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NGAL的结构与功能研究进展许丽艳;李恩民;熊华淇【期刊名称】《生命科学》【年(卷),期】2002(14)1【摘要】NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是一种新的lipocalin,其结构与功能的研究进展为人瞩目。
目前认为ＮＧＡＬ具有运输疏水性小分子，调节明胶酶B(gelatinase B或matrixmetalloproteinase-9,ＭＭＰ－９）活性等功能，并可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等过程。
最近，ＮＧＡＬ蛋白的空间结构已被研究清楚。
这对于促进ＮＧＡＬ生物学作用或功能的研究，特别是对其新的生物学作用或功能的探索，比如与肿瘤的关系（ＮＧＡＬ可能是一种新的癌基因或促癌基因）将具有十分重要的意义。
对此作者进行了综合评述。
【总页数】3页(P27-29)【关键词】NGAL;基因结构;蛋白质结构;MMP-9;肿瘤;癌基因【作者】许丽艳;李恩民;熊华淇【作者单位】汕头大学医学院肿瘤病理研究室;汕头大学医学院生化与分子生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q71;R730.2【相关文献】1.NGAL在诊断肝硬化患者急性肾功能损伤中的研究进展 [J], 葛斌2.NGAL对肾移植术后移植肾功能诊断价值的研究进展 [J], 龚小波3.NGAL的结构与功能及其在肾脏疾病中的作用 [J], 陈莹;陈明4.NGAL的结构功能及其在慢性肾脏病中的作用 [J], 龚淑文;沈水娟;何剑零5.糖原组学研究进展——β-葡聚糖的结构和功能的研究进展 [J], 李万坤;闫鸿斌;才学鹏;郭福存因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
NGAL联合甲胎蛋白检测对原发性肝癌的诊断价值张敏敏;胡秋月;余祖江【摘要】目的探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)联合甲胎蛋白(AFP)对原发性肝癌的诊断价值.方法收集2016年4月至2017年5月郑州大学第一附属医院收治的48例原发性肝癌患者,选择同期住院的43例良性肝病患者以及46例健康体检者,将患者分为肝癌组、良性肝病组、健康对照组.分析3组患者血清NGAL、AFP及NGAL联合AFP检测对原发性肝癌的诊断价值.结果肝癌组中血清NGAL及AFP浓度均高于良性肝病组及健康对照组,差异有统计学意义(P均<0.05),AFP和NGAL联合检测肝癌的敏感度高于单独检测,差异有统计学意义(P<0.05).结论血清NGAL和AFP联合检测的诊断效果高于单独检测,可提高肝癌的检出率.【期刊名称】《河南医学研究》【年(卷),期】2017(026)024【总页数】3页(P4441-4443)【关键词】中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白;甲胎蛋白;原发性肝癌【作者】张敏敏;胡秋月;余祖江【作者单位】郑州大学第一附属医院感染病科河南郑州 450052;郑州大学第一附属医院感染病科河南郑州 450052;郑州大学第一附属医院感染病科河南郑州450052【正文语种】中文【中图分类】R735.7原发性肝癌(primary carcinoma of the liver，PHC)简称肝癌，是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中居第2位，组织类型主要包括肝细胞肝癌(hepatocellular caricinoma，HCC)、胆管细胞癌和混合型肝癌，其中肝细胞肝癌占原发性肝癌的90%[1]。
肝癌起病隐匿，早期缺乏典型的临床症状。
终末期肝癌患者往往失去手术及局部治疗的最佳时期，严重影响肝癌患者的生存及预后。
因此肝癌早期发现、早期诊断、早期治疗尤为重要。
临床上常采用血清肿瘤标志物检测肝癌，其中甲胎蛋白阳性率较高，现已广泛用于肝癌的普查、诊断、判断疗效及预测肝癌复发[2]，但AFP假阴性较高。
NGAL及其受体在大肠腺瘤-癌序列转化及血管生成中的作用的开题报告背景：大肠癌是全球范围内的严重健康问题，它是第三常见的癌症类型。
现有的医学手段如肿瘤切除术和化疗虽然可以缓解大肠癌患者的症状，但并不能够完全治愈这种疾病。
因此，深入研究大肠癌的发病机制和治疗方法具有重要价值。
近年来，关于NGAL及其受体在大肠癌中的作用已经引起了广泛的关注。
NGAL是一种与癌症相关的蛋白质，它能够调节癌细胞的增殖和迁移，同时也参与调控其血管生成。
NGAL的两个受体，LPTN和24p3R，也参与了大肠癌的发生发展。
因此，深入研究NGAL及其受体在大肠癌中的作用，对于深入理解大肠癌的发病机制具有重要意义。
研究目的：本文的研究目的是探究NGAL及其两个受体，在大肠腺瘤-癌序列转化及血管生成中的作用。
研究内容：1.大肠腺瘤、大肠癌及对照组标本采集；2.实验组针对NGAL及其受体LPTN、24p3R的表达量进行检测及分析；3.对实验组标本进行HE染色，观察肿瘤组织的结构和形态变化；4.对实验组标本进行免疫组化染色，检测NGAL及其受体在癌细胞和血管内皮细胞的表达情况；5.应用细胞系进行细胞增殖、细胞迁移应答和管形成实验，检测NGAL及其受体LPTN、24p3R在肿瘤细胞增殖、迁移和管形成中的作用。
预期结果：1. NGAL及其受体LPTN、24p3R在大肠腺瘤-癌转化过程中表达量的变化特点；2. NGAL及其受体在大肠癌血管生成过程中的具体作用机制；3. NGAL及其受体在肿瘤细胞增殖、迁移和管形成中的作用机制。
意义：本研究可以为揭示NGAL及其受体在大肠癌中的作用机制提供实验依据。
同时，对于大肠癌的发病机制的深入理解和开发针对性的治疗手段也有很大帮助。
NGAL在结肠癌中的表达及其与预后关系的初步探
讨的开题报告
1. 研究背景与意义
结肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病和死亡率在全球范围
内均居前列。
目前，早期诊断和预后评估是结肠癌临床治疗的重要问题。
生化标志物的检测作为一种非侵入性的诊断方法，已成为临床上广泛应
用的手段之一。
NGAL是一种特异性较高的生化指标，其在多种恶性肿瘤中的表达具有较高的敏感性和特异性。
在结肠癌中，NGAL可能作为预测肿瘤进展和患者预后的潜在生物标记物，但目前尚未得到充分的研究探讨。
2. 研究内容和方法
本研究将采用免疫组织化学方法检测结肠癌和正常结肠组织中NGAL 的表达，比较两者间的表达差异，并探讨NGAL表达与结肠癌患者临床病理特征和预后的关系。
研究对象为近年来在本院诊治的结肠癌患者，符
合纳入标准者将纳入研究。
研究数据将采用SPSS软件进行统计学分析，并绘制生存曲线评估NGAL表达与患者预后的关系。
3. 预期研究结果
预计本研究将初步探讨NGAL在结肠癌中的表达情况，并分析NGAL 表达与患者预后的关系。
结果将为结肠癌的早期诊断和预后评估提供新
的思路和方法，为结肠癌临床治疗提供有益的参考和指导。
4. 研究局限性和不足之处
本研究仅选取本院近年来在诊治结肠癌方面有一定代表性的患者为
研究对象，结果可能受到样本选择的影响。
另外，研究结果将缺乏多中心、大样本的验证。
因此，研究结论的可靠性还需经过更加严格、全面
的研究证实。
NGAL 临床应用介绍NGAL 临床应用介绍NGAL（Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin）是一种与中性粒细胞胶原酶相关的脂质载体蛋白，广泛存在于多种组织和细胞中。
近年来，NGAL逐渐成为了临床上一个重要的生物标志物，可用于评估肾脏功能和诊断肾脏疾病。
以下是NGAL在临床应用中的相关内容。
1.NGAL的生物学特性●NGAL的结构和功能●NGAL的表达和分泌机制2.应用于急性肾损伤的临床评估●NGAL作为早期诊断指标的优势●NGAL在评估肾脏损伤严重程度中的作用●NGAL在预测肾脏功能恢复的价值3.NGAL与慢性肾脏疾病的关系●NGAL在慢性肾脏疾病早期诊断中的应用●NGAL在慢性肾脏疾病进展预测中的作用●NGAL作为监测慢性肾脏疾病治疗效果的指标4.NGAL在其他临床应用中的潜力●NGAL与心脑血管疾病的关系●NGAL在冠状动脉疾病中的作用●NGAL在癌症检测和预后评估中的应用附件：在附件一中包含NGAL相关的研究论文和临床应用案例，供参考使用。
法律名词及注释：1.生物标志物：指在生物体内，可能与疾病发生和发展有关的特殊分子或物质。
2.临床评估：指医生根据患者症状、体征和相关检查结果，对疾病的病情进行全面评估的过程。
3.急性肾损伤：指突然发生的影响肾脏功能的疾病或损伤，可导致肾脏功能不全。
4.慢性肾脏疾病：指持续时间较长、进展缓慢的导致肾脏功能逐渐减退的疾病。
5.早期诊断指标：指可以在疾病早期阶段就能准确判断是否存在疾病的指标。
6.治疗效果监测：指在治疗过程中，通过监测指标的变化来评估治疗效果的方法。
7.冠状动脉疾病：指冠状动脉发生狭窄、堵塞等异常，导致心肌供血不足的疾病。
8.癌症检测：指通过检测特定指标或异常变化，来判断是否存在癌症的方法。
ｐ２７Ｋｍｌ基因在肝细胞肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞的细胞周期和凋亡的调控作用博士研究生导师摘要郑建勇李开宗教授（细胞周期和细胞凋亡的调控在肿瘤的发生、发展和治疗中具有重要的意义。
