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超氧化物歧化酶（SOD）的生产

SOD知识简介

SOD的制备

SOD使用及生产时注意事项

1.SOD的概念

超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。

2.SOD的分类

按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种。

3.SOD的理化

3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性长时间用过氧化氢处理可使 CuZn-SOD

和 Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响。

3.2 SOD的吸收光谱特性

CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，

它在280 nm处并没有最大吸收峰。

CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右， 这反映了酶分子中

Cu2+的光学特性。

3.3 SOD稳定性及影响因素

PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.3～9.6间催化性能良好，在pH4.5～

pH11间能稳定存在。pH3.6时， CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。

SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到

95℃, 其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用

4.SOD的作用

它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应， 即催化超氧阴离子自由基O2-·发生

歧化反应， 从而清除O2-·，2O2-·+2H+→H2O2+O2， 在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。

实训目的

（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

（3）掌握离心机的使用。

实训原理

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。

实训器材

大蒜，冷丙酮 ， 磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)

氯仿-乙醇混合液

邻苯三酚

浓盐酸仪器：

天平、 石英砂、 研钵、 冷冻离心机、 50mL离心管 （ 8）、 紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶（8个）、 玻璃棒 （8根）、 试剂瓶250mL（3个）、

500mL （ 3个）、250mL烧杯 （16个）、试管带胶塞(80根)、移液管(5根)

1.SOD酶的提取

称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。

2.去除杂蛋白

上清液中加入0.25倍体积的氯仿——乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，

放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液

3.SOD酶的沉淀分离

粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min

离心15min，得到SOD酶沉淀

4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。

5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量

6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。

粗酶液活性测定：

提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下：

加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。

试剂/ml 空白管 对照管OD1 提取液OD2 粗酶液OD2 酶液OD2

PH8.3缓冲液 3 3 3 3 3

SOD提取液 0 0 0.1 0.1 0.1

蒸馏水 2 1.8 1.7 1.7 1.7

室温放置20min

邻苯三酚 0 0.2 0.2 0.2 0.2

溶液中可溶性蛋白含量测定：

分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液 、 各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。

提取液稀释：50 ×

粗酶液稀释：20 ×

酶液稀释：10 ×

计算

酶活力单位

提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

总活力

提取液总活力U=活力单位×总体积=

粗酶液总活力=活力单位×总体积=

酶液总活力=活力单位×总体积=

比活力

提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

纯化倍数

粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力

回收率

粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力

SOD使用及生产时的注意事项

1.SOD的安全性

大量试验和临床应用表明， 无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无

毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质， 但却未发现具有抗原性， 其原因也正在进一步研究中。

2.SOD生产时的注意事项

2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底

2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等

2.3 要学会正确使用分光光度计

2.4冷丙酮，一般用于细胞或组织固定，在作冰冻切片免疫组化的试验中我们经常用到，一般就是在切片前将丙酮放于4度冰箱就可以了，固定时一定要根据你所作材料确定固定时间，因为会引起组织萎缩。

2.5在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另一个原因。

2.6在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；

2.7在操作工程中，每一步骤做到准确。

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SOD系列封装

SOD系列封装

Min

Max

Min

Max

A1.0501.2500.0410.049

A10.0000.1000.0000.004

A21.0501.1500.0410.045

b0.4500.6500.0180.026

c0.0800.1500.0030.006

D1.5001.7000.0590.067

E2.6002.8000.1020.110

E13.5503.8500.1400.152

L

L10.2500.4500.0100.018

θ0°8°0°8°0.500 REF0.020 REFSymbolDimensions In MillimetersDimensions In Inches

MinMaxMinMax

A1.0000.039A10.0000.1000.0000.004A20.8000.9000.0310.035b0.2500.3500.0100.014c0.0800.1500.0030.006D1.2001.4000.0470.055E1.6001.8000.0630.071E12.5002.7000.0980.106LL10.2500.4000.0100.016θ0°8°0°8°0.475 REF0.019 REFSymbolDimensions In MillimetersDimensions In Inches

Min

Max

Min

Max

A0.5100.7700.0200.031

A10.5000.7000.0200.028

b0.2500.3500.0100.014

c0.0800.1500.0030.006

D0.7500.8500.0300.033

E1.1001.3000.0430.051

E11.5001.7000.0590.067

E2

L0.0100.0700.0010.003

θ7° REFSymbolDimensions In MillimetersDimensions In Inches

7° REF0.200 REF0.008 REF

什么是SOD

什么是SOD

什么是SOD？

超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,

EC1.15.1.1, SOD）是1938年首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。

SOD是Super Oxide Dismutase 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！

SOD类型：超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。

sod的主要组成成分

sod的主要组成成分

sod的主要组成成分

SOD的主要组成成分

SOD，即超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），是一种重要的抗氧化酶，具有清除体内自由基的功能。它是由多种氨基酸组成的蛋白质，主要包括铜酶和锰酶两个亚型。下面将详细介绍SOD的主要组成成分。

一、铜酶SOD

铜酶SOD是SOD中的一种重要亚型，其主要组成成分是由铜离子催化的蛋白质。铜酶SOD主要存在于细胞质中，可以分为Cu/ZnSOD和EcSOD两种类型。

1. Cu/ZnSOD

Cu/ZnSOD是一种含有铜和锌的酶，由两个亚单位组成。其中一个亚单位含有一个铜离子，另一个亚单位含有一个锌离子。这种SOD主要存在于细胞质中，对于清除细胞内的超氧自由基具有重要作用。

2. EcSOD

EcSOD是一种含有铜离子的胞外SOD，主要存在于细胞外基质中。它可以通过血液循环到达身体各个组织和器官，发挥抗氧化的作用。EcSOD的存在可以保护细胞膜和胞外基质免受氧化损伤。

二、锰酶SOD 锰酶SOD是另一种重要的SOD亚型，其主要组成成分是由锰离子催化的蛋白质。锰酶SOD主要存在于线粒体中，对于清除线粒体内产生的超氧自由基具有重要作用。

三、其他成分

除了铜酶和锰酶，SOD还含有一些其他辅助成分，如协同因子和辅酶。这些辅助成分能够提高SOD的活性和稳定性，增强其抗氧化能力。

SOD的主要组成成分包括铜酶SOD和锰酶SOD两个亚型。铜酶SOD主要存在于细胞质中，包括Cu/ZnSOD和EcSOD两种类型；锰酶SOD主要存在于线粒体中。除了铜酶和锰酶，SOD还含有一些辅助成分。这些成分共同作用，发挥SOD的抗氧化功能，保护身体免受自由基的伤害。通过摄入富含SOD的食物或补充SOD，可以增加体内SOD的含量，提高抗氧化能力，维护身体健康。

SOD_测定方法

SOD_测定方法

SOD_测定方法

SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。SOD的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。

1.超氧根自由基抑制法：

该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。超氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。超氧根自由基抑制法具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一

2.X射线法：

该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。

3.含氮蓝法：

含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生紫色的还原型NBT。SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。

4.电化学法：

该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。在电极表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。 这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。