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拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化张静;田兆丰;朱文壮;张飞云【摘要】旨在制备柯浩体的标志蛋白-Awoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定.通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件.表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化.结果显示,原核表达载体pET28a-Atlg 13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确.在IPTG浓度为0.7mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高.经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】6页(P63-68)【关键词】Atcoilin蛋白;表达;纯化;标志蛋白【作者】张静;田兆丰;朱文壮;张飞云【作者单位】首都师范大学生命科学学院,北京100048;北京市农林科学院植物保护环境保护研究所,北京100097;首都师范大学生命科学学院,北京100048;首都师范大学生命科学学院,北京100048【正文语种】中文柯浩体（Cajal bodies，CBs）最早是由西班牙神经科学之父，科学家Cajal在1903年发现存在于细胞核附近的一种亚核结构。
随后，科学家们研究发现在哺乳动物、两栖动物、昆虫、植物以及酵母的细胞中都有其相似的结构存在[1,2]。
到目前为止，已经发现拼接复合体snRNPs、与组蛋白mRNA 3'-末端剪接有关的U7 snRNPs以及与rRNA前体剪接有关的snoRNPs都定位在柯浩体上[2]。
之前的研究结果表明，snRNPs和snoRNPs只有在柯浩体上经过加工、修饰后才能形成具有功能的复合体，并定位在speckles和核仁中，分别行使mRNA和rRNA前体的拼接和剪接功能。
拟南芥基因敲除技术及其在生物学研究中的应用随着人们对基因的研究深入，越来越多的基因工程技术也被发明和应用。
其中，基因敲除技术是一种被广泛应用于研究中的基因工程技术。
本文将着重介绍拟南芥基因敲除技术及其在生物学研究中的应用。
一、拟南芥基因敲除技术的原理拟南芥是一种小型的模式植物，其基因组很小，拟南芥的基因组序列已经被完全解析，因此拟南芥成为了许多基因工程实验室中重要的研究对象。
基因敲除技术是通过建立一种催化剂，使其针对目标基因进行靶向破坏，进而实现基因的失活。
在拟南芥中，基因敲除技术主要通过两种方法实现：T-DNA插入和CRISPR-Cas9编辑。
T-DNA插入是一种利用土壤杆菌将外来基因转移到植物中的技术。
在T-DNA插入的过程中，外源DNA序列会随着T-DNA一同插入到目标基因中，进而导致该基因的表达或结构的改变。
对于T-DNA插入技术，其主要通过三个步骤实现：选择适当的T-DNA载体，由Agrobacterium mediating将载体导入到拟南芥中，最后通过筛选得到T-DNA插入后的植株。
CRISPR-Cas9技术是当前最热门的基因编辑技术之一。
该技术通过利用Cas9蛋白切割DNA，配合CRISPR的引导RNA实现靶向打靶。
在拟南芥中，利用CRISPR-Cas9进行基因编辑的主要流程为：确定目标基因，设计和构建CRISPR-Cas9系统，完成转化、筛选和鉴定，在检测到特定基因的敲除效果后，观察所得到的表型差异。
利用CRISPR-Cas9进行基因编辑相对来说比较快捷和精确，它还可以用于研究基因并预测基因功能等方面。
二、拟南芥基因敲除技术在生物学研究中的应用1.研究基因的功能和作用机制拟南芥基因敲除技术可以帮助研究人员研究基因的功能和作用机制，找到各种基因与疾病之间的相互关系，以及筛选出潜在的药物靶点等。
例如，利用基因敲除技术，可以通过减轻或丧失原有的基因表达而导致表型的变化，在进一步的细胞学和分子学研究之后，确认目标基因与特定生物进程相关，从而探索其作用机制。
拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化作者：乔新荣赵丽平孙伟徐长水来源：《江苏农业科学》2014年第01期摘要：采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列，并将其转入pSUPER1300超表达载体中，构建了 pSUPER1300-PHOT2 超表达载体，利用农杆菌介导花序转化法，转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。
