面都有着重要意义。
二、基因表达定量分析基因表达定量分析是指通过测定生物体在不同状态下的基因表达水平，进而探究其生物功能和调控机制的一种方法。
目前，常用的基因表达定量分析技术包括实时荧光定量PCR、microarray芯片、RNA序列（RNA-seq）等。
实时荧光定量PCR技术可以对少量样本进行基因表达定量检测，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等特点。
但同时该技术只能测定几十个基因，并不能全面反映基因表达状态。
而microarray芯片技术可以同时检测几千个基因的表达水平，能够全面而快速地获得一个生物体在某一状态下的基因表达谱。
但该技术成本较高，并且存在芯片设计和数据分析等技术难题。
相较之下，RNA-seq技术是具备高通量、高准确、高灵敏等特点的一种基因表达定量分析技术。
该技术不依赖于芯片设计，能够覆盖全基因组范围内的RNA转录本，同时还能够检测到新型RNA组分、外源RNA以及RNA编辑等信息。
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
PCR的类型有哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于生物学、医学、农业等领域。
它的主要作用是通过扩增DNA片段，以便进行进一步的研究和分析。
PCR 技术根据具体的应用需求，有多种类型。
1. 标准PCR标准PCR是最常见的PCR类型，它包括以下几个步骤：变性、扩增和延伸。
首先，将DNA样本加热至高温，使双链DNA解旋成单链。
然后，通过添加引物和DNA聚合酶来扩增目标DNA片段。
最后，通过在适宜的温度下延伸引物，合成一个完整的DNA复制物。
标准PCR在基因检测、疾病诊断和遗传变异分析等方面具有广泛的应用。
2. 实时荧光PCR实时荧光PCR又称荧光定量PCR（qPCR），它能够在PCR过程中即时监测DNA扩增的过程。
与标准PCR不同，实时荧光PCR在扩增过程中通过添加一种特殊的荧光探针来标记目标DNA的数量。
在每一次扩增周期后，荧光信号会被仪器进行实时监测和记录。
实时荧光PCR在基因表达分析、病原体检测和药物研发等方面具有重要作用。
其快速、准确和高灵敏度的特点使其成为现代生物学研究的重要工具。
3. 逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA的反向转录过程，再通过PCR 进行扩增的技术。
它主要用于研究和分析RNA的转录水平和基因表达。
首先，RNA通过逆转录酶反转录成互补的DNA模板。
然后，该DNA模板进行标准PCR扩增。
逆转录PCR在病毒检测、基因表达研究和分子诊断等领域有着重要的应用。
4. 数字PCR数字PCR（dPCR）是一种基于PCR扩增原理的精确定量技术。
与传统PCR和实时荧光PCR不同，数字PCR将扩增产物分隔成大量的小容器，使每个容器只有一个或少数几个目标分子。
通过统计目标分子的存在与否，来实现精确的定量。
数字PCR在基因表达分析、种群遗传学研究和胚胎基因型鉴定等方面具有重要意义。
其高灵敏度和精确性使得数字PCR成为许多科学研究和临床试验的首选技术。
临床分子生物学1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。
（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。
同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。
理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。
荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。
在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。
为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。
基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。
基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。
荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。
（2）方法：1、引物设计遵守的原则2、探针设计遵守的原则3、RNA提取4、逆转录逆转录成cDNA5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。
（3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。
（5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。
6、 实时荧光定量PCR扩增目的基因用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5µl，分别加入30µl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。
反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。
将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。
45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。
根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。
在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。
7、基因相对拷贝数的检测与计算8、统计学分析（3）注意事项：A、在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。
B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污染。
C、操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。
每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。
D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。
