qPCR实验从设计primer开始到 计算方法详例

献给初学者：Q-PCR计算看这一篇就够了上次看了「一文教你看懂 PCR 结果图」的童鞋是不是迫不及待得等待后续的更新呢？哈哈，别急，这次我就跟大家详细介绍 Q-PCR 的计算原理及过程。

绝对干货哦！PCR 扩增的速率大家都知道，就是简单的指数增长，也就是 1 变2，2 变 4，4 变 8 以此扩增。

数学形式就是 2 的 ct 次方，但是实际过程中的增量应该是（1+e）的ct 次方，e 是扩增效率也称扩增系数。

一般我们都假设 e 为 1。

正常的 Q-PCR 我们都会有一个阈值，也就是我们平常说的平台期。

简单的说在平台期的所有基因扩增的数目是一致的。

而唯一有区别的则是 ct 值的不同。

Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。

所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。

下面我们用一个公式进行推导过程：（敲黑板，重点！）PCR 产物量 = 2∧ct * 起始模板量起始模板量 = PCR 产物量／2∧ct = 起始模板量 * 2∧- ct可以得出以下两个等式：待检基因起始模板量 = PCR 产物量 * 2∧- ct（待检基因）内参基因起始模板量 = PCR 产物量 * 2∧- ct（内参基因）由于 PCR 产物量是相同的。

两式上下相除得：待检基因起始模板量／内参基因起始模板量 = 2∧-【ct（待检基因）-ct（内参基因）】= 2∧-Δct上述的算式结果数值只能表示该待检基因在该处理组中相对于内参的表达量，没有任何意义。

想要有看出基因的变化趋势，则需要与空白处理组的待检基因起始模板量/内参基因起始模板量进行比较，两者相除，如果比值大于 1，则表明该基因处理后上调，如果比值小于 1，则表明该基因处理后表达下调。

而两者相除的结果就是我们经常说的 -ΔΔct。

明白了原理，下面我们进行计算（这里以p53 基因为例进行计算）：1. 数据的输出。

QPCR实验过程一、细胞培养1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。

1.2 凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。

然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。

1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。

然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。

二、PCR操作过程2.1 M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。

2.2 M-RNA提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。

然后2-8 ℃，12000*g离心15min。

离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。

2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。

此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。

然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml的异丙醇，在冰上放置10min。

qpcr原理及流程qPCR原理及流程。

qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、准确地测定样本中特定基因的数量。

本文将详细介绍qPCR的原理和流程。

1. 原理。

qPCR的原理基于PCR技术，但是在PCR的基础上加入了荧光探针，可以实现实时监测DNA的扩增过程。

在qPCR过程中，DNA模板经过一系列的变性、退火和延伸步骤，产生指数级的扩增。

同时，荧光探针与特定的靶标结合，当靶标DNA扩增时，荧光信号也会增加。

通过监测荧光信号的变化，可以确定起始模板数量的多少，从而实现对目标基因的定量分析。

2. 流程。

qPCR的流程主要包括样品处理、引物设计、反应体系配置、PCR扩增和数据分析等步骤。

首先，需要对样品进行处理，包括DNA或RNA的提取和纯化。

接下来，根据目标基因的序列设计引物和荧光探针。

引物是用于扩增目标基因的短链DNA片段，而荧光探针则是用于监测扩增过程的荧光标记的探针。

引物和探针的设计需要考虑靶标的特异性和扩增效率。

然后，需要配置PCR反应体系，包括引物、DNA模板、荧光探针、聚合酶和缓冲液等。

在反应体系中，引物和探针会与靶标结合，PCR扩增过程中会释放出荧光信号。

接着进行PCR扩增，通过一系列的变性、退火和延伸步骤，实现DNA的指数级扩增。

在扩增过程中，荧光信号会随着靶标DNA的扩增而增加，实时监测荧光信号的变化可以得到扩增曲线。

最后，通过数据分析软件对扩增曲线进行分析，计算出起始模板的数量，并进行定量分析。

根据荧光信号的强度和扩增曲线的特征，可以确定样品中目标基因的数量。

总结。

qPCR技术作为一种快速、准确的定量检测技术，在基因表达分析、病原体检测、药物筛选等领域有着广泛的应用。

通过本文对qPCR的原理和流程的介绍，希望能够帮助读者更好地理解和应用这一技术，为科研工作和临床诊断提供有力的支持。

q pcr实验流程英文回答：qPCR Experimental Procedure.Materials.DNA template.Primers (forward and reverse)。

qPCR master mix.Nuclease-free water.qPCR machine.Procedure.1. Prepare the reaction mix. In a microcentrifuge tube,combine the following components:10 μL of qPCR master mix.1 μL of each primer (10 μM)。

1 μL of DNA template.8 μL of nuclease-free water.2. Mix well. Vortex or gently pipette the reaction mix to ensure that all components are evenly distributed.3. Centrifuge briefly. Spin down the reaction mix in a microcentrifuge for a few seconds to collect all of the liquid at the bottom of the tube.4. Transfer to qPCR machine. Place the reaction mix in the qPCR machine and close the lid.5. Run the qPCR program. The qPCR program will typically consist of the following steps:Initial denaturation: 95°C for 10 minutes.Amplificati on: 40 cycles of 95°C for 15 seconds, 60°C for 60 seconds.Melting curve analysis: 60°C to 95°C, increasing by 0.5°C every 10 seconds.6. Analyze the results. The qPCR machine will generatea graph of the fluorescence data. The cycle threshold (Ct) value is the cycle number at which the fluorescence signal crosses a predetermined threshold. The Ct value isinversely proportional to the amount of DNA template in the sample.Troubleshooting.No amplification. This could be due to a number of factors, including:Incorrect primers.Poor quality DNA template.Inhibition of the PCR reaction.Non-specific amplification. This could be due to: Primer dimers.Cross-contamination of samples.Low efficiency amplification. This could be due to: Incorrect annealing temperature.Suboptimal primer design.中文回答：qPCR实验流程。