PCR扩增及 RT-PCR 分析表明，该基因超表达，筛选到了潜在的转基因株系。
关键词：蓝光受体；向光素；超表达中图分类号： Q943.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0030-02收稿日期：2013-06-08作者简介：乔新荣（1972—），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究。
E-mail：xinrong806@。
光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的蓝光受体，PHOT1、PHOT2属于同一家族，其N端含有2个高度保守的光感受区LOV1（light，oxygen，voltage1）区、LOV2区，每个LOV区都结合一分子的黄素单核苷酸（FMN）作为发色团。
C端是Ser/Thr蛋白激酶区，蓝光激活多个丝氨酸残基发生自磷酸化作用[1]。
研究发现，PHOT1的第851位丝氨酸残基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1发挥其生理作用所必需的[2]。
PHOT都定位于质膜，但蓝光会诱导部分PHOT1向胞质迁移，部分PHOT2移至高尔基体及叶绿体外膜[3-5]。
PHOT1、PHOT2调节植物的许多生理反应，包括植物的向光反应、气孔开放、叶绿体迁移及提高弱光下植物的光合作用、降低强光对植物伤害等[1，6]。
目前，学者们对PHOT1、PHOT2的结构及其生理作用有了较为深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光强依赖方式共同介导植物的许多生理反应，如共同介导弱光下叶绿体的聚集运动及强光下下胚轴的向光弯曲[7]。
与拟南芥对话王畅(山东农业大学生命科学学院生物科学，山东255080)摘要：拟南芥属于被子植物门，双子叶植物纲，十字花科，鼠耳芥属，二年生草本，拉丁名为Arabidopsis thaliala (L.) Heynh，又名阿拉伯芥、鼠耳芥、阿拉伯草。
拟南芥作为一种草本植物广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部，在我国的内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有生长。
这种小小的有花植物，是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。
它是理解许多植物性状的一种流行的分子生物学工具，包括花的发育和向光性。
拟南芥是第一个基因组被完整测序的植物，其基因组是目前已知植物基因组中最小的，是进行遗传学研究的好材料，被誉为“植物中的果蝇”。
关键词：拟南芥；模式生物；花发育的ABC模型；microRNA(miRNA)；价值1 形态特征拟南芥的形态特征分明，莲座叶着生在植株基部，基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。
侧枝着生在叶腋基部，主茎及侧枝顶部生有总状花序，四片白色匙形花瓣，四强雄蕊。
长角果线形，长约1-1.5cm，每个果荚可着生50-60粒种子，花期3～5月。
2 模式生物尽管拟南芥在农业上并无多少直接的贡献，但其由于具有以下的特点而成为研究有花植物的遗传、细胞、发育、分子生物学研究的模式植物。
拟南芥植株较小（一个8cm见方的培养钵可种植4-10株）、生长周期短（从发芽到开花约4-6周）、结实多（每株植物可产生数千粒种子）。
生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。
拟南芥基因组小，由五对染色体组成。
其基因组[1]序列已于2000年由国际拟南芥基因组[2]合作联盟联合完成，这是第一个实现全序列分析的植物基因组。
拟南芥基因组约为12,500万碱基对，包含约2.6万个基因，编码约2.5万种蛋白质。
拟南芥是典型的自花受粉植物，基因高度纯合，易于保持遗传稳定性，通过物理（如辐射处理）、化学（如EMS诱变）及生物（如利用植物内源转座子或者根瘤农杆菌将DNA片段转入拟南芥基因组）的手段，已获得大量的发生在不同基因位点的突变体，易获得各种代谢功能的缺陷型。
为什么要研究拟南芥
拟南芥（又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草）通常将拟南芥作为研究对象是因为1、有利于突变体筛选，突变体筛选是遗传和分子研究中十分重要的手段，用无