探索细胞周期和细胞凋亡的调控机制将为肿瘤的治疗提供新的理论依据。
肝细胞肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率居第二位。
肝癌的手术切除复发率高，放疗和化疗敏感性低，免疫治疗和介入治疗效果均不理想。
随着分子生物学的发展，肿瘤的基因治疗已经成为理想的治疗手段。
ｐ２７“”是一种细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白，通过与各种ｃｙｃｌｉｎ．ＣＤＫ复合物的相互作用，并抑制它们的活性，促使细胞周期停滞于Ｇ。
期，从而实现对细胞周期的负调控作用。
最新研究发现ｐ２７“”能够诱导细胞凋亡。
广一石本文旨在探讨ｐ２７“”基因的表达与肝细胞肝癌发生、发展的关系，并研究ｐ２７““基因对肝癌细胞的绁胞周期和绁胞凋亡的潜在调节作用，为肝细胞肝癌的基因治疗提供实验材料和理论依据。
庠研究的主要内容和结果如下：１．利用ＤＮＡ缺口末端标记技术（ＴＵＮＥＬ）和免疫组织化学方法，检测３３例肝细胞肝癌中凋亡和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达。
凋亡阳性细胞为胞核呈兰紫色颗粒，ＰＣＮＡ染色阳性为细胞核呈棕黄色颗粒状。
肝癌组织的凋亡指数ＡＩ（Ｏ．４０）和ＰＣＮＡ指数ＰＩ（２６７５）都明显高于癌旁肝组织的ＡＩ（０１１）和ＰＩ（７．６３），并且在包膜受侵犯者及低分化的癌组织中ＡＩ和ＰＩ都明显增高，此外，增殖越迅速的癌组织，其凋亡的发生也就越高。
２．应用免疫组织化学和ｍＲＮＡ原位杂交方法，对５２例肝细胞肝癌中ｐ２７“…蛋白和ｍＲＮＡ的表达进行了检测。
结果显示ｐ２７“”基因的表达主要位于肝或肝癌细胞的胞核中，呈细颗粒状分布。
ｐ２７“”蛋白在癌旁肝组织中的阳性细胞指数（１０７±７６）明显高于癌组织（１５±０．９），并且ｐ２７“”表达的阳性细胞指数与ＨＣＣ细胞的分化程度呈正相关，而ｐ２７ＫＩＰｌｍＲＮＡ杂交阳性物呈兰色细颗粒状，主要位于肝或肝癌细胞的胞核和胞浆中，ｍＲＮＡ阳性的细胞分布更广泛，但在癌旁肝组织和不同分级的ＨＣＣ组织中ｐ２７ＫＩＰＩｍＲＮＡ的阳性细胞指数无明显差异。
胃癌细胞中调控 NGAL 基因表达的关键转录因子鉴定1袁华敏 1,2，许丽艳 2，常静霞 1,2，张发仁 1,2，杜则澎 3，蔡唯佳 2，吕琢 1,2， 李恩民 11 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，汕头 (515041) 2 汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东省免疫病理重点实验室，汕头 (515041) 3 汕头大学理学院生物系，汕头 (515063)E-mail：nmli@摘 要： 本文主要探讨了胃癌组织细胞中 NGAL 基因的表达及其分子调控机制。
免疫组织化 学染色显示， NGAL 蛋白在不同分化程度的胃腺癌中呈阳性表达， 而在正常胃腺上皮组织中 呈阴性表达；在胃癌细胞系 BGC-823 和 SGC-7901 中，NGAL 分别呈强阳性和弱阳性表达。
双荧光素酶报告基因检测显示，在胃癌细胞 BGC-823 中 NGAL 基因启动子区核心调控元件 位于转录起始位点上游-110~-79；而进一步的突变和缺失分析确认，其间的-85~-79 是转录 因子结合的关键位点。
生物信息学分析发现，-85~-79 区段是 AP1 转录因子家族成员结合位 点。
而进一步的 RT-PCR 发现，BGC-823 细胞中有多种 AP1 家族成员的表达。
推测 AP1 家 族成员可能是胃癌细胞中 NGAL 基因表达的关键转录调控因子。
关键词：NGAL，胃癌，转录因子，AP1 家族 中图分类号：Q784；R735.11. 引言NGAL（neutrophil gelatinase—associated lipocalin）基因蛋白编码产物，即中性粒细胞明 胶酶相关脂质运载蛋白，是 1993 年 Kjeldsen 等人在研究中性粒细胞的明胶酶（gelatinase B， 即 MMP-9）时首先发现的[1]。
十多年来的研究表明，NGAL 与炎症、免疫反应、细胞分化、 细胞凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关；而 NGAL 基因表达已被当作 一种早期的、灵敏的、非损伤性的标记物，用于肾缺血及肾毒性损伤监测[2]。
NGAL、MMP-9在食管癌中的表达及其相关性分析
的开题报告
1. 研究背景
食管癌是一种恶性肿瘤，其发病率逐年上升。
NGAL（中性粒细胞明胶酶相关蛋白）和MMP-9（基质金属蛋白酶9）是两种与癌症有关的蛋白质，已被证明与多种恶性肿瘤的发生和发展有关。
虽然有研究表明NGAL和MMP-9在食管癌中也有表达，但其在食管癌中的相关性仍需进一步研究。
2. 研究目的
本研究旨在探究NGAL和MMP-9在食管癌中的表达情况，并分析其相关性，为食管癌的预防和治疗提供理论依据和参考。
3. 研究方法
本研究拟收集100例食管癌患者的组织样本和相应的临床资料。
通过免疫组化技术检测NGAL和MMP-9在食管癌组织中的表达，并根据结果进行分析。
同时，对收集的临床资料进行统计学分析，探究NGAL和MMP-9表达与食管癌患者临床特征之间的相关性。
4. 研究意义
本研究可探讨NGAL和MMP-9在食管癌中的作用，为食管癌的早期诊断和治疗提供依据。
同时，可为影响食管癌发生和发展的因素提供新思路和新的治疗方法。
5. 研究进展
目前，本研究已完成食管癌患者的临床资料收集和组织样本处理。
正在进行免疫组化实验和统计学分析，数据将进一步分析和解释。
NGAL在食管癌中的表达及意义作者单位：519000 中山大学附属第五医院通讯作者：苟新敏目的探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）在食管癌中的表达及其临床意义。
方法应用免疫组织化学方法检测NGAL在50例食管癌和10例正常食管组织中的表达，分析其与病变类型的关系及其在食管癌组的表达率与临床病理特征的联系。
结果NGAL在食管癌中显著表达。
结论NGAL可能在检测食管癌发生、进展、转移中具有一定作用。
标签：NGAL；食管癌；免疫组织化学中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是Lipocalin家族的新成员，于1993年在人中性粒细胞中被发现和分离出来［1］。
近年来，NGAL与人类肿瘤的关系受到了人们的重视，并在NGAL 基因的功能以及NGAL在人体正常和肿瘤组织中的表达特征方面取得了一些有意义的进展。
本研究采用免疫组织化学方法检测50例食管癌中NGAL蛋白的表达水平，探讨其在食管癌中的表达特点及其临床意义。
1 资料与方法1.1 组织标本和一般资料选取2003～2010年在中山大学附属第五医院行初次手术且有完整临床病理资料存档的食管癌组织石蜡标本50例（术前均未行化疗、放疗或生物治疗），中位年龄55岁（36～69岁）。
肿瘤发生部位：上段12例，中段26例，下段8例，未特指部位4例。
病理类型：鳞状细胞癌28例，腺癌14例，其他类型8例。
淋巴结转移：有转移33例，无转移17例。
正常食管组织10例，以已知乳腺癌阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
所有标本均经HE染色证实诊断。
1.2 主要试剂及检测方法鼠抗人NGAL单克隆抗体购于美国R&D公司，免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。
采用免疫组织化学二步法，石蜡切片逐级脱蜡至水，抗原修复，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min。
甲胎蛋白、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶在原发性肝癌诊断价值分析摘要】目的：分析对于原发性肝癌患者通过联合检测甲胎蛋白、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶的临床诊断价值。
方法：抽取2018年1月—2019年12月本院37例原发性肝癌患者（为观察组）及40名健康体检者（为对照组），两组均接受AFP、AFU、LAP检测并计算诊断效能。
结果：两组的AFP、AFU、LAP测定结果比较中P＜0.05；AFP+AFU+LAP联合检测的诊断敏感度、特异度均高于AFP、AFU、LAP单项检测，且比较中P＜0.05。
结论：通过对AFP、AFU、LAP进行联合检测可有效提升原发性肝癌患者的诊断价值。
【关键词】原发性肝癌；诊断；AFP；AFU；LAP【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2020）15-0108-02原发性肝癌的恶性程度高且患者病死率高，通过早期诊断及治疗有利于改善患者的预后，因此做好患者的疾病早期诊断意义重大。
目前对于原发性肝癌患者的诊断多运用病理学检查、血清肿瘤标志物测定和影像学检查等，其中血清肿瘤标志物测定法具有价格低廉以及无创性高等优势，在恶性肿瘤疾病患者的早期发现和筛查中均发挥着重要作用[1]。
为此，以下将探究在原发性肝癌患者中通过对甲胎蛋白（AFP）、α-L-岩藻糖苷酶（AFU）以及亮氨酸氨基肽酶（LAP）三项指标进行联合测定的临床诊断价值。