PCR引物设计方法及步骤查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。

接下来，我们将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。

PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。

PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。

引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过T aq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

qpcr实验步骤及方法实时定量聚合酶链反应（qPCR）是一种常用于测定DNA或RNA的相对丰度或表达水平的方法。

下面是qPCR实验的步骤及方法。

步骤一：实验前准备1.收集实验所需的试剂和材料，包括DNA或RNA样品、引物、探针、逆转录酶、DNA聚合酶、引物/探针控制、PCR反应缓冲液等。

2.清洁实验平台，并在平台上设置防护措施如UV灯。

步骤二：RNA样品的逆转录1.准备RNA酶切酶，比例为每反应1μgRNA需要加入1μL的RNA酶切酶。

2.加入逆转录酶，比例为每反应1μgRNA需要加入1μL的逆转录酶。

3.需要注意的是，逆转录时可能需要将样品加热至65°C使RNA变性，然后冷却至42°C，以促使逆转录酶逆转录RNA为cDNA。

4.将逆转录反应混合液置于逆转录反应仪中，按照仪器上的指示进行逆转录反应。

步骤三：qPCR反应的设置1.准备qPCR反应液。

根据所使用的qPCR试剂盒的配方，配制相应的qPCR反应液，其中包括PCR缓冲液、dNTPs、酶、引物和探针等。

2.为每个样品和阴性对照设置反应管，每个反应管中加入适量的qPCR反应液和DNA模板。

3.使用qPCR仪器设置反应条件，包括反应温度和时间，以及测定所需的循环数目。

步骤四：进行qPCR反应1.将qPCR反应液加入PCR管中，确保每个反应管中的液体量相等。

2.将PCR管放入PCR仪器中，开始进行qPCR反应。

3.根据仪器上的程序进行PCR反应。

步骤五：分析实验结果1.在qPCR反应结束后，收集结果数据，包括荧光曲线的相对荧光单位（RFU）值和时间。

2.使用反应样本的Ct值和标准曲线，计算相对目标DNA或RNA的数量。

3.根据结果数据分析实验结果并解释实验结果。

需要注意的是，在进行qPCR实验时，要遵守实验室的操作流程和安全规定，并严格控制实验条件，以确保实验结果的准确性和可重复性。

QPCR详细实验过程和仪器操作说明QPCR（定量聚合酶链反应）是一种用于快速、准确测定DNA或RNA样品中特定序列的浓度的方法。

本文将详细介绍QPCR的实验过程和仪器操作步骤。

实验过程：1.样品准备：将待测DNA或RNA样品提取并纯化。

确保样品的质量和浓度适合QPCR分析。

2.引物设计：设计引物和探针，确保其在目标序列上具有特异性，并且没有多余的副产物。

3.校准曲线：准备一系列已知浓度的标准曲线样品，用于生成标准曲线。

标准曲线通常包含5-6个标准浓度点。

4.反应体系配制：根据实验需要，准备反应体系。

常见的反应体系包括引物、模板DNA或RNA、聚合酶、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和缓冲液。

仪器操作说明：1.准备反应管：在无菌条件下，将QPCR反应混合物分配到每个反应管中。

确保每个反应管中的混合物组成相同，并尽量避免气泡的产生。

2.反应管密封：使用盖板密封每个反应管，确保反应过程中的蒸发和污染最小化。

3.进入PCR机：将每个反应管放入热循环仪（PCR机）中，并按照下列程序设置反应条件：- 热活化（Hot start）：将样品加热至95℃，通常持续2-10分钟，以破坏可能存在的非特异性扩增产物。

-反应循环：将样品依次加热至目标温度（通常为94-98℃）进行DNA的解离，然后降温至引物结合温度进行引物结合和扩增。

通常需要25-40个循环。

-结束延伸：在最后一个循环结束时，将样品加热至72℃进行延伸，以确保所有引物的扩增完成。

-终止反应：在所有反应循环结束后，通常会将样品保持在4℃，防止扩增产物的退化。

4.数据分析：使用专门的软件对QPCR数据进行分析，包括计算阈值周期数（Ct值）、计算目标序列的相对表达量等。

QPCR是一种非常精确和灵敏的方法，但在操作过程中应注意以下几点：-使用无菌操作，以避免样品污染。

-严格控制反应条件和时间，确保反应的重复性和准确性。

-正确安装和使用PCR机以确保温度的准确控制，并避免样品间的交叉污染。

QPCR实验过程一、细胞培养1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。

1.2 凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。

然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。

1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。

然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。

二、PCR操作过程2.1 M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。

2.2 M-RNA提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。

然后2-8 ℃，12000*g离心15min。

离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。

2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。

此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。

然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml的异丙醇，在冰上放置10min。

QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。

越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。

由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。

现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。

在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。

1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。

从而荧光定量PCR获得广泛应用。

现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。