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漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【摘要】[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株.[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果.[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb.菌株CLb最适生长温度为37 ℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性.以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重.菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0.在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4h内对活性黑以及在2h内对靛红的脱色率均达到93.0％,在6h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0％和92.5％.[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P1614-1616,1654)【关键词】细菌漆酶;芽孢杆菌属;染料脱色【作者】李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【作者单位】东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江省实验中学,黑龙江哈尔滨150001;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(EC 1.10.3.2，p-diphenol:dioxygen oxidoreductases)是一种含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水［1］。
高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
高产漆酶菌株的筛选是指在自然环境中寻找出能够高效产生漆酶的菌株。
常规的筛选方法包括培养物染色法、营养物变质法、纸板涂片法等。
其中，培养物染色法是最常见的筛选方法，通过将待筛选菌株培养在含有染料的培养基上，观察染色变化来筛选出具有高产漆酶能力的菌株。
营养物变质法则是通过使用染料作为唯一碳源进行培养，筛选出能够利用染料作为唯一碳源并高效降解染料的菌株。
纸板涂片法是通过将待筛选菌株涂片于含有染料的纸板上，观察菌落生长和染料降解情况来筛选高产漆酶菌株。
高产漆酶菌株对染料的降解是指这些菌株能够将染料分子降解为无害的物质或将其转化为可再利用的物质。
漆酶是一种特殊的氧化酶，具有广谱的染料降解能力。
菌株通过产生漆酶来降解染料，漆酶可以在染料分子中引入氧原子，使得染料分子发生氧化反应，降解为低分子化合物。
高产漆酶菌株对染料的降解能力通常会通过测定漆酶活性、测定染料降解率等指标来评估。
降解染料可以有效地减少染料对环境的污染，这对环境保护和可持续发展具有重要意义。
白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究漆酶是一种酸性酶，广泛应用于木材加工、油漆去除、纸浆脱墨等领域。
为了寻找高效的漆酶产生菌株，本研究对白腐真菌的菌株进行了筛选，并优化了其液体发酵产漆酶的条件。
第一部分：白腐真菌菌株的筛选从环境中采集了多个土壤和木材样品，并将其分离培养于漆酶富集培养基中。
经过连续传代培养，筛选出了表现出高漆酶产酶能力的白腐真菌菌株。
采用基于菌丝的形态学特征、菌落形态特征、和漆酶产酶能力的评估，鉴定了5个潜在的高漆酶产菌株（命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D、菌株E）。
接下来，我们将进一步优化这些菌株的液体发酵条件。
第二部分：液体发酵条件的优化2.1 碳源在液体培养基中加入不同碳源，如木质素、纤维素、葡萄糖和麦芽糖，分别对5个菌株进行液体发酵。
结果表明，以木质素作为唯一碳源时，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力最高，分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他碳源的产酶能力高出很多。
因此，我们选择了木质素作为主要碳源。
2.2 氮源尝试了不同的氮源对菌株C和菌株E的漆酶产酶能力的影响。
我们测试了不同浓度的尿素、酵母提取物和氨基酸，结果发现在0.5%尿素和0.1%酵母提取物的情况下，菌株C和菌株E的产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他条件下的产酶能力最高。
2.3 pH值和温度进一步优化了液体培养基的pH值和温度。
在不同的pH值和温度下培养菌株C和菌株E，观察到最佳产酶条件是在pH 5.0和30°C的情况下。
在这种条件下，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL。
结论：通过对白腐真菌菌株的筛选和液体发酵条件的优化研究，本研究确定了菌株C和菌株E为高漆酶产生菌株。
最佳的液体发酵条件为使用木质素作为碳源，0.5%尿素和0.1%酵母提取物作为氮源，培养基的pH值为5.0，温度为30°C。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、绪论漆酶是一种广泛存在于自然界中的酶，具有重要的工业应用价值。
在油漆等化工行业中，漆酶可以加速有机溶剂和有机物的降解，具有分解污染物、提高涂料质量等重要作用。