菌培养来筛选突变体有许多有利之处。
首先，对大量拟南芥诱变处理的种子很容易进行生活力记录。
其次，生长在培养皿中的植物可在人工控制的条件下稳定生长，以致使实验设计得以实现。
这种突变体筛选方法十分类似于微生物突变体筛选的操作。
例如对一些特殊化合物、除草剂、生长调节剂的敏感性可在同一野生型生长阻遏的背景下进行筛选，而如果在土壤条件下对这些化合物进行测试，则很难达到一致的生长条件，会受到各种因素影响。
2、在分子水平分析时，常需经基因工程的方法取得转基因植物，而转基因植物获得过程中，常采用抗生素筛选等手段，这就必须将抗生素置于培养基中，在无菌条件下，使转化有外源基因的个体存活，而淘汰未转化的组织。
拟南芥细胞周期调控因子KRP2的原核表达及蛋白纯化作者：杨旭颖安丽君来源：《江苏农业科学》2019年第12期摘要：表皮毛是由高等植物地上部组织表皮细胞发育而来的一种特殊结构，细胞周期调控因子在植物表皮毛细胞形态的建成过程中发挥着重要作用。
利用原核表达系统，构建pET-28a-KRP2-FLAG融合表达载体，在大肠杆菌中对拟南芥细胞周期依赖激酶抑制因子KRP2进行了体外表达，并利用蛋白标签FLAG和His对目的蛋白进行纯化。
结果表明，在大肠杆菌系统中成功对KRP2-FLAG进行了体外表达并得到了纯化的蛋白，蛋白量为0.87 mg。
这为进一步研究KRP2在表皮毛细胞发育过程中的作用奠定了基础。
关键词：表皮毛;细胞周期调控因子;KRP2;原核表达;FLAG标签;His标签;蛋白纯化;拟南芥;基因克隆;重组蛋白中图分类号： Q78;S188+.2; 文献标志码： A; 文章编号：1002-1302（2019）12-0063-03植物表皮毛是植物地上组织表皮细胞形成的一种特化结构，与表皮铺板细胞持续进行有丝分裂不同，表皮毛细胞在命运决定之后将退出有丝分裂周期转而进入核内复制。
在模式植物拟南芥中，成熟的叶片表皮毛细胞需要经历4次核内复制，从而使其核内DNA含量达到32C，进而形成特定的形态[1]。
细胞周期调控因子在细胞由有丝分裂向核内复制转换的过程中发挥着关键的调节作用，其中细胞周期素依赖性激酶（CDK）是植物细胞周期的中心调控因子，细胞周期的一些进程是通过调节CDKs活性进行的[2]。
与细胞周期素相对的是CDK抑制因子，它通过与CDKs直接结合负调控CDKs活性[3]。
植物中第1种CDK抑制因子是由7种基因共同编码的kip相关蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。
ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6过表达强烈抑制生长并且影响器官形态建成。
植物抗病性状关键基因的克隆及功能分析植物的抗病性状是保持健康的重要途径。
许多研究表明，植物的免疫响应与特定的基因有关。
在最近的研究中，研究人员已经克隆了一些植物抗病性状的关键基因，并对它们进行了功能分析。
本文将探讨这些研究的进展和意义。
一、克隆关键基因研究人员通过利用系统发育学、转录组学等手段，克隆了许多与植物抗病性状相关的基因。
例如，研究人员克隆了拟南芥的RPS5基因，它是拟南芥抗菌性的主要基因之一。
当拟南芥感染革兰氏阴性菌Pseudomonas syringae时，RPS5基因会激活拟南芥的免疫反应，使其产生一种叫做PAMPs的抗病物质。
具有RPS5基因的拟南芥在受到Pseudomonas syringae的侵染时能够快速抵抗病原体，从而减少了植物的损失。
此外，还有一些其他的关键基因被克隆了出来。
如拟南芥的EDS1和PAD4基因，这两个基因在植物抗病反应中发挥了重要作用。
EDS1和PAD4在植物免疫反应的前线，调控着植物抗病反应中的许多关键基因，从而增强了植物的免疫能力。
二、功能分析研究人员通过功能分析揭示了植物抗病基因在免疫响应中的作用机制。
例如，在拟南芥的抗病性中，RPS5基因的激活能够诱导许多免疫反应的基因，促进植物产生抗病物质。
这些抗病物质可以诱导一系列转录因子的激活，从而增强植物免疫反应。
此外，在MOI1基因的研究中，研究人员发现 MOI1 参与调控 E3 Ligase RING-BOX1（RBX1) 的 Ub 结合活性及其对 PAD4和EDS1的泛素化，从而激活 PAD4 和 EDS1 的活性。
这表明了 MOI1 在调节植物抗病性中的重要作用。
三、意义与展望研究植物抗病基因的意义在于提高植物抗病能力，减少病害对植物生长和产量的损失。
未来，研究人员将继续探索植物抗病性状的分子机制，同时，通过基因编辑技术和基因组学方法，研究人员可以设计出更具抗病性的作物品种，以满足人们对食品的需求。