1.资料及方法1.1 临床资料抽取2018年1月—2019年12月本院37例原发性肝癌患者及40名健康体检者，分组为观察组（肝癌组）：37例，男/女：24/13；年龄43～79岁，平均为（65.2±0.3）岁。
对照组（健康组）：40名，男/女：23/17；年龄40～80岁，平均为（65.9±0.2）岁。
两组临床资料对比P＞0.05。
1.2 方法两组受检者均于清晨维持空腹状态对其静脉血进行采集，分离血清后需要于2小时内进行相关指标测定。
NGAL基因在肺癌中的表达及功能研究的开题报告一、研究背景与意义肺癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居全球癌症之首。
虽然肺癌的病因和发病机制已经有了一定的了解，但其诊治仍面临很大挑战，特别是早期诊断和治疗靶点的确定等方面。
因此，需要从肺癌分子水平寻找新的治疗靶点和早期诊断指标。
NGAL（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是一种由中性粒细胞分泌的小分子蛋白质，其在机体炎症和肿瘤发生过程中具有重要的表达和调节作用。
近年来，有研究表明，NGAL基因在多种肿瘤中异常表达，并且参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等过程。
但是，对于NGAL 基因在肺癌中的表达及其功能的研究还比较有限，尚未得到充分的深入认识。
因此，本次研究旨在探究NGAL基因在肺癌中的表达情况，并进一步探讨其在肺癌发生发展过程中的作用，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的理论和实验依据。
二、研究内容和方法1.收集肺癌患者组织标本通过手术或活检采集肺癌患者组织标本，并根据组织学和病理学特点将其分为肺鳞状细胞癌、腺癌和小细胞肺癌等不同类型。
同时，收集一定量的正常肺组织标本作为对照组。
2.检测NGAL基因表达的量和水平采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测NGAL基因在肺癌组织和对照组中的表达水平，并同时检测NGAL蛋白在组织中的分布情况。
3.分析NGAL基因与肺癌的相关性通过统计学方法分析NGAL基因的表达水平与患者临床病理特征、生存情况等的相关性，评估NGAL基因在肺癌发生和发展中的作用。
4.原代肿瘤细胞系的构建及细胞实验通过建立肺癌原代细胞系，考察NGAL基因在肺癌细胞的增殖、侵袭和转移等生物学过程中的作用，为进一步探究NGAL基因与肺癌的相关机制提供细胞实验支持。
三、研究意义和创新点本研究将在深入探索NGAL基因在肺癌发生和发展过程中的作用，揭示肺癌分子机制的新领域，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的思路和指导。
NGAL在胃癌中的调控机制研究的开题报告一、研究背景和意义胃癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内都较高。
目前，在临床上治疗胃癌的方法有手术、放疗、化疗等，但治疗效果相对较差。
因此，寻找新的治疗方法和诊断指标非常必要。
NGAL（Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin）是一种由中性粒细胞产生的蛋白质，具有重要的生物学功能。
NGAL在炎症和肿瘤中有着重要的调节作用。
研究表明，在胃癌中NGAL表达水平升高，因此NGAL可能参与了胃癌的发生和发展。
本研究旨在探究NGAL在胃癌中的调控机制，以期为胃癌的治疗和诊断提供新的思路和方法。
二、研究目的和内容目的：探究NGAL在胃癌中的调控机制，揭示NGAL参与胃癌发生和发展的机制。
内容：1. 分析胃癌组织和正常胃组织中NGAL的表达水平，筛选出NGAL在胃癌中显著高表达的样本。
2. 在NGAL高表达样本中筛选出NGAL与相关信号通路相关的基因，并利用生物信息学分析实验分析其功能和相互关系。
3. 在细胞实验中，通过下调NGAL的表达，观察其对胃癌细胞增殖和侵袭的影响。
同时，利用Western blot和实时荧光定量PCR技术，探究调控NGAL表达的分子机制。
4. 结合病理学和免疫组化技术，对胃癌组织中NGAL的表达和表达的分布进行研究，探究其与胃癌患者的临床病理参数（如肿瘤大小、淋巴结转移、预后等）的关系。
三、研究方法和技术路线1. 实验材料：包括胃癌组织、正常胃组织、胃癌细胞株以及细胞培养基等。
2. 实验方法：(1) Western blot：将细胞或组织的蛋白进行电泳分离，并用特异性抗体检测感兴趣的蛋白质。
(2) 实时荧光定量PCR：利用荧光探针或SYBR Green对DNA扩增反应实时检测。
(3) 免疫组化：利用特异性抗体将感兴趣的蛋白在组织切片上检测。
(4) 生物信息学分析：利用生物信息学软件对基因序列、功能、表达谱等进行分析。
肺鳞癌及腺癌中NGAL表达的免疫组化研究王彩纹;刘翼军;熊国亮;余少良【摘要】目的：探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)在肺鳞癌及腺癌组织及远癌组织中的表达及与临床病理因素的关系。
方法应用免疫组织化学方法检测NGAL在35例肺鳞癌、30例肺腺癌组织及相应42例癌旁肺组织中的表达，分析其与病变类型的关系及其在癌组织的表达率与临床病理特征的联系。
结果 NGAL 在肺腺癌组织中的阳性表达率明显高于肺鳞癌组织；而二类癌组织中的阳性表达率又明显高于相应的癌旁组织，淋巴结转移组高于无淋巴结转移组。
阳性表达与患者年龄、性别、吸烟情况、病理类型、分化程度无关(P>0.05)。
结论 NGAL在肺鳞癌及腺癌肿瘤组织内的高表达，且与肿瘤类型有关，有可能成为预测肺鳞癌及腺癌发生发展的肿瘤标志物。
%Objective To investigate the expression of Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in the correlation with clinicopathological characteristics of pulmonary squamous carcinoma and adenocarcinoma. Methods NGAL protein expression was detected in 35 cases of pulmonary squamous carcinoma and 30 cases of adenocarcinoma using streptavidin-peroxidase im-munohistochemistry. The adjacent normal tissues were detected by the same methods as control. The relationship between NGAL protein expression and the clinical data was analyzed. Results NGAL expression was significantly higher in adenocarcinoma of the lung than that in squamous carcinoma and the positive expression rates in two groups were significantly higher than that in adja-cent carcinoma tissues. Positive NGAL expression in the lymph node metastasis group was significantly higher than that in the non-lymphnode metastasis group (P<0.05). No significant differences in positive NGAL expression were observed with age, smok-ing, gender, pathology type and degree of differentiation among the SCC patients(P>0.05). Conclusion NGAL expression was high-er in adenocarcinoma of the lung than that in squamous carcinomas. In addition to the degree of differentiation and extent of lym-phatic metastasis, NGAL expression is correlated with TNM stage, which indicates that NGAL may be related to the occurrence, development and metastasis of lung cancers.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】NGAL;肺鳞癌及腺癌;免疫组织化学【作者】王彩纹;刘翼军;熊国亮;余少良【作者单位】江西省胸科医院，江西南昌330006;江西省胸科医院，江西南昌330006;江西省胸科医院，江西南昌330006;江西省胸科医院，江西南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R734.2;R446.62中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) 是lipocalin家族的一个成员，在中幼粒细胞和晚幼粒细胞分化阶段合成，其功能尚不清楚[1]。
