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聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
RT-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml 容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸27.5g0.5M EDTA 20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
PCR扩增反应的基本操作及理论知识第一节移液器的使用一、移液器的工作原理移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。
在活塞推动下，排出部分空气，利用大气压吸入液体，再由活塞推动空气排出液体。
使用移液器时，配合弹簧的伸缩性特点来操作，可以很好地控制移液的速度和力度。
二、移液器的操作使用1.移液器规范操作步骤第一步设定移液体积从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。
（见图1）第二步装配移液器吸头：将移液器端垂直插入吸头，向右微微转动（视具体移液器而定，e ppendorf可以左右微微转动），上紧即可；特别提示：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期这样操作，会导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。
（见图 2）第三步吸液和放液吸液↓吸头尖端需浸入液面3 mm 以下↓慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度↓放液时吸头尖端靠在容器内壁2.移液小技巧●预润湿吸液粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，吸头内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。
●正向吸液与反向吸液正向吸液是指正常的吸液方式（见图 4），操作时吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。
放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。
反向吸液（见图5）是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到第一档即可。
多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。
3.错误的操作方式错误：装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确：插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头错误：吸头与移液器不匹配，影响气密性正确：选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头错误：吸液时，移液器倾斜吸液正确：垂直吸液错误：吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面正确：将移液器垂直挂在移液器支架上错误：用大量程的移液器移取小体积的液体正确：移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求错误：吸取具有强挥发性的液体正确：如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器。
PCR使用说明范文PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外复制DNA的技术，通过PCR可以扩增目标DNA片段，从而大量生产足够的DNA 用于分析和研究。
PCR技术的应用广泛，包括基因突变检测、基因表达分析、遗传病诊断、DNA指纹鉴定等。
本文将详细说明PCR的原理、步骤和注意事项。
1.PCR的原理：PCR技术是通过不断重复三个步骤：变性、退火和延伸，来扩增DNA 样本中的特定片段。
具体原理如下：(1)变性：将DNA样本加热到高温（通常为94-98摄氏度），使DNA 双链解开成两条单链。
这一步骤使得DNA的碱基对断裂。
(2)退火：将温度降低至50-65摄氏度，加入一对引物（引物是用于扩增目标序列的短DNA片段），引物与目标DNA序列互补结合，作为扩增的起始点。
(3)延伸：将温度升高到72摄氏度，加入DNA聚合酶，它通过引物在DNA模板上进行延伸合成新的DNA链。
此步骤是PCR的最后一步，产生双链DNA。
PCR通过循环重复以上三步骤来扩增DNA。
每个PCR循环都会使DNA 的数量增加一倍，反复数次即可扩增目标DNA到足够多的数量。
2.PCR的步骤：(1)样本制备：将待测DNA从细胞或组织中提取出来，去除杂质，并用缓冲液将其稀释。
(2)反应混合液的制备：将模板DNA和引物，以及PCR反应液的其他成分（如引物浓度，聚合酶等）混合至PCR反应管中。
(3)PCR的循环：将反应管放入PCR仪中，依次进行变性、退火和延伸的循环，循环的次数根据待扩增DNA的数量进行调整。
(4)结果分析：通过凝胶电泳或实时荧光PCR等方法，对PCR反应结果进行分析和检测。
3.PCR的注意事项：(1)实验操作层级：为了避免PCR反应的污染，应分配操作区域，将样本制备区与PCR循环区分开，使用专门用品和设备。
(2)对于反应混合液的制备，应避免引物和循环酶的污染，严格按照实验方案中的要求制备，并进行质量控制。
