关键词：木聚糖降解菌；筛选；分子鉴定；木聚糖酶；酶活
0 引言 纤维素类物质是一类大量存在而又可再生的重要潜在资源，半纤维素占总纤维素的15%~30%，其中主要成分是木聚糖。与纤维素相比，半纤维素更易为微生物所降解和转化[1]。
该酶具有广泛的应用前景[2]
，研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichoderma sp.)等真菌及短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。
糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要从宝天曼森林腐木中富集、分离、筛选出产木聚糖酶菌株，并分析它们木聚糖酶的酶
活力大小，找出酶活力较高的分离菌株。最后通过分子生物学方法测定分离菌株的26S rDNA 序列并对其进行序列相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。
材料与方法
样品
取自实验室保存的宝天曼地区采集的腐木。
试剂
溴钾酚绿、1%刚果红溶液、1 mol/L NaCl 溶液、柠檬酸缓冲液、DNS 试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCR Magic Mix2.0、NL 1、引物NL 4、TAE 缓冲液、琼脂糖凝胶、EB 试剂。 培养基[3]
木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80 μL/100 mL)； 0.5%2%、80 μL/100 mL ）； 1%、（80
mL ）；
0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉μL/100 mL ）； 1.4 菌株筛选[4,5] 1.4.1 富集培养
取7支干净小试管，向每支试管中分装入3～5 mL 富集培养基，于121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min 。用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28 ℃温箱中富集培养2～3 d 。 1.4.2 平板分离
对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100 μL 的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d 。 1.4.3 纯化菌种
根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28 ℃温箱
中倒置培养2～3 d 。按照同样的方法划线2～3次后即可得到纯菌落。
用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d 。待菌落长大后用1%刚果红进行活性染色30 min ，倾去染液，再用1 mol/L NaCl 溶液漂洗1 h ，观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4 ℃冰箱中保存备用。
1.5 木聚糖酶活力的测定
1.5.1 木糖标准曲线的制备 取烘干好的木糖0.1000 g 溶解于蒸馏水中后，100 mL ，得到1 mg/mL 的木糖溶液。用木糖制备标准曲线的体系见表
表1 制备木糖标准曲线的溶液体系
（单位：
mL ）
编号 0 1 2 3 4 5 6 木糖标准液 蒸馏水 DNS
0 2.0 1.5
0.2 1.8 1.5
0.4 1.6 1.5
0.6 1.4 1.5
0.8 1.2 1.5
1.0 1.0 1.5
1.2 0.8 1.5
注：表中所用试剂为纯试剂
7支带刻度的平底试管，编号为1～7，分别加入上述溶液。于沸水浴5 min 后，立即放入冷水中冷却，加蒸馏水定容至25 mL ，用TU-1901540 nm 波长下测OD 值并制作工作曲线备用。 摇瓶培养
取一环旺盛生长于斜面培养基上的菌种接种到已灭菌的种子培养基中，28 ℃、180 r/min 进行三角瓶摇床培养24 h ，取2 mL 菌液加入已灭菌的发酵培养基中28 ℃，180 r/min 摇床培养48 h 。 1.5.3 木聚糖酶粗酶液的制备
取5 mL 发酵培养基菌液于已灭菌的10 mL 离心管中，在4 ℃离心机中6000 rpm 离心20 min ，转移上清至另一离心管，则为所需的粗酶液。取各酶液1 mL 装入1.5 mL 离心管中沸水浴煮沸10 min 得到失活酶液作为空白对照。 1.5.4 木聚糖酶酶活力的测定[6]
取25 mL具盖带刻度的平底试管，加入1.5 mL 1%木聚糖柠檬酸缓冲液于50 ℃水浴预热15 min，再加入0.5 mL相应酶液(对照中加入0.5 mL灭活酶液)，50 ℃水浴保温30 min(隔几分钟震荡数次)。然后加入1.5 mL的DNS试剂，沸水浴煮沸5 min，立即放入冷水中冷却，并定容至25 mL。
………。
1.6菌株的分子鉴定
1.6.1 基因组DNA的提取
菌株基因组DNA
用接种环从μL无菌水中，
12000 rpm离心1 min
组提取试剂盒中使用说明书上的流程进行各菌株基因组的提取，并将其保存于TE缓冲液中，放入4 ℃冰箱中保存备用。将各菌株基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的亮度确定基因组的稀释倍数，作为PCR扩增的模板。
………
2 结果与分析
2.1菌株筛选
用木聚糖作为唯一碳源从实验室保存的腐木中分离能产木聚糖酶的菌种。………
2.2 基因组DNA的提取和PCR的扩增
以NL1和NL4作为引物对菌株M3的26S rDNA基因组做特异性PCR 反应扩增。将扩增的基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析得到单一条带，片段大小长度约为600 bp，扩增产物无明显非特异扩增现象，结果见图1。
