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PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫效力研究的开题报告
一、研究背景及目的
猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是全球豚瘟疫病中最常见、最具破坏力的病害之一，在生猪养殖业中造成了巨大经济损失。
目前，PRRS的预防和控制主要依赖于疫苗，但已上市的PRRS疫苗免疫效果不尽如人意，且反应质量不稳定，病毒血症时间长，返祖株和变异株的出现增加了疫苗保护难度，因此研究新的PRRS疫苗至关重要。
本研究将探索一种新的PRRS疫苗——PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗，包含采自病畜的灭活病毒和蜂胶佐剂，旨在提高PRRS疫苗的免疫效力。
二、研究方法及步骤
1、病原体分离与培养：从PRL病株中分离PRRS病毒并进行分离和鉴定，获得高滴度的PRRS病毒。
2、PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的制备：将PRRS病毒与蜂胶佐剂混合，经过灭活处理后制备PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗。
3、PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫：用大白鼠进行实验，将灭活疫苗注射到大白鼠体内进行免疫，并观察其体内免疫反应的变化。
4、免疫效力的评估：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和其他免疫学检测方法，从免疫实验中获得数据，评估PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫效力。
三、研究意义及预期结果
本研究的成功将提高PRRS疫苗的免疫效力和安全性，减少PRRS的流行和猪场的经济损失。
预期结果将为研究新型PRRS疫苗提供理论依据，为生猪养殖业的可持续发展做出贡献。
蜂胶的药理研究进展现代研究表明，蜂胶除了降糖作用、保护肝脏、治疗胃病外，还有以下其它功效：1、有效预防经常性感冒症状：咳嗽、支气管炎、鼻塞、咽喉痛、头痛、发烧、能强化细胞膜，防止细菌入侵，增加抵抗能力。
2、天然消炎、消肿和拂平作用是治疗面皮疤痕的首先产品。
用在面皮上具有下列特性：抗粉剌浓胞的快速消炎，修补凹凸，美白肌肤，清除体内毒素。
3、快速的抗氧化自由基作用，抑制黑斑的再形成，并能将已形成的黑斑色素轻微血管排出，除了具有抗黑斑的特徵外更能使肌肤洁白。
4、蜂胶可根本治疗过敏性鼻炎、长年鼻塞、过敏性气喘、咳嗽炎、能稳定肥大细胞、抑制过敏介质的释放。
长期服用完全没有副作用，也不会产生效果递减作用。
5、蜂胶可延长现有毛发的生命周期，促进毛发的再生。
若长期服用完全没有类固醇疗法的副作用，并能提供毛发生长所需的乌黑和营养素。
6、可用於重症肝炎、肝硬化、肝癌、胆结石者，蜂胶能强化肝胆细胞自身免疫功能；合成防卫联结组织，阻止病毒入侵；促使肝胆细胞重生，恢复正常健康值。
7、服用蜂胶能治疗口腔疾病：齿肉溃疡、舌部溃疡、口角溃疡、牙周病出血、口臭、胃功能不佳引发的口腔异味。
8、动物实验表明：蜂胶能使心脏收缩力增强，呼吸加深及调整血压，并可有效的抑制血小板集聚。
蜂胶降血脂，对高血脂、高胆固醇、动脉粥状硬化有预防作用，有明显地防止血管内胶原纤维增加和肝内胆固醇堆积的作用。