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
RNA提取和反转录1、RNA提取1)匀浆：取50-100 mg子宫和卵巢组织于液氮中研磨至粉状，加入1 mL的TRIzol溶液，转移至1.5 mL EP管中，颠倒混匀数下，冰上静置5 min，使组织充分裂解。
2)除去未裂解的组织：4℃，12000 g离心5 min，吸取上清至新的EP管中。
3)分离阶段：加入200 µL氯仿（1/5 TRIzol量），剧烈振荡15-30 s，冰上静置2-5 min；4℃，12000 g离心15 min。
4)RNA沉淀：将上层水相移入新的1.5 mL EP管中，加入500μL预冷的异丙醇（1/2 TRIzol量），充分混匀，-20℃静置20-30 min；4℃，12000 g离心10 min。
5)RNA洗涤：弃上清液保留沉淀，向沉淀中加入 1 mL现配的75%的乙醇（等TRIzol量），晃起沉淀，冰上静置5 min，4℃，12000 g离心10 min。
重复洗涤一次。
6)RNA溶解：小心倒掉上清，留取沉淀置超净工作台风干30 min，使mRNA呈半透明状（不能太干，否则很难溶解）；加入10-30μL的DEPC水吹打溶解RNA沉淀。
7)RNA电泳检测：提取的总RNA电泳后得到28S、18S、5.8S（5S）三条清晰的rRNA条带，28S与18S的带宽比为2:1，说明RNA没有降解。
8)RNA浓度和纯度检测：用微量分光光度计检测提取总RNA的浓度和纯度，OD260/OD280的值应在1.8~2.0之间，样品检验合格后，用DEPC水稀释至500 ng/μL，置于-80℃冰箱保存备用或直接进行反转录。
2、反转录按照Takara反转录试剂盒说明书(Cat#RR036A)操作，其反应体系(10μL)如下：5x PrimeScript RT Master Mix 2μLTotal RNA 1μLRNase Free dH2O 7μL反应程序：37℃ 15min, 85℃ 5sec, 4℃保存。
溶液浓度计算量化溶液中的物质含量溶液浓度是指溶液中溶质的质量或摩尔数与溶剂的质量或体积之比。
溶液浓度的计算对于化学实验、药学制剂等领域都非常重要，因为它可以帮助我们准确测量溶液中所含的物质含量。
本文将介绍几种常见的溶液浓度计算方法，以帮助读者更好地理解和计算溶液的物质含量。
一、质量浓度计算公式质量浓度是指单位体积溶液中溶质的质量，常以克/升（g/L）表示。
质量浓度的计算公式为：质量浓度（g/L）= 溶质质量（g）/ 溶剂体积（L）例如，在100毫升的溶剂中，溶解了5克的氯化钠。
那么，质量浓度可以通过以下计算得出：质量浓度（g/L）= 5g / 0.1L = 50g/L二、摩尔浓度计算公式摩尔浓度是指单位体积溶液中溶质的物质的摩尔数，常以摩尔/升（mol/L）表示。
摩尔浓度的计算公式为：摩尔浓度（mol/L）= 溶质物质的摩尔数 / 溶剂体积（L）例如，在500毫升的溶剂中，溶解了0.1摩尔的盐酸。
那么，摩尔浓度可以通过以下计算得出：摩尔浓度（mol/L）= 0.1mol / 0.5L = 0.2mol/L三、体积百分比浓度计算公式体积百分比浓度是指溶质的体积与溶液总体积的百分比，常以体积百分比（%）表示。
体积百分比浓度的计算公式为：体积百分比浓度（%）= 溶质体积（ml）/ 溶液总体积（ml） × 100%例如，在200毫升的溶液中，所含乙醇的体积为40毫升。
那么，体积百分比浓度可以通过以下计算得出：体积百分比浓度（%）= 40ml / 200ml × 100% = 20%四、密度计算浓度公式密度是指单位体积溶液的质量，常以克/毫升（g/mL）表示。
有时候，为了计算溶液中物质的含量，我们需要先计算溶液的密度。
密度计算浓度的公式为：密度（g/mL）= 溶质质量（g）/ 溶液体积（mL）例如，一个溶液的质量为50克，体积为40毫升。
那么，该溶液的密度可以通过以下计算得出：密度（g/mL）= 50g / 40mL = 1.25g/mL通过上述的几种溶液浓度计算方法，我们可以准确地计算出溶液中的物质含量。
qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。
2. 相关试剂盒（给出货号）等。
3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。
二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。
女生需将长发扎起。
2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。
3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。
三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。
1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。
a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。
直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。
用移液器吹打混匀。
TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。
b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。
每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。
用移液器吹打混匀。
收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。
