SOD测定方法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法

2009年12月08日 16:17

法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，

测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法

1. 方法提要

在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生

，

将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭 ，SOD通过催化

歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器

荧光灯管。

离心机。

分光光度计。 pH计。

3. 试剂

（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤

（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25~30μL酶液。在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。停止光照。在560nm波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。

5. 结果计算

以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位。按下式计算：

式中 s——样品照光后的透光度；

a——未加酶之反应液照光后透光度；

b——未加酶之反应液照光前透光度；

n——酶液稀释倍数。

样品酶活单位表示：SOD酶活单位（U）/g干重（g鲜重或g蛋白）。 6. 注释

（1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。

（2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。

（二）连苯三酚自氧化法

1. 方法提要

连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 ，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化 生成O2与H2O2，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。

2. 仪器

紫外分光光度计。

pH计。

3. 试剂

（1）连苯三酚，K2HPO4·3H2O，KH2PO4，HCl均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）连苯三酚液：用1×10-2mol/L HCl将之配成浓度5×10-2mol/L连苯三酚液。

（3）pH8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液。

4. 测定步骤

（1）酶液的制备：除使用以上K2HPO4- KH2PO4缓冲液外，其他同氮蓝四唑法。

（2）连苯三酚自氧化速率的测定：取4.5Ml ph8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4-

KH2PO4缓冲液，在25℃水浴中保温15min，加入10μL5×10-2mol/L连苯三酚液，迅速摇匀（空白以K2HPO4- KH2PO4缓冲液代替），倒入光径1cm的比色杯内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次。计算线形范围内每1min A的增值，此即为连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。

（3）酶活测定：测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，在加入连苯三酚之前，先加入待测SOD酶液，缓冲液减少相应体积。计算加酶后测连苯三酚自氧化速率，按以下公式计算酶活。

5. 结果计算

样品酶活单位表示同氮蓝四唑法。

式中 A420nm/min——酶样品在420nm处每分钟光密度变化值；

V——反应液体积：

n——酶液稀释倍数。

2、

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定

[原理]

超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。

SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。

在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。

酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

[方法和步骤]

1、从猪血中提取SOD

（1） （1）分离血球

取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。

（2）除血红蛋白

红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

（3）热变性

上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

（4）沉淀

清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

2、SOD酶活性测定

（1）邻苯三酚自氧化速率的测定

取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL）

pH8.2、50mmol/L

Tris-HCl 2.98 2.98

10mmol/L HCl 0.02

0.01

50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01

（2）、SOD样液的活性测定

样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。

试剂 空白管（mL） 样品管（mL）

pH8.2、50mmol/L 2.98 2.98