原发性肝癌患者血清AIF RIA结果分析
李立人
【期刊名称】《放射免疫学杂志》
【年(卷),期】1994(7)1
【摘要】肝脏含有丰富的铁蛋白，也是清除循环中铁蛋白的主要场所。
近年的研究发现，原发性肝癌(PLC)增高的铁蛋白主要是酸性铁蛋白，提示酸性铁蛋白增高是PLC的一个生物学标志，可以用于对PLC的诊断。
1977年，Drysdale等建立了酸性铁蛋白的放射免疫测定。
国内有关酸性铁蛋白的报道不多。
【总页数】1页(P14)
【作者】李立人
【作者单位】广东省人民医院核医学科
【正文语种】中文
【中图分类】R735
【相关文献】
1.原发性肝癌患者血清酸性铁蛋白RIA结果分析 [J], 李立人;季良媛
2.原发性肝癌患者血清TNF RIA [J], 王小春
3.原发性肝癌患者血清CG、HA RIA含量与其预后的关系 [J], 陈耀金
4.血清AIF、SF、AFP、CEA RIA在原发性肝癌及肺癌诊断中的临床价值 [J], 齐法莲
5.原发性肝癌患者血清AIF-RIA的临床意义 [J], 叶飞
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
MyoD调控肺癌细胞中NGAL基因的基础表达1常静霞1,2，许丽艳2，袁华敏1,2，杜则澎3，蔡唯佳2，李恩民11汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，汕头 (515041) 2汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东省免疫病理重点实验室，汕头 (515041)3汕头大学理学院生物系，汕头 (515063)E-mail：nmli@摘要：中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）是lipocalin家族的一个成员。
研究发现NGAL基因在许多肿瘤组织细胞中过表达，然而过表达的表达调控机制尚不清楚。
本文以肺癌细胞系A549和95D为研究对象，通过对NGAL启动子区(-1431~+84)的缺失和突变分析，检测报告基因活性，研究发现含有肌肉调节因子（MRFs）结合位点的-106~-79区间可能是NGAL基因的最小功能启动子区。
而进一步的凝胶滞留、超滞留实验和Western blotting检测证明MRFs 家族中的MyoD能够调控NGAL基因的基础转录活性。
关键词：NGAL，转录调节因子，MyoD，最小功能启动子区，肺癌细胞中图分类号：Q784；R735.11.引言中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL），是1993年由Kjeldsen 等人在中性粒细胞内首先发现的25 kD糖蛋白，是脂质运载蛋白（Lipocalin）家族的成员之一。
近年来研究发现，NGAL在有炎症反应的上皮细胞中也有表达[1]，而且在不同的组织和细胞的病理及生理条件下具有多种功能表现形式。
NGAL作为小分子铁结合蛋白能够捕获铁而起到抑菌剂的作用 [2]；NGAL参与细胞分化过程并在凋亡中扮演存活因子的角色[3]；在肿瘤细胞或组织中，如肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌和胰腺癌，能够检测到NGAL的上调表达[4]，这提示NGAL可能与肿瘤的发生发展密切相关。
有人研究发现NGAL能与MMP-9相互作用，使MMP-9免被降解，从而导致MMP-9的活性维持在一定水平，这可能是NGAL在肿瘤进程中体现其功能的重要表现之一[5,6]。
第５１卷 第１期２０１２年２月复旦学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．５１Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２０１２ 文章编号：０４２７－７１０４（２０１２）０１－００９１－０８收稿日期：２０１１－０６－１９基金项目：国家重点基础研究发展计划（“９７３”计划）（２００４ＣＢ５１８６０５），国家高技术研究发展计划（“８６３”计划）（２００６ＡＡ０２０５０１），国家重大科技专项基金（２００８ＺＸ１０００２－０２０），上海市科学技术委员会基金（０３ｄｚ１４０８６），国家自然科学基金项目（３００２４００１，３０７７１１８８）资助项目作者简介：李林国（１９８２—），女，硕士研究生；侯永敏，男，博士，通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｍｈ１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析李林国，周 同，侯永敏（复旦大学遗传工程国家重点实验室，上海２００４３３）摘 要：ＮＧＡＬ基因是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族成员，与ＭＭＰ９的功能密切相关，在乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤中异常表达，为了研究其在原发性肝癌中的表达及功能，通过荧光实时定量ＰＣＲ法检测了ＮＧＡＬ基因在２３对肝癌组织标本中的表达情况．结果显示：在１２例肝癌组织中ＮＧＡＬ显著上调表达，占总样本数的５２．１７％（Ｐ＜０．０５），提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有关．通过构建绿色荧光蛋白融合表达载体，用脂质体法转化肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１进行瞬时表达．细胞周期实验显示ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．关键词：原发性肝细胞癌；ＮＧＡＬ；荧光实时定量ＰＣＲ；细胞周期；细胞凋亡中图分类号：Ｑ ７５６ 文献标志码：Ａ中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ，ＮＧＡＬ），也称为Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２（脂质运载蛋白－２），是１９９３年在研究人中性粒细胞中的ＭＭＰ９（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ９，９２ｋｕ）时新发现的一种２５ｋｕ的新蛋白，同源分析发现，ＮＧＡＬ与小鼠癌基因产物２４ｐ３蛋白的同源性很高，是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族的新成员［１］．Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族由一系列的细胞外小分子组成，它们具有结合疏水性小分子的功能，并将小分子运输到特定的细胞膜受体上，发挥其作为运载体的功能，参与细胞生理稳态的调节［２］．ＮＧＡＬ与ＭＭＰ９的功能密切相关，它能抑制ＭＭＰ９在体内的降解，从而起到促进肿瘤的浸润与转移功能．近年来人们在ＮＧＡＬ基因与人类肿瘤之间的相互关系方面的研究取得了一定的进展．ＮＧＡＬ基因定位于染色体９ｑ３４上，是单拷贝基因，全长５ ８６９ｂｐ，其中包括１ ６９５ｂｐ的５′端非转录区，１７８ｂｐ的３′端非转录区及由７个外显子和６个内含子构成的３ ６９６ｂｐ的原初转录区（ｐｒｉｍａｒｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）［３］．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ等在１９９４年克隆了ＮＧＡＬ的ｃＤＮＡ全序列，它含有６３ｂｐ的５′端非翻译区和５９１ｂｐ的编码区，共编码１９７个氨基酸，其中包括１９个氨基酸的前导序列和１７８个氨基酸残基的成熟肽段［４］．ＮＧＡＬ基因与小鼠的２４ｐ３基因ｃＤＮＡ全序列具有７１．３％的一致性，且外显子以及内含子连接处的位点具有高度保守性．同源比对提示，ＮＧＡＬ和２４ｐ３可能具有相近的功能［５－６］．ＮＧＡＬ蛋白由一条肽链构成，具有典型的β２折叠桶状结构．肽链由Ｎ端的３１０螺旋，Ｃ端的α螺旋和中间的８段反平行式β折叠构成的β折叠桶组成．ＮＧＡＬ蛋白β折叠桶封闭端的有游离的巯基Ｃ８７，这使得ＮＧＡＬ可与一些蛋白质分子，如ＭＭＰ－９，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性．ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而保持其活性，促进血管新生及肿瘤生长作用［７］．研究也发现ＮＧＡＬ蛋白在食道上皮癌的恶性转化中起着重要作用，它可能是一个癌基因或者癌促基因［８］，Ｌｉ等研究发现ＮＧＡＬ可能通过调节ＭＭＰ－９和ＭＭＰ－２的活性在肿瘤细胞的浸润中发挥作用［９］．Ｋｕｂｂｅｎ等发现ＮＧＡＬ／ＭＭＰ－９复合物与胃癌的预后显著相关［１０］．研究同样发现ＮＧＡＬ在卵巢癌［１１］、食道鳞状细胞癌［１２］等癌组织中异常表达．