蜂胶中的黄酮类化合物和多种活性成分，可以改善血管的弹性和渗透性，舒张血管，清除血管内壁积存物，净化血液，降低血液粘稠度，改善血液循环状态和造血机能等。
日本国著名医学博士木下繁太郎曾报道过蜂胶对高血压、低血压、白血症奏效的实例。
蜂胶中含有20多种类黄酮，具有极好血液净化作用，有利於治疗血栓症，促进人体血液循环。
9、由於蜂胶成分的多样化及其具有生物活性物质的这一组合，其对人体，尤其是对皮肤健康的功效，令人称奇。
临床实验表明：蜂胶对皮肤瘙痒症、神经性皮炎、射线皮炎、日光性皮炎、毛囊炎、汗腺炎、脂溢性脱发、斑秃、青年痤疮等有效；对感染性皮肤病，如腕苞病、带状苞疹、寻常疣、扁平疣、头癣、体癣、手足癣等有效；对物理性皮肤病，如烧伤、烫伤、冻疮、手足皱裂、稻田皮炎、痱子、鸡眼、蚊虫叮咬有效；对意外皮肤伤害，如刀伤、枪伤、创伤、挫伤等有止痛、止血、消炎、止痒、抗感染和促进组织再生及坏死组织脱落的功能，对很难愈合的创伤，有促进伤口愈合与黏附伤口的作用。
收稿日期:2010 06 15;修回日期:2010 07 29基金项目:湖北省卫生厅课题(B2010-041)通讯作者:吴移谋,E -m a i :l yi m ouw u @s i na .co m作者简介:余坚(1970 )男,硕士,主要从事梅毒螺旋体动物模型的研究。
E m ai:l abc163043@163.co m核酸疫苗佐剂的研究进展余坚综述;赵飞骏,吴移谋审校(南华大学病原生物学研究所,湖南衡阳421001)摘 要:免疫佐剂是一种免疫调节剂,可增强抗原的免疫原性、提高免疫效果。
为增强疫苗的免疫原性,在病毒性疫苗、DNA 疫苗、多肽疫苗的研制中通常需加入免疫佐剂。
随着DNA 疫苗研究的深入和扩展,推动了用于提高DNA 疫苗免疫效果的免疫佐剂的研究。
本文就常用佐剂的研究进展作一综述。
关键词:免疫佐剂;免疫原性;疫苗中图分类号:R 392 33文献标识码:A文章编号:1005 5673(2010)03 0061 06免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用,能够增强机体针对抗原的免疫应答能力,或改变免疫反应类型的制剂。
自1926年,G lenny 等发现明矾沉淀白喉毒素能产生一种微粒,极大地增强机体对抗原的特异性免疫应答,从而拉开了佐剂使用的序幕。
如今合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗等新型疫苗虽有良好的抗原性和低毒等优点,但其免疫原性较弱,需配合高效的佐剂使用,提高其免疫原性。
目前应用的佐剂主要通过免疫调节、诱导CD8+T 细胞应答、参与抗原递呈、抗原贮存等方式发挥作用。
本文就一些常用佐剂的研究进展作一综述。
1细胞因子细胞因子是一类机体在免疫反应时能产生免疫调节,机体的免疫系统在受到抗原和各种免疫佐剂激活后,产生应答性的物质。
近年来人们发现多种细胞因子(G M CSF 、I FN 、I L 2、I L 4和I L 12)具免疫佐剂作用,可不同程度的增强DNA 疫苗的免疫效果,并可引导机体免疫朝有利的方向转化,有重要的理论和实用价值。
有安瓿瓶均在液氮面以下。
立即放入37℃的温水中解冻，此过程最好在10s内完成。
然后把安瓿放在37℃的温水中轻摇，并应在90s内使安瓿中疫苗完全解冻。
从取出疫苗安瓿至疫苗溶液配制完毕不应超过2min。
配好后立即使用，皮下或肌肉注射，每羽0.2mL。
应在1h内用完，使用过程中每10～15min轻摇瓶子一次，保持疫苗溶液混合均匀。
2.3.4疫苗的免疫效力CVI988马立克氏病疫苗的蚀斑数要求在2000 (DFU)以上，Fc126株的蚀斑数要求在1000(DFU)以上。
大剂量的疫苗有利于早期建立免疫力。