拟南芥RPT2互作蛋白的筛选及其在植物蓝光反应中的功能分析拟南芥RPT2互作蛋白的筛选及其在植物蓝光反应中的功能分析引言：拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为植物模式生物，在研究光感应机制以及植物生长发育方面发挥着重要的作用。
其中，蓝光反应是植物对光信号的重要响应之一。
在蓝光受体CRY1的调控下，植物的生长和发育过程会受到重大影响。
本文将对拟南芥中的RPT2互作蛋白进行筛选，并对其在植物蓝光反应中的功能进行分析。
方法：首先，通过生物信息学方法，从已知的拟南芥基因组中筛选出潜在的RPT2互作蛋白，筛选标准包括互作蛋白与RPT2的拓扑关系、进化关系以及功能上的相关性等。
随后，利用酵母双杂交技术验证这些潜在互作蛋白与RPT2之间的物理互作关系。
进一步，通过共沉淀实验，确认这些互作蛋白与RPT2的稳定结合。
最后，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建RPT2互作蛋白敲除突变体。
结果：通过生物信息学筛选，我们最终确定了一组可能与RPT2互作的蛋白，包括某些底物蛋白以及与RPT2功能密切相关的调控蛋白。
酵母双杂交实验证实了其中部分蛋白与RPT2之间的物理互作关系。
共沉淀实验证明这些互作蛋白与RPT2确实形成了稳定的复合物。
通过敲除研究，我们发现RPT2与其中某些互作蛋白共同参与了植物蓝光反应的调控。
讨论：本文的研究结果表明，拟南芥中的RPT2与多个蛋白发生互作，在蓝光反应中发挥着重要的功能。
这些互作蛋白涉及到多个植物生长和发育过程的调控，包括种子萌发、幼苗生长和根系发育等。
进一步的研究表明，RPT2与这些互作蛋白之间的互作能够调控特定基因的表达，从而影响植物对蓝光的响应。
此外，我们还观察到，RPT2敲除突变体在蓝光照射下生长缓慢，叶片出现叶绿素含量降低等现象。
这些结果进一步验证了RPT2在植物蓝光反应中的重要作用。
结论：本研究筛选出一组可能与拟南芥RPT2互作的蛋白，通过酵母双杂交和共沉淀实验证实了这些互作关系的物理交互。
拟南芥Ran2基因的原核表达及产物的纯化马立安;江涛;张忠明【摘要】采用RT-PCR方法扩增Ran2 cDNA完整的编码区序列,构建pTYB2-Ran2重组质粒,转化大肠杆菌ER2566,经IPTG诱导蛋白表达后SDS-PAGE分析表达产物及存在形式.结果表明,表达的蛋白26 ku与预期的理论值一致,并以包涵体形式存在;包涵体经纯化、破碎变性、复性及PBS透析,得到纯度较高的表达蛋白(Ran2).【期刊名称】《长江大学学报（自科版）农学卷》【年(卷),期】2007(004)001【总页数】4页(P45-47,60)【关键词】拟南芥(Arabidopsis thaliana);小GTP结合蛋白;Ran2基因;原核表达;蛋白纯化【作者】马立安;江涛;张忠明【作者单位】长江大学生命科学学院,湖北,荆州,434025;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北,武汉,430070;长江大学动物科学学院,湖北,荆州,434025;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】Q784植物细胞分裂后期开始形成细胞板，细胞板以离心生长方式向母细胞壁延伸，到达母细胞壁并与之融合，形成新生细胞壁，将细胞分裂形成2个子细胞[1]。
细胞板的形成是一个连续的膜融合过程，植物动力蛋白成膜素(Phr)在细胞板形成的膜融合中起重要作用[2～4]。
拟南芥( Arabidopsis thaliana) 成膜素相关蛋白1(PhrIP1)与成膜素相互作用，在细胞分裂后期共定位于细胞板上，参与细胞板的形成。
笔者在研究PhrIP1的功能时，应用酵母双杂交技术筛选拟南芥At-ADcDNA文库，获得了与PhrIP1相互作用的蛋白编码基因Ran2。
Ran2基因产物是小型GTP结合蛋白，氨基酸序列与哺乳动物Ran具有很高的同源性，其功能类似于Ran蛋白。
动物Ran蛋白研究比较多，是一种重要的细胞分裂调控因子，参与调控细胞周期中各个时期的许多生命活动，如调控核胞质转运、DNA复制、RNA转录加工与运输；调控微管与纺锤体组装，调控核膜装配[5～7]。