大多数结肠腺癌ＮＧＡＬ强阳性，肿瘤周围的腺瘤样增生也呈阳性，与周围的正常黏膜明显不同，而用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检查发现结肠癌和肝癌组织中ＮＧＡＬｍＲＮＡ的水平升高［１３］．Ｐａｔｉｌ等通过ＤＮＡ芯片的方法发现了ＮＧＡＬ、ＧＰＣ３和ＤＫＫ１等在肝癌中高表达［１４］．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关，提示ＮＧＡＬ可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．原发性肝癌（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是最常见的恶性肿瘤之一，它发病隐匿，早诊困难，易转移，预后差，在我国其死亡率居第三位．因此，探索具有临床诊断应用价值的肝癌生物分子标记，研究肝癌的发生发展机制具有重要意义．然而人们对ＮＧＡＬ基因在肝癌中研究还很少，仅有Ｐａｔｉｌ等［１４］利用ＤＮＡ芯片技术检测肝癌中的基因表达情况时发现ＮＧＡＬ是其中一个高表达基因，且未对其进行深入研究．所以本论文欲采用荧光实时定量ＰＣＲ法检测ＮＧＡＬ基因在肝癌及癌旁组织中的表达情况，以探索其在肝癌的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．同时克隆ＮＧＡＬ基因的全长ｃＤＮＡ序列，构建一系列真核生物表达载体，通过体外细胞实验研究其对细胞周期、细胞凋亡等方面的影响，初步探索其在肝癌发生发展中的作用，为肝癌的早期诊断和早期治疗提供理论依据．１ 材料和方法１．１ 材料５３例原发性ＨＣＣ肝癌与癌旁肝脏组织样品来自复旦大学附属中山医院（所有诊断均经病理切片证实），每例样品由癌组织和癌旁组织配对组成．组织离体后３０ｍｉｎ内取材，在液氮中快速冷冻１ｍｉｎ，－７０℃保存备用．本研究采用人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１（由本实验室保存）．采用ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）培养基（含１０％ＦＢＳ），于３７℃，５％ＣＯ２细胞培养箱中培养．大肠杆菌ＤＨ５α由本实验室保存；实验中所用到的质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为本实验室保存．１．２ 方法１．２．１ 实时荧光定量ＰＣＲ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂（上海生工生物工程有限公司）提取肝癌及癌旁组织标本总ＲＮＡ，所提取的总ＲＮＡ取２μＬ进行电泳检测，同时用紫外分光光度计ＦＳ－３１２（上海复生公司）检测Ａ２６０／Ａ２８０比值和浓度．逆转录反应：在０．５ｍＬ离心管中加入总ＲＮＡ ２μｇ，随机引物（ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）０．０２μｇ，用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水补至反应总体积为１０μＬ；７０℃温浴５ｍｉｎ，冰浴２ｍｉｎ．随后加入１０μＬ反应缓冲液（５×ＲＴ缓冲液４μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混合物１μＬ，２００ｕｎｉｔｓ Ｍ－ＭｕＬＶ ＲＴａｓｅ １μＬ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水４μＬ），离心数秒混匀；４２℃温浴６０ｍｉｎ；７０℃处理１５ｍｉｎ终止反应，－２０℃储存备用．按照ＳＹＢＲ＠Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒（ＴｏＹｏＢｏ）的实验方法在Ｂｉｏ－Ｒａｄ荧光实时定量ＰＣＲ仪上进行反应．引物设计参照ＧｅｎＢａｎｋ中的基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表１．每个反应均设３个平行管，总反应体系为２０μＬ，包含２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，模板１μＬ．反应条件为：初始变性９４℃，２ｍｉｎ，然后９５℃，１５ｓ，５８℃，２０ｓ，７２℃，２０ｓ，循环４５次．表１ 实验中所用引物列表Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ基因引物类型引 物ＮＧＡＬ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ基因引物ＮＧＡＬｒｔＦ：５′－ＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡ－３′，ＮＧＡＬｒｔＲ：５′－ＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＣＣＧＴＡ－３′；２９复旦学报（自然科学版） 第５１卷（续表）基因引物类型引 物ＧＡＰＤＨ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ内参引物ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｆ：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ－３′，ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｒ：５′－ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ－３′；ＮＧＡＬ基因克隆引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ：５′－ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣ－３′，ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ：５′－ＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＧ－３′；ＮＧＡＬ载体构建引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１：５′－ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧ－３′，（下划线为ＥｃｏＲ Ｉ位点）ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２：５′－ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＣＧ－３′；（下划线为ＫｐｎＩ位点）１．２．２ 数据分析根据荧光实时定量ＰＣＲ中Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）和样本起始拷贝数的对应关系，利用Ｃｔ值就可以计算ＮＧＡＬ基因和和内参基因ＧＡＰＤＨ的表达量的比值，具体方法采用Ｌｉｖａｋ和Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ根据数学推导得出的比较阈值法，ＮＧＡＬ基因肝癌和癌旁肝组织表达水平的差异倍数被定义为２－ΔΔＣｔ，其中ΔΔＣｔ＝［ＣｔＮＧＡＬ（肝癌组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（肝癌组织）］－［ＣｔＮＧＡＬ（癌旁组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（癌旁组织）］．采用配对“ｔ”检验方法检验各组间ＮＧＡＬ表达差异，Ｐ值小于０．０５被认为两者之间的相关性有意义，小于０．０１被认为两者的相关性有显著意义．数据的统计分析采用ＳＰＳＳ １５．０ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ软件包进行．１．２．３ 转ＮＧＡＬ基因ＳＭＭＣ－７７２１细胞株的建立以人正常肝组织ｃＤＮＡ文库为模板，用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ通过ＬＡ Ｔａｑ酶，以６２℃的退火温度进行扩增，将得到的目标片段，连接入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，命名为ｐＭＤ１８Ｔ－ＮＧＡＬ．以该载体为模板，用引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１和ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２通过ＬＡ Ｔａｑ酶进行扩增以在基因两端添加酶切位点，回收大小为６１４ｂｐ的片段，用ＥｃｏＲⅠ和ＫｐｎⅠ进行双酶切，回收酶切后的片段，连接至用同样的酶酶切的ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体片段中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，用含卡那霉素的ＬＢ平板进行筛选，测序正确的阳性克隆命名为ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ．采用脂质介导法将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体转染肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１，通过ＲＴ－ＰＣＲ法验证ＮＧＡＬ基因在ＳＭＭＣ－７７２１细胞株内过量表达．１．２．４ 细胞周期分析构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体Ｌｉｐｔｏ ２０００将载体导入细胞株内，观察ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响．我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），进行细胞周期实验．制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育４ｄ．再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０μｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．１．２．５ 细胞凋亡检测制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育１ｄ后．换液后加入１％ＦＢＳ的低血清ＤＭＥＭ培养基，继续培养２４～７２ｈ，再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０ｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．２ 结果与分析２．１ ＮＧＡＬ在肝癌和癌旁肝组织中的表达情况我们通过荧光实时定量ＰＣＲ技术检测发现５３对肝癌样品中ＮＧＡＬ基因的表达情况，表２所列为ＮＧＡＬ基因在５３对肝癌样品中表达的ΔΔＣｔ值．根据上文中提到的数据分析方法，可知２－ΔΔＣｔ值就是各３９ 第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析个样本间基因表达量的倍数关系，以ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．因为整个样本的收集时间较长，考虑到某些样本可能已经发生降解，对实验结果可能造成一些影响．当使用发生降解的ＲＮＡ样本进行Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ实验时，内参基因ＧＡＰＤＨ达到同样的检测丰度需要的循环反应数更多，表现为Ｃｔ值增大，所以在本文中我们以癌旁组织中内参基因ＧＡＰＤＨ的Ｃｔ值小于２０作为合格ＲＮＡ样本的筛选标准．故我们选取其中２３对肝癌样本进行分析，发现ＮＧＡＬ上调表达的为１２例，无显著变化的为８例，下调表达的为３例，因此ＮＧＡＬ在５２．１７％的肝癌组织中上调表达，且差异具有统计学意义（Ｐ＝０．０３５＜０．０５）．结果表明在原发性肝癌中ＮＧＡＬ较高的表达水平具有普遍性，提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有密切的相关性．表２ ＮＧＡＬ基因Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ结果Ｔａｂ．２ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＮＧＡＬ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 注：ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．２．２ ＮＧＡＬ基因的亚细胞定位研究用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ克隆得到ＮＧＡＬ基因，并用ＮＧＡＬ基因构建载体ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ，并经测序验证其与预期序列完全一致．将构建好的重组子ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞．４８ｈ后Ｏｌｉｍｐｕｓ荧光显微镜下观察蛋白的亚细胞定位，分别使用４８８ｎｍ和４０５ｎｍ的激发光照射ＧＦＰ和ＤＡＰＩ染色的细胞核（图１）．显微镜下检测ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在胞内的各部分也均有表达，且分布均匀，验证了ＮＧＡＬ是一种分泌蛋白，可存在于细胞内的各部分中．４９复旦学报（自然科学版） 第５１卷图１ ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞荧光显微镜观察结果（标尺＝５μｍ）Ｆｉｇ．１ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＳＭＣＣ－７７２１ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ（ｗｉｔｈ ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ Ｂａｒ＝５μｍ）Ａ．白光下细胞的形态；Ｂ．ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在ＳＭＭＣ－７７２１细胞中的表达；Ｃ．细胞核ＤＡＰＩ染色；Ｄ．Ｂ、Ｃ的图像重叠２．３ ＮＧＡＬ基因过表达对肝癌细胞周期和细胞凋亡的影响以肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１为体外模型，研究过表达ＮＧＡＬ基因对ＳＭＭＣ－７７２１细胞周期和细胞凋亡的影响．按方法中所述，构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体ｌｉｐｔｏ ２０００将载体导入细胞株内，为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝２），进行细胞周期实验．结果表明：转入ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ的细胞相比转入空载体的细胞进入Ｇ１，Ｓ，Ｇ２／Ｍ期的数量各不相同，且进入Ｓ期的细胞显著性增多（Ｐ＜０．０５）（图２）．为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞凋亡的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），并用１％ＦＢＳ低血清诱导细胞凋亡，检测ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ对细胞凋亡的影响．结果表明：转染ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体能显著抑制低血清诱导的ＳＭＣＣ－７７２１肝癌细胞株的凋亡水平，Ｐ＝０．００３ ３（图３）．３ 讨 论ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤组织中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．研究表明ＮＧＡＬ蛋白分布于乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的胞浆内，呈颗粒状．肿瘤细胞周围的良性导管内也有弱阳性的分泌性ＮＧＡＬ蛋白存在．人乳腺癌组织中ＮＧＡＬ表达与乳腺癌的雌、孕激素受体水平和细胞增殖状态有关，ＮＧＡＬ蛋白阳性的肿瘤细胞其ｍＲＮＡ的表达水平是周围正常乳腺组织的２．８倍．在人的乳腺癌组织中用免疫组化法研究却未发现ＮＧＡＬ蛋白表达与ＨＥＲ－２／ｎｅｕ活化之间有关联，也未发现ＮＧＡＬ蛋白与乳腺癌的总体生存率相关［１５］．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而增强其活性，促进血管新生及肿瘤生长来起作用［７］．研究发现在ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７癌基因转化基础上由ＴＰＡ促成的食管癌细胞系中，ＮＧＡＬ ｍＲＮＡ的表达是明显升高的［１６］．同时ＮＧＡＬ蛋白在膀胱癌［１７］、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症中异常表达．目前对ＮＧＡＬ基因的功能研究还不充分，现在的研究显示ＮＧＡＬ蛋白与肿瘤的关系主要表现在以５９ 第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析下方面，ＮＧＡＬ蛋白可与ＭＭＰ９蛋白结合，形成ＭＭＰ９／ＮＧＡＬ复合物，并能保护ＭＭＰ９的不被降解，从而维持ＭＭＰ９的酶活性［１８］．ＮＧＡＬ蛋白能运载铁离子到细胞膜，从而激活或者抑制铁应答基因［１９］．体外实验证明ＮＧＡＬ蛋白通过增强细胞的铁吸收能力促进上皮细胞与间充质细胞之间的转化［２０］．ＮＧＡＬ蛋白可以通过自分泌的方式负调控红细胞的生成，过量的ＮＧＡＬ蛋白可以抑制红细胞前体细胞的分化及诱导其凋亡．ＮＧＡＬ蛋白通过二硫键与ＭＭＰ２９，即明胶酶Ｂ结合，调节ＭＭＰ２９的功能．