E、荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。
F、配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。
G、配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。
（4）在临床与科研中的应用：• 定量检测– 绝对定量• 病原体检测• 转基因食品检测• 基因表达研究– 相对定量• 基因在不同组织中的表达差异• 药物疗效考核• (一) HBV 的检测• FQ-PCR可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数。
研究证实，当HBV-DNA大于105拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。
另外HBV-DNA 定量检测也可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。
FQ-PCR 技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测，如人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、结核杆菌(TB)、解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NCG)、人乳头瘤状病毒(HPV)等。
目前临床上正开展越来越多的基于FQ-PCR 的检测项目。
• (二) 染色体病的诊断• 1999年Lo等利用荧光定量PCR技术，分别对从香港和波士顿两个中心收集的怀有21-三体胎儿母亲的血液中胎儿细胞游离 DNA进行定量检测。
用胎儿Y染色体上的一段序列作为分子标记，运用定量PCR进行扩增，β球蛋白基因作为血浆DNA扩增的阳性对照。
结果发现，在波士顿收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离 DNA的水平是正常对照的1.97倍；在香港收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离DNA的水平是正常对照的2.46倍。
说明染色体异常的胎儿其母体血液中细胞游离DNA的水平较正常胎儿的母亲血液中的细胞游离DNA水平增高。
但是这种方法仅限于男性胎儿，对于女性患儿无特异性，尽管如此，它仍为无创性染色体异常的产前诊断提供了一种新的思路。
• (三) 单基因病的诊断• 在单基因病的诊断方面，对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光探针，然后对其进行扩增。
若有基因缺失，将无荧光的产生。
• (四) 基因表达的研究• 实时荧光定量PCR的灵敏度可检测到400个分子的mRNA，它以其精确、快速、污染小,已广泛应用于分子遗传学领域。
有的学者通过检测肿瘤相关癌基因表达的水平来判断肿瘤的微转移或预后。
• (五) 基因突变及其多态性• 荧光定量PCR运用特异性荧光探针和杂合曲线分析，用来检测突变则省事、省时、无污染，在大批量的标本检测时其优势更加明显。
• (六) 其他方面的应用• 1. 法医学应用 FQ-PCR已经开始应用于法医学个人识别和亲子鉴定，可检测微量及降解DNA，快速、简便、识别率高。
目前已有对血痕、精斑、毛发、骨及其它组织DNA 分型的研究和应用于个人识别及亲子鉴定的成功报道。
• 2. 肿瘤学研究• 意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。
1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。
• 3. 免疫组群分析• 对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。
2.基因克隆技术的原理与方法是什么？在医学上有何意义？（1）原理与方法：基因克隆(gene cloning)或DNA分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
基因克隆技术包括了一系列技术，可概括为∶分、切、连、转、选。
“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
根据目的基因的不同信息状态，可选择以下方法：（2） 在医学上的意义：在医学领域，基因克隆主要用于致病基因的克隆与鉴定分析、已知基因的克隆与表达和定位克隆等方面。
例如，可用于同种或异种器官移植、进行药物和生物制品的生产以及生物遗传疾病的预防、治疗和研究等。
同种方面：利用克隆技术培植人体皮肤进行植皮手术，尤其适用于皮肤大面积受损的患者。
异种方面：①基因敲除。
转基因过程中，外源基因插入到染色体中可能导致某内源基因失活，形成某一基因功能缺失的转基因动物的研究基因结构与功能的方法。
将已引起人排异反应的猪细胞膜上的一种糖（α-1，3-半乳糖）用基因敲除方法培育基因敲除克隆猪，或将人的基因导入其受体用于器官移植。
②微生物基因克隆主要培养优良菌株，用于发酵工程生产抗生素、干扰素、胰岛素、激素类、生长因子、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、各种疫苗、单克隆抗体（生物导弹）等生物制品的开发与生产。
总之，基因克隆技术潜力巨大，将为医学上展示无比的贡献。
3.试述SANGER DNA测序技术的原理及其在医学临床与科研中的应用。
（1）原理：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
（2）应用：Sanger测序是目前所有基因检测方法（包括荧光定量PCR中的Taqman探针法、普通PCR法、基因芯片法、二代测序法等）的金标准。
科研领域发表基因检测相关文章，通常需要有Sanger测序验证数据予以支持。
1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测 Sanger测序已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。
比如对BRCA基因或APC基因的检测分析，可用于早期发现乳腺癌或结肠癌的易感人群，从而对这些人群采取必要的干预措施。
Sanger 测序还可以对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，例如在非小细胞肺癌的治疗中，靶向药吉非替尼/厄洛替尼用药前必须要检测EGFR基因的状态，可以针对EGFR基因突变热点所在的第18，19，20，21外显子设计特异性扩增和测序引物进行直接测序。