论文第50卷第17期 2005年9月拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析魏刚雷娟巩威朱玉贤*(北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871. *联系人, E-mail: zhuyx@)摘要通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.关键词QRAP2胁迫 DREB酵母单杂交 转录因子干旱是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子. 为了适应或抵抗干旱, 植物会做出一系列适应性的反应来减轻缺水带给细胞的伤害. 近年来的研究表明, 许多基因的表达受到干旱胁迫的诱导. 这些基因的编码蛋白既包括水通道蛋白[1]、LEA蛋白[2]、蔗糖合成酶[3]等功能蛋白, 也包括蛋白激酶[4]、磷脂酰肌醇[5]、转录因子[6]等调控因子. 这些基因组成了复杂的调控网络, 并通过一系列信号转导过程, 将干旱胁迫这种非生物因子转变成对于某些或某类特定基因的诱导表达或抑制, 从而调节植物体内相关的生理生化反应, 增强植物对胁迫的耐受性[7].研究表明, 许多干旱或低温应答基因如kin1, cor6.6, rd17, rd29A等基因的诱导表达与其启动子区域含有的DRE元件有直接关联. DRE元件或含有DRE核心序列(CCGAC)的元件可以在植物中传递对干旱、低温已及高盐等胁迫条件的应答, 而这种应答是不依赖于植物体在受到胁迫后自身产生的ABA的作用[8~12]. rd29A(cor78/lti78)基因编码与LEA蛋白非常相似的亲水蛋白, 可以保护细胞免受水分胁迫的伤害. 该基因的启动子区域同时存在依赖ABA的ABRE元件(ABA responsive element)和不依赖ABA 的DRE元件, 实验证实该基因在干旱开始后几小时内的快速诱导表达不依赖于ABA, 而随后阶段的慢性诱导表达却是依赖于ABA的[8,9,13].DREB是属于AP2/EREBP家族的一类转录因子, 具有保守的AP2/EREBP结构域, 能够与DRE元件特异性结合, 调控其下游基因表达[14~16]. 目前已在拟南芥中克隆了多个编码DREB类转录因子基因, 如DREB2a, DREB2b和CBF4等, 它们在干旱、低温、高盐等胁迫条件下均有很显著的诱导表达特性[17~20]. DREB2a与DREB2b在原生质体瞬时表达系统中可以特异诱导启动子区含有DRE元件基因的表达[19], 而CBF4转基因过表达拟南芥能够在正常条件下表达含有DRE元件的胁迫应答基因, 并在干旱、低温、高盐等条件下显示了更强的耐受能力[20]. 本文克隆了拟南芥中一个富含谷氨酰胺的DREB类转录因子QRAP2基因. 研究发现该基因受干旱强烈诱导表达, 它所编码的蛋白能在体外与DRE序列特异性结合并在酵母中显示了转录激活功能, 我们推测该基因在拟南芥干旱应答途径中具有重要作用.1材料与方法(ⅰ) 植物材料. 哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype)于全自动培养箱(Conviron公司)中培养. 培养条件为22℃, 光照第50卷第17期 2005年9月论文强度100 µE·m−2·s−1, 光照时间16 h. 将处于6~8片莲座叶生长期的拟南芥植株分别进行冷、热、干旱、乙烯、水杨酸、脱落酸、紫外线、NaCl条件下的处理, 具体处理方法参照Gong等人[14]的方法. 处理后的植株保存于液氮中备用.(ⅱ) 氨基酸多序列比对与系统发生分析. 氨基酸多序列比对与系统进化树分析使用Clustal W 1.8.3软件[21]. 参与分析蛋白序列的编码基因的AGI号分别为: ANT, At4g37750; SMZ, At3g54990; SNZ, At2g39250; RAV1, At1g13260; RAV2, At1g68840; RAP2.1, At1g46768; TINY, At5g25810; DDF1, At1g12610; DDF2, At1g63030; CBF1, At4g25490; CBF2, At4g25470; RAP2.4, At1g78080; At2g20880, DREB2B, At3g11020; ABI4, At2g40220; AtERF1, At4g17500; AtERF2, At5g47220.(ⅲ) RNA的提取. 使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN公司)提取拟南芥植株的总RNA, 方法参照QIAGEN公司产品使用手册.(ⅳ) RACE方法获得全长mRNA序列. 根据NCBI (/)预测的QRAP2 的ORF序列设计RACE实验所用的基因特异引物序列为: FP1, 5′-TGAGCAACGACAAGACCCGACAAT- 3′; FP2, 5′-GGAAAGCGAGCTGCATGATTCAAAC- 3′; RP1, 5′-GGCTGTGGCGTTTCAGGTTCTTTCT-3′; RP2, 5′-CCTTGCATTGTCGGGTCTTGTCGTT-3′. 