HVT疫苗只能防治马立克氏病发生，却不能阻止MDV感染，也不能阻止马立克氏病病毒的传播和对环境的污染。
因而最好是选择由SPF蛋生产的疫苗。
2.3.5乱加药物在应用过程中，人们往往在马立克氏病稀释液中加入其它药物，例如抗生素和维生素等，这破坏了稀释液中的pH值而影响马立克氏病苗的活力。
3总结目前，该病仍然严重威胁着养禽业的发展，疫苗虽然可以预防马立克氏病的发生，但免疫失败时有发生，常常导致本病的局部暴发。
鸡马立克氏病疫苗使用是否正确，直接决定疫苗的使用效果。
为此，本文阐述常见的马立克氏疫苗，后在疫苗应用过程中易于造成免疫失败的原因进行了综述。
因本病无特效治疗方法，加强对本病的预防工作具有十分重要的意义。
■（编辑：狄慧）疫苗佐剂是一种免疫增强剂，自身并不能引起机体产生免疫应答，但能提高抗原的免疫原性和免疫反应的可持续性，诱发机体针对特定抗原产生更加长期、高效的免疫应答反应，增强疫苗对机体的免疫保护作用。
随着人们对动物食品卫生安全的关注，绿色、环保、健康的理念已逐渐深入人心，普遍将“使用要安全、免疫要高效、抗体产生快、免疫保护强”这几点作为动物疫苗佐剂研究的方向。
蜂胶是由蜜蜂的工蜂采集杨树、柳树、松树等植物的幼芽等同自身的消化腺和蜡腺等分泌物进行混合之后形成的一种具有芳香气味的胶状固体物，含有黄酮类、萜烯类、有机酸、芳香醛、醇类、酯类及多种氨基酸、酶、维生素、矿物质等，其主要的成分为黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生等广泛的生物学作用，是良好的动物疫苗佐剂。
蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展摘要蜂胶是一种天然的免疫增强剂，在体内能激活免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。
近年来，大量的研究表明蜂胶可作为疫苗和菌苗的免疫佐剂来增强疫苗的免疫效果。
本文综述了蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展。
关键词：蜂胶；疫苗佐剂，免疫应答蜂胶是蜜蜂从杨树等植物的的嫩芽、树皮或茎干伤口上等部位采集的树脂，再混以蜜蜂的舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质[1]。
蜂胶属树脂类物质，极易溶于乙醚、氯仿、丙酮、苯及2％NaOH 溶液，溶于95％乙醇。
溶液呈透明状，随蜂胶浓度的增大，有颗粒状沉淀析出[2]。
近年来研究人员已经对蜂胶的抗菌活性进行了深入研究，并且已经证明了蜂胶的抗菌活性(Grange and Davey, 1990; Kujumgiev et al., 1999; Sforcin et al., 2000; Orsi et al., 2005c, 2006b; Scazzocchio et al., 2006)[3-6]. 蜂胶也具有抗病毒(Amoros et al., 1992; Serkedjieva et al., 1992; Vynograd et al., 2000; Ito et al., 2001; Huleihel and Isanu, 2002; Gekker et al., 2005)[7-12], 抗真菌(Dobrowolski et al., 1991; Sforcin et al., 2001)[13-14] ,以及抗寄生虫的作用(Higashi and De Castro, 1994; De Castro and Higashi, 1995; Salom?ao et al., 2004; Freitas et al., 2006)[15-18]，其高强度和黏度、杀菌防腐能力都是其他天然品无法比拟的。
蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展摘要蜂胶是一种天然的免疫增强剂，在体内能激活免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。
近年来，大量的研究表明蜂胶可作为疫苗和菌苗的免疫佐剂来增强疫苗的免疫效果。
本文综述了蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展。
关键词：蜂胶；疫苗佐剂，免疫应答蜂胶是蜜蜂从杨树等植物的的嫩芽、树皮或茎干伤口上等部位采集的树脂，再混以蜜蜂的舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质[1]。
蜂胶属树脂类物质，极易溶于乙醚、氯仿、丙酮、苯及2％NaOH 溶液，溶于95％乙醇。
溶液呈透明状，随蜂胶浓度的增大，有颗粒状沉淀析出[2]。
近年来研究人员已经对蜂胶的抗菌活性进行了深入研究，并且已经证明了蜂胶的抗菌活性(Grange and Davey, 1990; Kujumgiev et al., 1999; Sforcin et al., 2000; Orsi et al., 2005c, 2006b; Scazzocchio et al., 2006)[3-6]. 蜂胶也具有抗病毒(Amoros et al., 1992; Serkedjieva et al., 1992; Vynograd et al., 2000; Ito et al., 2001; Huleihel and Isanu, 2002; Gekker et al., 2005)[7-12], 抗真菌(Dobrowolski et al., 1991; Sforcin et al., 2001)[13-14] ,以及抗寄生虫的作用(Higashi and De Castro, 1994; De Castro and Higashi, 1995; Salom˜ao et al., 2004; Freitas et al., 2006)[15-18]，其高强度和黏度、杀菌防腐能力都是其他天然品无法比拟的。
它是天然药材、辅料及兽药、医药、植物和肉食品加工、食品防腐保鲜的好材料。
被誉为“人类健康的紫色黄金”。
它的主要功效成分是黄酮类化合物[19]。
大量研究表明，蜂胶或者蜂胶提取物能够激活小鼠和人的免疫系统，增加IL-1(Ivanovska et al., 1995; Bratter et al., 1999; Orsolic and Basic, 2003), IL-2 (Ivanovska et al., 1995; Park et al.,2004), IL-4 (Park et al., 2004) ，以及抗体的产生 (Scheller et al., 1988; Park et al., 2004)[20-23]。
几十年来，国内外大量科研实验证明，将蜂胶配合抗原引入机体，能增加抗体产生，还能对胸腺、脾脏及整个免疫系统产生有益的影响，显著增强机体免疫功能，使机体免疫功能处于动态平衡的最佳状态。
一蜂胶作为疫苗佐剂的作用机制蜂胶是一种天然的高效免疫增强剂，含数百种化学成分，主要为类黄酮化合物，包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类以及黄烷酮醇类。
蜂胶的大部分生理功能以及药理功能都与此类化合物有关[24]。
1 蜂胶的免疫调节作用电镜研究表明，蜂胶颗粒与菌体相互粘附形成包被状，同时蜂胶颗粒之间也相互粘附，使得蜂胶颗粒-菌体-蜂胶颗粒-菌体交联成类免疫刺激复合物(ISCOM) 结构，具有抗原“仓库”和免疫刺激复合作用。