对于产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的意义。
二、产漆酶菌株的筛选为了筛选出产漆酶的菌株，我们采用了固体培养的方法。
从土壤、水体等环境样品中采集菌株，然后将其进行分离纯化。
在培养基中，我们添加了有机溶剂作为唤醒剂，以刺激菌株产生漆酶。
接着，通过平板筛选法，筛选出产漆酶活性高的菌株。
用甲基橙为指示剂进行酶活性测试，并通过测定橙色环的直径来评价菌株的漆酶活性。
三、产漆酶菌株的鉴定对于筛选出的产漆酶菌株，我们进行了鉴定工作。
采用形态学观察的方法，观察菌株的形态特征，如菌落形状、色泽、边缘和胞外酶的生成情况等。
接着，通过生理生化试验，检测菌株对不同营养物质的利用情况，并对其产生的酶活性进行测定。
通过16S rRNA基因序列分析，确定菌株的种属。
四、产漆酶细菌的固体发酵条件研究为了提高漆酶的产量，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们优化了基础培养基的配方，确定了最适合菌株生长的基础培养基组成。
接着，通过单因素实验和正交实验，优化了培养条件，包括发酵温度、pH值、初始菌量、发酵时间等。
通过对发酵产物的酶活性进行测定，确定了最佳的固体发酵条件。
五、结论通过筛选鉴定和固体发酵条件的研究，我们成功地获得了一株高产漆酶的细菌菌株，并确定了最佳的固体发酵条件。
这为产漆酶的工业化生产提供了重要的理论基础和技术支持，具有重要的应用价值。
我们的研究结果对于深入了解漆酶的产生机制、酶的结构和功能，以及漆酶的应用研究也具有重要的参考意义。
漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。
为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。
首先，准备木材素作为酶的底物。
木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。
接下来，采集不同环境中的泥土样品。
漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。
然后，制备泥土微生物的培养基。
泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。
随后，进行菌株的分离与纯化。
将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。
通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。
然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。
接着，筛选高产漆酶的菌株。
采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。
根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。
然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。
将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。
培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。
最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。
通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。
同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。
以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。
通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。
实验3 漆酶产生菌的筛选1.实验原理：菌种筛选包括分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。
白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，被认为是最主要的木质素降解微生物。
木质素降解酶系主要包括三部份: 木质素过氧化物酶(Lip）、锰过氧化物酶(MnP)以及漆酶( Lac)。
由于漆酶能把分子氧直接还原为水，与其他木质素降解酶相比，具有更大的实际应用价值。
漆酶是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kD之间。
由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力, 因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景，因此筛选高产漆酶的白腐菌显得至关重要。
由于木质素结构的复杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA), 1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。
可选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。
漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。
对于白腐菌来说，变色圈的形成有两种：一种是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径小于1；另一种是变色圈，在菌丝的外圈形成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株。