以5 µg 经干旱处理3 h后提取的拟南芥总RNA为起始材料, 使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen公司)获得5′和3′端分别连接上特殊接头序列的cDNA模板, 具体操作方法按照Invitrogen公司产品使用手册进行. PCR扩增采用50 µL 反应体系, 5′ RACE扩增第1轮使用带有接头序列的cDNA作为模板, GeneRacer 5′引物和RP1作为引物; 然后以第1轮扩增产物作为模板进行套式 PCR, 引物采用GeneRacer 5′套式引物和RP2. 3′ RACE扩增方法类似, 2轮PCR的引物分别为GeneRacer 3′引物与FP1, GeneRacer 3′套式引物与FP2. PCR反应条件为: 94℃预变性2 min; 94℃ 30 s, 65~68℃30 s, 72℃ 90 s, 共30个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存. 循环中退火温度根据所选引物而定. 所得5′和3′套式PCR扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳检查, 分别经回收纯化后克隆至pGEM-T easy 载体中测序.(ⅴ) RT-和定量Real-time RT-PCR(QRT-PCR)分析. 分别提取各种条件下处理的拟南芥材料的总RNA 3 µg进行反转录反应. 实验采用Invitrogen 公司的SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒, 生成的第1链cDNA用作RT-PCR 的模板. 用UBQ10作为对照来平衡cDNA模板的用量. PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查. QRT- PCR使用SYBR green PCR试剂盒(Applied Biosys-tems公司)标记反应产物, PCR分析仪器为DNA En-gine Opticon-Continuous Fluorescence Detection Sys-tem (MJ Research公司).(ⅵ) QRAP2的原核表达及纯化. 以pGEX-4T-1为原核表达载体, 设计引物(ORFP1, 5′-AGTAGG- ATCCATGGACTTTGACGAGGAG-3′; ORFP2, 5′-CA- CGCTCGAGTCAAAAGAAAGGCCTCA-3′), 扩增QRAP2的全长读码框, 分别在引物两端引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点, 构建可表达GST-QRAP2融合蛋白的载体. 以干旱处理的拟南芥总RNA样品反转录后的第1链cDNA为摸板, PCR扩增目的片段. 产物经纯化后用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连入pGEX-4T-1, 测序正确后用于原核表达. 将重组质粒pGEX-4T-1-QRAP2转入大肠杆菌BL21, 挑取转化的单克隆菌株, 接入LB培养基中, 37℃, 240 r/min振荡过夜. 将所培养菌液按1︰50转接入2×YPD培养基, 37℃, 240 r/min摇床培养约2 h, 当菌液A600达到0.6~0.8时, 加入IPTG至终浓度为0.4~1 mmol/L进行诱导, 菌体继续在37℃, 240 r/min培养4~6 h后离心收集菌体, 冰浴中超声波破碎菌体, 离心后的上清液用于重组蛋白的纯化. GST-QRAP2融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Bio-tech)纯化, 具体方法参照产品说明书.(ⅶ) EMSA. 取50 ng已纯化的表达蛋白, 加入1 µg 非特异性封闭探针poly(dA- dT), 2 µL 5×结合缓冲液(125 mmol/L HEPES-KOH, 50% 甘油, 200 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT, pH 7.9), 混匀后加入1 pmol 32P标记探针, 最终总反应体系为10 µL. 所用探针序列为: GCC, TAAGAGCCG- CCACT; DRE: ATACTACCGACAT; DRE-2: ATAC- TGCCGACAT; mDRE: ATACTACTTATAT. 