ＭＭＰ２９一般以前酶的形式（Ｐｒｏ２ＭＭＰ２９）贮存于细胞内，当分泌到细胞外并切去Ｎ２端的一段序列后，才表现生物活性．ＮＧＡＬ蛋白可以结合ＭＭＰ的Ｎ２端胱氨酸开关，促进Ｐｒｏ２ＭＭＰ的活化．ＮＧＡＬ蛋白具有抵消金属基质蛋白酶２１的组织抑制剂（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２１，ＴＩＭＰ２１）对ＭＭＰ２９活性抑制的作用．因为ＭＭＰ２９在降解基底膜的Ⅳ型胶原和基质成分中起重要作用，因此推测ＮＧＡＬ可能在肿瘤的浸润和转移中发挥作用［１０］．ＮＧＡＬ蛋白能抑制Ｈ２Ｏ２导致的细胞凋亡，提示它可能具有缓解细胞在氧化应激条件下所受的损伤［２１］．ＮＧＡＬ在甲状腺癌细胞ＦＲＯ中高表达，消减表达ＮＧＡＬ的ＦＲＯ细胞在软琼脂上的生长能力及克隆形成率能力显著减弱，由此认为ＮＧＡＬ蛋白有助于甲状腺癌细胞的生存［２２］．对ＮＧＡＬ蛋白的功能研究提示其可能是一个癌基因或者促癌基因，在肿瘤的发生发展过程中发挥作用．本论文探索了ＮＧＡＬ在肝癌及其癌旁组织中的表达情况，发现ＮＧＡＬ基因在肝癌组织中高表达，由于样本量较少，未能统计分析其与肝癌的临床分期及预后等相关性．然而Ｓｕｎ等研究发现ＮＧＡＬ的在结直癌中的高表达并与肿瘤的分期及复发具有相关性，ＮＧＡＬ的表达水平可作为独立的预后因子判断结直肠癌的生存率［２３］．Ｋｉｍ等研究发现ＮＧＡＬ在肝癌组织中显著高表达，相对于癌旁组织，并且发现其通过阻隔ＪＮＫ和ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号传导通路抑制肝癌细胞的增殖和侵润，关于其机制的研究尚未完全清楚［２４］．Ｍａｒｔí等发现结肠癌肝转移术后患者中血清ＮＧＡＬ水平与临床预后及评分具有相关性，提示其可能作为结肠癌肝转移患者预后的潜在生物标记［２５］．Ｐａｔｉｌ等利用基因芯片的办法检测了７０３个基因，发现ＮＧＡＬ，ＧＰＣ３等分泌性蛋白的基因显著高表达，预示他们可能是具有前景的肝癌诊断标记［１４］．我们下一步实验将收集更多的临床肝癌样本及更详细的临床资料，进一步研究ＮＧＡＬ基因表达与肝癌临床分型分期及预后的相关性，探索其作为肝癌临床检测生物标记的可能性．本论文探索了ＮＧＡＬ基因转染肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１对其细胞周期及凋亡的影响，发现ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ等研究发现ＮＧＡＬ的表达与肝脏的损伤具有相关性，并且导致炎症相关反应，白介素１β通过ＮＦ－κＢ活化可诱导ＮＧＡＬ在肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中高表达［２６］．Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ等发现当用Ｘ射线或者过氧化氢处理肝癌细胞株ＨｅｐＧ２时，ＮＧＡＬ可以被氧化应激诱导高显著高表达，当加入二甲亚砜或者半胱胺等抗氧化剂时，高表达的ＮＧＡＬ可以被抵消［２７］．研究表明ＮＧＡＬ基因的表达与肝脏的损伤及炎症反应相关，但是ＮＧＡＬ基因在肝癌中的作用机制还不明确．本论文探索了其对肝癌细胞株的细胞周期、细胞凋亡的影响，为进一步研究其机制打下了基础．本论文中细胞周期及凋亡试验中所使用的肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１，需研究细胞株本身ＮＧＡＬ的表达情况，对该细胞株的背景进行深入的了解．可对该细胞株进行ＮＧＡＬ基因的敲减实验，通过ＲＮＡｉ等方法抑制ＮＧＡＬ基因的表达，观察其对肝癌细胞株的细胞周期及细胞凋亡的影响．另外，还可以进一步研究ＮＧＡＬ基因起作用的细胞信号传导通路，进一步探索其在肝癌发生发展中的作用机制．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关．作为一种分泌蛋白，可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值，其在恶性肿瘤演进中的机制和意义还有待进一步深入研究．参考文献：［１］ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｌ，Ｊｏｈｎｓｅｎ Ａ Ｈ，Ｓｅｎｇｅｌ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＮＧＡＬ，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２６８（１４）：１０４２５．［２］ Ｆｌｏｗｅｒ Ｄ Ｒ．Ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３５４（１）：６９复旦学报（自然科学版） 第５１卷７－１１．［３］ Ｃｏｗｌａｎｄ Ｊ Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７，４５（１）：１７－２３．［４］ Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｊ Ｒ，Ｓｅｎｇｅｌｏｖ Ｈ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇＮＧＡＬ：ａ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９４，２０２（３）：１４６８－１４７５．［５］ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｌ，Ｃｏｗｌａｎｄ Ｊ Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ．Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，１４８２（１－２）：２７２－２８３．［６］ 熊华淇，许丽艳．ＮＧＡＬ基因的功能及其在人正常和肿瘤组织中的表达［Ｊ］．国外医学：生理病理科学与临床分册，２００２，２２（００１）：１２－１４．［７］ Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ Ｃ Ａ，Ｙａｎ Ｌ，Ｌｏｕｉｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９／ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５，１１（１５）：５３９０．［８］ 许丽艳，李恩民．ＮＧＡＬ基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００１，２８（００６）：８３９－８４３．［９］ Ｌｉ Ｅ Ｍ，Ｘｕ Ｌ Ｙ，Ｃａｉ Ｗ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＨＥＥＣ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００３，３５（３）：２４７．［１０］ Ｋｕｂｂｅｎ Ｆ Ｊ Ｇ Ｍ，Ｓｉｅｒ Ｃ Ｆ Ｍ，Ｈａｗｉｎｋｅｌｓ Ｌ Ｊ Ａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ａｇａｉｎｓｔ ＭＭＰ－９ａｕｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，４３（１２）：１８６９－１８７６．［１１］ Ｌｉｍ Ｒ，Ａｈｍｅｄ Ｎ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ａｎ ｅａｒｌｙ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ＮＧＡＬ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１２０（１１）：２４２６－２４３４．［１２］ Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｘｕ Ｌ，Ｘｉａｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｉｎ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，６０（５）：５５５．［１３］ Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｓ．Ｎｇａｌ／Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ａｎｄ／ｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，２００８，４（３）：１３２－１３２．［１４］ Ｐａｔｉｌ Ｍ Ａ，Ｃｈｕａ Ｍ Ｓ，Ｐａｎ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４（２３）：３７３７－３７４７．［１５］ Ｓｔｏｅｓｚ Ｓ Ｐ，Ｆｒｉｅｄｌ Ａ，Ｈａａｇ Ｊ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ＮＧＡＬ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９８，７９（６）：５６５－５７２．