菌丝圈与变色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素；比值大于1的菌则首先降解纤维素。
由于选择性降解木质素的菌株在制浆造造纸等行业更显优势，因此本试验主要是筛选选择性降解木质素的菌株。
本次实验需6个课时，但实验周期较长。
2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、纯水机、移液枪等。
2.2试剂葡萄糖、KH2PO4、MgSO4•7H2O 、V B1、愈创木酚、酒石酸钾、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4琼脂等。
高产漆酶白腐真菌的筛选作者：王玉俊樊忠慧王长宝岳丽红来源：《湖北农业科学》2017年第21期摘要：以6种白腐真菌作为供试菌株，5种食用菌作为对照菌株，采用愈创木酚及α-萘酚基质平板显色法，依据漆酶催化氧化还原反应产生显色圈的直径大小及变色程度对产漆酶菌株进行初筛；并采用ABTS酶活力测定法对菌株进行复筛。
结果表明，11种真菌均具有分泌漆酶的能力，得到5株高产漆酶的白腐真菌菌株，由强至弱排列依次为朱红栓菌[Trametes cinnabarina（Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄层孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、单色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]、轮纹韧革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]和宽鳞棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]，酶活力分别为23.47、20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。
关键词：白腐真菌；漆酶；显色直径；酶活力中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）21-4043-03DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.21.012Screening of White Rot Fungi with High Laccase YieldWANG Yu-jun，FAN Zhong-hui，WANG Chang-bao，YUE Li-hong（College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）Abstract： With 6 kinds white rot fungi as test strains and 5 kinds edible fungi as control strain，the method of plate substrate chromogenic of Guaiacol and α-naphthol were adopted，the diameter of chromogenic and the degree of discoloration were compared，the secrete laccase strains were screened preliminary. And strains were screened for the second time by the method of ABTS laccase activity determination. The results showed that all kinds of fungi had the ability to secrete laccase. 5 strains of high yield laccase white rot fungi were obtained，and the rank（from high to low） of these 5 kinds of fungi on the laccase activity were Trametes cinnabarina，Pyropolyporus fomentarius，Coriolus unicolor，Stereum ostrea and Favolus squamosus，enzyme activities were 23.47 U/mL，20.26 U/mL，19.52 U/mL，18.39 U/mL，17.93 U/mL，respectively.Key words： white rot fungi； laccase； chromogenic diameter； enzyme activity漆酶能够体外催化O-和P-联苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚类染料等的氧化反应，降解多环芳烃、木质素能力较强，在纸浆生物漂白、废水处理、苯氧基类除草剂去毒等领域具有广泛的研究和应用价值[1-5]。
实际应用于生产的漆酶主要来源于白腐真菌，从白腐真菌中筛选出高产漆酶菌株对实现木质素的降解至关重要[6，7]。
本试验以6种白腐真菌作为供试菌株，5种食用菌作对照菌株，选用愈创木酚及α-萘酚基质为选择性培养基，并通过ABTS酶活力测定试验，筛选出高产漆酶优良菌株，为深入高产漆酶真菌的工业化开发和应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌种朱红栓菌[Trametes cinnabarina （Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄层孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、宽鳞棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]、轮纹韧革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]、单色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]和平盖灵芝[Ganoderma applanatum（Pers）Pat]，采集于黑龙江省凉水国家级自然保护区；蟹味菇[Hypsizygus marmoreus （Peck） H.E.Bigelow]、平菇[Pleurotusostreatus（Jacq ex Fr.）Quel]、杏鲍菇[Pleurotus eryngii （DC.ex.Fr.）Quel]、金针菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing]和滑子蘑[Pholiota nameko （Ito ex Imai）]，超市购买后纯化分离。