混匀反应物后, 在室温下结合2 h 后进行6% 非变性 PAGE 电泳, 电泳缓冲液为0.5×TBE(45 mmol/L Tris-borate, 1 mmol/L EDTA). 电泳后的凝胶经干胶后放入磷屏曝光24 h, 结合活性根据Typhoon 9210 (Amersham Pharmacia Biotech) 所检测的同位素信号强度定量.(ⅷ) 酵母单杂交转录激活活性分析. 按照Ye论文第50卷第17期 2005年9月等人[22]改进的方法进行转录激活活性分析. 将含有pG221质粒的酵母菌株EGY48接进50 mL SC-Ura培养基中, 30℃, 250 r/min培养16~18 h, 至平台期(A600 >1.5). 1:10转接使得最终A600 = 0.2~0.3. 30℃, 230 r/min培养3 h, 使得最终A600 = 0.4~0.6. 取菌液50 mL室温1000×g离心5 min; 弃上清, 30 mL ddH2O重悬, 室温1000×g离心5 min, 弃上清, 加入1.5 mL 预冷的1×TE/LiAc重悬制得酵母感受态细胞. 将0.1 µg 待转化pYF503质粒及0.1 mL 酵母感受态细胞混匀, 加入0.6 mL PEG/LiAc 溶液, 200 r/min, 30℃培养30 min, 加入70 µL DMSO, 轻轻颠倒混匀, 42℃热激15 s, 冰上放置1~2 min, 14000 r/min离心5 s. 弃上清, 加入0.5 mL 1×TE溶液重悬, 取100 µL涂在SC- Ura-Trp培养基上30℃培养2~3 d. 将长出的酵母菌落在SC-Ura-Trp+Xgal显色平板上划线, 30℃培养2 d 后观察显色情况.2结果与讨论2.1 QRAP2的克隆及序列分析根据对拟南芥ATH1芯片数据的分析, 发现一个干旱处理后表达量提高10倍以上的cDNA, 将其命名为QRAP2. 通过RACE方法, 获得该基因的全长, 1218 bp. 在该cDNA起始密码子ATG上游21 bp处出现了一个终止密码子, 可读框下游876 bp后出现终止密码子, 推测编码一条含292氨基酸残基的多肽. 序列已递交到GenBank数据库, 登录号为DQ011579. 该基因的AGI 号为At4g28140. 多序列比对结果显示, QRAP2编码蛋白含有一段典型的AP2/EREBP保守结构域(图1(a)), 该结构域在氨基酸水平上与多个已报道的拟南芥AP2家族转录因子具有很高的相似性(图1(b)). 系统进化树分析表明, QRAP2在氨基酸水平上与DREB亚家族转录因子更为接近, 而与AP2和RAV 2个亚家族则距离相对较远(图1(c)).2.2 QRAP2 mRNA的转录水平检测RT-PCR与QRT-PCR结果表明, QRAP2在未处理的拟南芥植株中表达量极低, 而在经干旱、紫外线照射、ABA(脱落酸)、NaCl以及SA(水杨酸)等处理后表达量分别提高了431, 128, 102, 65, 4倍(图2(b)). 我们进一步研究了QRAP2在不同干旱处理时间下的表达状况, 发现该基因在干旱处理30 min时表达量即提高了32倍, 短时间内表达量急剧升高, 在3 h时表达量升高到对照样本的400多倍, 而接下来QRAP2的表达量开始逐渐下降, 并在24 h后降为对照样本的7倍(图3(b)). 对照CBF1, CBF2, CBF3, DREB2A 等已报道的DREB亚家族成员在受到干旱, 低温等胁迫条件下的表达情况, 发现这类基因都具有同QRAP2相似的表达模式, 即短时间内表达量迅速提高, 在2~5 h内达到最高值, 而后表达量逐渐下降, 并在24 h以后降至本底或略高于本底水平[19,23]. 另外, Takahashi 等人[24]应用cDNA 微阵技术检测到At4g28140在甘露醇(造成与干旱相似的渗透压胁迫)和高盐胁迫下有很强的诱导表达(表达量提高5倍以上), 与本研究中QRAP2 表达谱的RT-PCR研究结果基本相符. Marathe 等人[25]同样用ATH1 芯片检测到At4g28140 在拟南芥受到植物病毒CMV-Y侵染后表达水平下降到一半以下, 推测该基因可能参与植物防御反应.2.3原核表达的QRAP2重组蛋白与DNA结合特性分析与未诱导的已转入pGEX-4T-1-QRAP2质粒的大肠杆菌菌体总蛋白相比, 经IPTG诱导的菌体总蛋白表达出一表观分子量约为60 kD的蛋白条带, 相当于QRAP2蛋白(理论分子量33 kD)加上GST 标签蛋白(理论分子量26 kD). 该蛋白主要存在于包涵体中, 小部分溶于上清. 通过Glutathione Sepharose 4B亲和柱层析, 从上清中纯化了该重组蛋白. 