同时蜂胶颗粒和抗原仍保持各自完整的形态结构，有利于被机体吸收而后发挥各自的功效和作用，这是蜂胶疫苗高效、持久的主要原因。
同时疫苗中又有少量的裸露的游离的抗原粒子和蜂胶颗粒接种机体后可迅速刺激机体产生免疫应答，由此决定了注射疫苗后能很快产生坚强的免疫力。
蜂胶中的许多酶类、醇类、脂类和酸类物质具有广泛的免疫效应，全面启动机体的免疫防疫系统，包括细胞免疫系统、体液免疫系统、红细胞免疫统和巨噬细胞补体免疫系统，产生特异性和非特异性免疫力。
2 增强体液免疫功能蜂胶酒精提取物（500g/只）能增加绵羊红细胞免疫后小鼠的抗体(Scheller et al., 1988), 同时也能增强巨噬细胞的活性，从而增加细胞因子的分泌，对B细胞和T细胞功能进行调控。
研究人员还发现，短期内使用蜂胶佐剂时产生的抗体更高。
Orsolic and Basic (2003)推测，经蜂胶处理小鼠的IL-1β分泌增加可能与T细胞和B细胞分化能力的增强有关[25]。
国外著名科学家杜尼耶文通过实验证明：蜂胶能增加白细胞的吞噬活性，使机体血清总蛋白和-球蛋白(丙种球蛋白)合成量增加，并使免疫出现早且持续时间长[26]。
纳米蜂胶颗粒(Nanometer propolispellets，NPP)能够与抗原结合，形成抗原与蜂胶相联的复合物，从而起到贮存佐剂的作用。
NPP 能增强红细胞膜上C3b 活性，而红细胞的免疫粘附功能是通过C3b 受体实现的，并发现血液C3b 弘受体总数的95％以上都在红细胞上。
C3b 对B 细胞特别是记忆B细胞的分化有重要的调节功能，在体外培养中，用抗C3b 抗体可刺激B 细胞产生免疫球蛋白。
3 增强细胞免疫功能蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生的作用，以之作为佐剂，可以激发有效的细胞免疫，可以克服常规灭活疫苗不能有效激发细胞免疫的弱点。
蜂胶能刺激白细胞产生，提高机体的特异性和非特异性免疫能力。
Ivanovska et al.(1995b)证明，经肉桂酸（蜂胶组成成分）处理的小鼠脾淋巴细胞受到分裂原（LPS、植物血凝素或ConA）的刺激时，结合胸苷的能力增强，这就说明在分裂素的存在时这些淋巴细胞的分裂能力具有增强趋势。
同时，小鼠血清IL-2表达提高，进一步说明肉桂酸能激活巨噬细胞影响初始免疫反应[27]。
IL-1是一种非特异性T细胞活化信号，通过IL-2发出T 细胞增殖信号并刺激机体的免疫器官的发育和淋巴细胞的分化，而T细胞在介导细胞免疫中起关键性作用。
胡福良研究证明蜂胶可以使氢化可的松致免疫功能低下模型鼠的细胞免疫功能恢复正常水平[28]。
蜂胶治疗感染性疾病不仅可以抑制致病菌的生长和繁殖，还能增加抗体，增强细胞免疫力，最终达到消灭病原微生物的目的。
王玲等(1998)报道蜂胶乙醇提取物(EEP)及其作为佐剂制备的减蛋综合症疫苗皆可使雏鸡血液中T 淋巴细胞比率增加极显著( <0.01)。
刘家国认为淫羊藿一蜂胶佐剂不仅能显著提高小鼠T淋巴细胞转化率，而且能拮抗环磷酰胺对T 细胞转化功能的抑制作用，使受抑翻T 细胞转化功能基本恢复正常[29]。
4 提高机体的特异性和非特异性免疫能力蜂胶能通过促进免疫器官的发育来提高机体的免疫力，此外蜂胶还能通过增强红细胞膜上的C3b受体活性来增强红细胞的免疫功能，增加其他免疫细胞如白细胞、巨噬细胞的产生并增强其吞噬能力。
蜂胶中的松鼠素、高良姜素、山奈素、对香豆苯甲酸脂和蜂胶浸出液等都具有抗菌活性，其本身无抗原性，但可起到免疫佐剂作用，促进抗体生成，使血清总蛋白和丙种球蛋白的含量增加，白细胞和巨噬细胞的吞噬能力增强等。