［１６］ Ｍａｒｕ Ｄ Ｍ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＡＣ）ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｐｏｏｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｃ］∥９８ｔｈ ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ－Ｓｔａｔｅｓ－ａｎｄ－Ｃａｎａｄｉａｎ－Ａｃａｄｅｍｙ－ｏｆ－Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ：２００９．［１７］ Ｄｏｋｕｎ Ｏ Ｙ，Ｆｌｏｒｌ Ａ Ｒ，Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｈ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＳＮＣＧ，Ｓ１００Ａ４，Ｓ１００Ａ９ａｎｄ ＬＣＮ２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００８，１２３（１２）：２７９８－２８０７．［１８］ Ｙａｎ Ｌ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ｂ／ＭＭＰ－９ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＭＰ－９ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＮＧＡＬ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（４０）：３７２５８－３７２６５．［１９］ Ｙａｎｇ Ｊ，Ｇｏｅｔｚ Ｄ，Ｌｉ ＪＹ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｒｏｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ，２００２，１０（５）：１０４５－１０５６．［２０］ Ｇｗｉｒａ Ｊ Ａ，Ｗｅｉ Ｆ，Ｉｓｈｉｂｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，２８０（９）：７８７５．［２１］ Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ Ｍ Ｈ，Ｈａｌａｂｉａｎ Ｒ，Ｇｈａｓｅｍｉｐｏｕｒ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ａｃｔｓ ａｓ ａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ２Ｏ２ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，３９（６）：５６０－５６６．７９ 第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析［２２］ Ｉａｎｎｅｔｔｉ Ａ，Ｐａｃｉｆｉｃｏ Ｆ，Ａｃｑｕａｖｉｖａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ），ａ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ，ｉｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｙｒｏｉｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５（３７）：１４０５８－１４０６３．［２３］ Ｓｕｎ Ｙ，Ｙｏｋｏｉ Ｋ，Ｌｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＮＧＡＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｍａ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，１７（１３）：４３３１－４３４０．［２４］ Ｌｅｅ ＥＫ，Ｋｉｍ Ｈ Ｊ，Ｌｅｅ Ｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＪＮＫ ａｎｄ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０１１，３８（２）：３２５－３３０．［２５］ ＭａｒｔíＪ，Ｆｕｓｔｅｒ Ｊ，Ｈｏｔｔｅｒ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ ＢｉｏｌＭａｒｋｅｒｓ，２０１０，２５（１）：２１－２６．［２６］ Ｂｏｒｋｈａｍ－Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ Ｅ，Ｄｒｅｗｓ Ｆ，Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄｃｈｒｏｎｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１βｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－κＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ，２０１１，３１（５）：６５６－６６５．［２７］ Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ Ｍ Ｈ，Ｋｕｗａｈａｒａ Ｙ，Ｂａｂａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｈａｒｍｆｕｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ（Ｔｏｋｙｏ），２００７，４８（１）：３９－４４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＧＡＬ Ｇｅｎｅ ｉｎＨｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ＣａｒｃｉｎｏｍａＬＩ Ｌｉｎ－ｇｕｏ，ＺＨＯＵ Ｔｏｎｇ，ＨＯＵ Ｙｏｎｇ－ｍｉｎ（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＧＡＬ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）ｇｅｎｅ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄ ｉｓｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＭＰ－９．ＮＧＡＬ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｒｉｎｏｍａｓ．Ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＧＡＬ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（ＨＣＣ），ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＮＧＡＬ ｉｎ ２３ｐａｉｒｓ ｏｆ ＨＣＣ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖｉａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＮＧＡＬ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ １２ＨＣＣ ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ５２．１７％ｏｆ ｔｈｅｔｏｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＧＡＬ ｉｎ ＳＭＣＣ－７７２１ｉｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅｃｅｌｌ ｆｒｏｍ Ｇ１ｔｏ Ｓ ｐｈａｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＮＧＡＬ ｍａｙ ｐｌａｙａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ａｌｓｏ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＧＡＬ ｈａｄｔｈｅ ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ＳＭＣＣ－７７２１ｕｎｄｅｒ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＣＣ；ＮＧＡＬ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ；ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ８９复旦学报（自然科学版） 第５１卷。