菌株均保存在佳木斯大学。
1.1.2 主要仪器高压蒸气灭菌锅（浙江新丰高压灭菌锅），303-1A培养箱（上海沪粤明科学仪器有限公司），DK-500水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.1.3 药品葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司），愈创木酚（天津市光复精细化工研究所），α-萘酚（上海展云化工有限公司），ABTS（酷尔化学科技有限公司）。
1.1.4 培养基①PDA培养基。
马铃薯200 g，葡萄糖15 g，琼脂15 g，用去离子水定容至1 L；②液体发酵培养基。
马铃薯200 g，葡萄糖15 g，用去离子水定容至1 L；③0.03%愈创木酚-PDA培养基。
1 L PDA培养基中加入0.3 g愈创木酚；④α-萘酚-PDA培养基。
1 L PDA培养基中加入0.3 g α-萘酚。
分装于200 mL锥形瓶中，121 ℃下高压蒸气灭菌20 min。
1.2 试验方法1.2.1 产酶菌株的初步筛选用打孔器分别取1.0 cm生长7 d的11种菌株接种于0.03%愈创木酚-PDA培养基上，28 ℃下培养7 d，菌落周围呈红褐色者为产酶阳性菌株，记录与培养时间相对应的显色直径；用打孔器分别取1.0 cm生长7 d的11种菌株接种于α-萘酚-PDA培养基上，28 ℃培养7 d，菌落周围呈蓝色者为漆酶产生菌，记录与培养时间相对应的显色直径。
1.2.2 高产酶白腐菌株的复筛用打孔器分别取1.0 cm生长5 d的11种菌株接种于100 mL 液体发酵培养基中，于28 ℃振荡培养5 d后，过滤培养基，弃去滤渣。
取2 mL滤液，加入2 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 5.0）和2 mL浓度为0.5 mol/L的ABTS。
35 ℃下应用可见紫外分光光度计检测420 nm波长处吸收值的变化，10 s间隔读数，记录1 min内吸收值的变化量，每种真菌进行3次平行重复，并计算漆酶活力（公式1）。
在一定条件下，1 min内氧化1 μmol底物所需要的酶量为1个酶活单位（U）。
E=■ （1）式中，E为酶活力，单位为μmol/（L·min）即U/mL，A1、A2为吸光度值变化的两个端值，t为吸光度值从A1至A2所经历的时间，K为稀释倍数。
2 结果与分析2.1 愈创木酚-PDA培养基显色圈直径比较在其他条件一致的情况下，11种真菌在愈创木酚-PDA培养基平皿上培养7 d后，均有一定程度的显色反应，显色圈呈红色，说明均具有分泌漆酶的能力，但显色直径及变色程度存在明显差异（图1）。
显色圈直径大于5 cm的菌株有5个，由大到小排列依次为朱红栓菌、木蹄层孔菌、宽鳞棱孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝，其直径分别为6.81、6.59、6.27、6.21、5.77 cm。
2.2 α-萘酚-PDA培养基显色圈直径比较经过7 d的培养，11种真菌菌落周围均形成不同直径的蓝色透明圈，说明均可分泌出漆酶（图2）。
显色圈直径较大的菌株（大于6 cm）有6个，由大到小排列依次为朱红栓菌、木蹄层孔菌、平菇、轮纹韧革菌、单色云芝、宽鳞棱孔菌，其直径分别为10.00、8.70、8.18、7.39、7.22、6.71 cm。
2.3 漆酶酶活力的比较11种真菌均具有一定的分解ABTS的能力（图3），漆酶活力最高的是朱红栓菌，酶活力为23.47 U/mL，其次为木蹄层孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝、宽鳞棱孔菌，酶活力依次为20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。
以上5株白腐真菌产漆酶能力较强，而对照菌株产漆酶能力则相对较弱。
3 小结与讨论平皿显色圈法是一种直观、快速、灵敏的检测漆酶活力的方法，一定程度上辅助了高产漆酶菌株的鉴别；漆酶可将ABTS分解为ABTS自由基，随着ABTS自由基的增加，420 nm波长处吸光值也逐渐增大，根据420 nm波长处的紫外吸光值的检测比较11种真菌所分泌漆酶的酶活力，ABTS漆酶酶活测定法灵敏度高，本试验采用ABTS法进一步检测真菌菌株产漆酶能力。
朱红栓菌、木蹄层孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝和宽鳞棱孔菌在愈创木酚-PDA培养基和α-萘酚-PDA培养基上培养过程中，生长速度较快，显色圈直径较大，变色程度明显，性状比较稳定，它们产漆酶的能力远远超过其他菌株，分解ABTS速度较快。
这5种白腐真菌分泌漆酶的酶活力均高于17.0 U/mL，其中，筛选的朱红栓菌漆酶活力达23.47 U/mL，有研究报道[8]筛选的木腐菌株最高产漆酶能力为20.3 U/mL，朱红栓菌产漆酶的能力高出前人报道菌株的15.6%。
说明这5种白腐真菌产漆酶能力较强，在工业化应用方面，可作为高产漆酶菌株进行规模化培养，为今后高产漆酶真菌诱变育种及工程菌株的深入研究提供理论依据。
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