科学实验证实，蜂胶与抗原物混合在动物身上使用时，动物血清凝集素的含量，比对照组有显著增加，使血清防御性能增加，抗体快速形成，机体产生特异性和非特异性免疫功能，几十年来，国内外大量科研实验证明，将蜂胶配合抗原引入机体，能增加抗体产生，还能对胸腺、脾脏及整个免疫系统产生有益的影响，显著增强机体免疫功能，使机体免疫功能处于动态平衡的最佳状态。
二蜂胶作为疫苗佐剂的应用研究1蜂胶疫苗系列产品的特点蜂胶佐剂疫苗不影响食品安全，对人体无毒副作用，无残留。
许多国家卫生部门批准蜂胶为保健食品或药品。
因此，蜂胶佐剂疫苗属绿色环保型疫苗。
试验证明蜂胶制剂无毒、无刺激性。
蜂胶作为一种新型免疫佐剂用于制造禽病毒性传染病的疫苗，经研究证明它不影响病毒的抗原性[30]。
临床试用安全、有效。
蜂胶疫苗不影响动物的生长和家禽产蛋，甚至有提高的趋势，注射部位无肿胀、无坏死、无脓肿，与其他佐剂疫苗相比更加安全可靠。
2 免疫效果好用蜂胶佐剂疫苗免疫动物，机体能快速产生抗体、更高效、更持久。
蜂胶作为佐剂应用，不仅促进血清特异性抗体的早日生成，提高血清特异性抗体水平，还可延长高水平抗体维持时间。
免疫后5 d即可产生坚强的免疫力（与弱毒苗相同或接近）；保护率高达90％～ 100％；免疫期长达6 个月以上[31]。
从免疫机制上看，蜂胶疫苗能全面启动机体的免疫防卫系统，刺激机体细胞免疫、体液免疫、红细胞免疫系统和巨噬细胞补体系统都能产生免疫应答。
这在灭活疫苗的大家族中是绝无仅有的。
从疫苗的作用机制上看，蜂胶疫苗将疫苗的速释机制与缓释机制有机结合，巧妙的解决了灭活疫苗快速与持久相矛盾的难题。
同时，蜂胶疫苗还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫及增强机体非特异性免疫力的作用。
3 具有抗菌作用和多种生物活性从疫苗成份上看，蜂胶是天然的抗生素，具有抗细菌、抗真菌、抗寄生虫和抗病毒等作用, 蜂胶对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、上呼吸道感染菌等20 余种致病性细菌具有抑制作用[32]。
现有的免疫佐剂如氢氧化铝、白油等其本身无药理作用，而蜂胶含有20 余种黄酮类化合物、多种氨基酸、多种酶、植物杀菌素、维生素以及30 余种化学元素，具有抗菌、抑制病毒、对抗类毒素、消炎、增进机体免疫功能和促进组织再生等作用，说明蜂胶本身又具有广泛的生物活性和药理作用。
因此将它作为免疫佐剂，既可保持抗原特性又可能成为良好的免疫增强剂和刺激剂。
至于其免疫机理尚待进一步研究。
另外，蜂胶中含有丰富的具有抗氧化作用的物质，如不饱和脂肪酸、维生素E、维生素C以及微量元素锌、硒等。
疫苗中无需添加任何抗生素和防腐抑菌剂。
4 蜂胶佐剂疫苗易保存在蜂胶佐剂疫苗成分中, 蜂胶与乙醇均具有防腐抑菌作用, 在疫苗制备中勿需加入防腐剂, 在4 ℃下18 个月、室温下12 个月、37 ℃下6 个月疫苗物理性状和免疫效果基本不变。
据沈志强报道, 该类苗在-15 ℃下不结冻, 因而便于贮存和运输, 适合基层推广应用。
三蜂胶作为疫苗佐剂尚待解决的问题将蜂胶作为疫苗佐剂研究存在的问题主要有以下几个方面：1 蜂胶提取方法对其活性的影响很大，不同溶剂和提取方法所提取的成分差异很大。
最常用的提取溶剂为乙醇，不同浓度的甲醇(Cunha et al.,2004)[33]。
同时蜂胶成分取决于来源和植物区系，成分的多样性对其在药用应用以及质量标准化造成很大的障碍(Marcucci, 1995; De Castro, 2001)[34-35]。
这就为进一步研究其作用机制增加了难度，也为蜂胶佐剂的应用推广造成影响。
2 量效关系。
蜂胶的免疫调节作用呈现一定的量效关系，小剂有免疫增强作用，而大剂量有免疫抑制作用。