用纯化的QRAP2重组蛋白进行EMSA实验, 实验结果表明QRAP2与DRE元件序列和DRE2元件序列均有很强的结合能力, 而几乎完全不能与GCC及mDRE元件序列(DRE元件结合中心区4个碱基CGAC突变为TTAT)相结合(图4). DRE与DRE2序列都含有核心序列CGAC, 这4个碱基对于QRAP2蛋白与DNA的结合至关重要. DREB和ERF是AP2家族中很相近的2个亚家族, 它们在AP2/ERF结构域上的细微差别使得它们对于DRE和GCC元件具有明显不同的结合偏好[16,26]. 因此, 本研究证明QRAP2属于DREB而不是ERF亚家族.2.4 QRAP2转录激活活性分析将表达GAL4结合结构域与QRAP2的融合蛋白的质粒转入酵母中, 能够使GAL4顺式序列调控下的报告基因LacZ得到表达, 形成蓝色菌落(图5), 表明QRAP2具有转录激活活性. 通过对QRAP2编码蛋白序列的分析, 我们发现在N端67~107这一段区域中第50卷 第17期 2005年9月论 文图1 QRAP2 蛋白序列分析(a) 根据氨基酸序列预测的QRAP2的结构域框架图; (b) 部分拟南芥DREB 转录因子中AP2/EREBP 结构域多序列比对结果;(c) QRAP2基因在拟南芥AP2/EREBP 家族系统树中的定位分析谷氨酰胺残基含量高达43.9%, 并有一串8个连续的谷氨酰胺残基. Gerber 等人[27]发现富含谷氨酰胺残基, 特别是形成6个以上连续谷氨酰胺残基串的短肽具有很强的转录激活活性. QRAP2的转录激活活性也很可能与这一段富含谷氨酰胺残基的区域有关. 进一步的实验证实了这一推测. 当GAL4结合结构域与QRAP2 N 端112个氨基酸残基融合表达时, 可以激活LacZ 的表达; 而GAL4结合结构域与QRAP2 C 端113~292位氨基酸残基融合表达时, 不能激活LacZ 的表达.综上所述, QRAP2是拟南芥中受干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等多种胁迫条件诱导的论文第50卷 第17期 2005年9月图2 不同胁迫条件下拟南芥QRAP2的表达谱分析(a) 不同胁迫条件下QRAP2的RT-PCR 结果; (b) 不同胁迫条件下QRAP2的Real-time RT-PCR(QRT-PCR)结果. 图中纵坐标为QRAP2在经胁迫条件处理的样本中的相对表达量与未处理样本(CK)中相对表达量的比值图3 不同干旱时间处理后拟南芥QRAP2的表达谱分析(a) 不同干旱时间处理后QRAP2的RT-PCR 结果; (b) 不同干旱时间处理后QRAP2的QRT-PCR 结果. 图中纵坐标为QRAP2不同干旱时间处理下样本中的相对表达量与未处理样本(0 h)中相对表达量的比值AP2/EREBP 转录因子家族新基因, 经干旱诱导后其表达量在短时间内迅速升高超过400倍, 而其编码蛋白具有特异结合DRE 元件和转录激活活性, 极有可能作为转录因子在胁迫条件下参与激活下游相关应答基因从而在植物抗逆过程中发挥关键性作用.AP2/EREBP 家族转录因子的许多成员参与了植物抗逆反应, 如已报道的CBF 成员参与植物低温胁迫反应, DREB2A, DREB2B 参与植物干旱、高盐胁迫反应, ABI4 参与ABA 依赖型的转录调控过程. 这些基因大部分在正常条件下表达量较低, 受到相应胁图4 QRAP2 蛋白与DNA 元件结合能力分析1, GST 与DRE 混和; 2, QRAP2蛋白与DRE 混和; 3, QRAP2蛋白与DRE2混和; 4, QRAP2 蛋白与mDRE 混和; 5, QRAP2 蛋白与GCC 混和图5 酵母单杂交鉴定QRAP2转录激活活性将图中所示的基因或基因片段分别克隆到pYF503中(GAL4 AD 为GAL4 激活结构域, empty vector 表示无基因克隆到pYF503中), 转入酵母中表达N 端带有GAL4 DNA 结合结构域的融合蛋白, 按文献[22]所示方法进行分析迫条件的诱导后表达. 由于它们能够识别特定的DNA 顺式元件并具有转录激活活性, 能激活相应的效应基因从而作出对胁迫条件的应答. 大多数已研究的转录调控因子基因在过表达植株中均能上调含相应特定DNA 启动子元件的效应基因的表达, 如AP2/EREBP 家族转录因子CBF 提高转基因植物耐冷性就是通过诱导COR 基因高表达而实现的[28]. 本研究表明, 对此类转录因子基因功能的研究将有助于第50卷第17期 2005年9月论文阐明植物胁迫应答的调控机理.致谢本工作为国家自然科学基金资助项目(批准号: 30221120261).参考文献1 Schäffner A R. 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