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第八章 高效液相色谱法

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第8章液固-液液色谱法

第8章液固-液液色谱法


宋敏
中国药科大学药分教研室
（4）常用于HPLC-GC联用技术
❖由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目 前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用液－ 固吸附色谱，进行正相HPLC。
宋敏
中国药科大学药分教研室
二、液－液分配色谱法
宋敏
中国药科大学药分教研室
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1、液-液分配色谱法的定义
液－液分 配色谱
基于样品组分在固定液和流动相之 间分配系数不同而分离的色谱法称 为液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Chromatography，LLC）。
宋敏
中国药科大学药分教研室
❖ 流动相极性小于固定相极性的液－液色谱法称为正 相液－液色谱法，如以烷烃作为流动相，以含水硅 胶作为固定相的色谱系统。正相液－液色谱法适合 于分离极性化合物。
宋敏
中国药科大学药分教研室
氧化铝
❖ 氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶 液更加不稳定，所以，极少用作键合固定相的基质。
❖ 氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非 强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物。
❖ 当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸 附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性易离解的 化合物容易在氧化铝上形成死吸附。
宋敏
中国药科大学药分教研室
竞争模式
❖ 竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或 中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附 剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后， 便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附。
X. 溶质分子 Y. 溶剂分子 s. 吸附剂 m. 流动相
宋敏
中国药科大学药分教研室
双层吸附模型
❖ 双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较 强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层 的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓 度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代 或缔合而使溶质保留。
第八章液相色谱法概论例题例一柱长25cm，固定相为10μm的全

第八章液相色谱法概论例题例一柱长25cm，固定相为10μm的全

第八章 液相色谱法概论例题例一：柱长25cm ，固定相为10μm 的全多孔型颗粒。

流动相线速为0.1cm/s,组分的扩散系数为10-5cm 2/s 。

求理论塔板数。

解：1010001.01.05=⨯==-m pD ud ν 34.3101.0102101.0233.033.0=⨯++=⨯++=νννh cm hd H p 00334.0001.034.3=⨯==748500334.025===H L n 例2 在反相色谱中，流动相从30％(V ／V)甲醇—术改变为40%(V ／V)甲醇—水。

问组分的调整保留时间将改变多少？解 在30％配比时，混合溶剂的极性为：67.82.107.01.53.0,1=⨯+⨯=p40％配比时，混台溶剂的极性为：16.82.106.01.54.0,2=⨯+⨯=p 51.067.816.8,-=-=∆p8.11,1,2,1,2==R R t t K K 即组分的调整保留时间减少到原来的1／1．8。

思考题与习题1．试比较HPIC 与GC 分离原理．仪器构造及应用方法的异同点。

2． 高放液相色谱法是如何实现高效和高速分离的(与经典的柱色谱比较)?3． 在高效液相色谱中，为什么一般采用短而粗的色谱注？4． 在正确答案的字母上画圈。

、(1) 要使峰宽减小，可以：1）降低柱温；2)采用高选择性固定相；3)采用细颗粒载体；4)采用最佳线速；5)减小相比；6)增大流动相对组分的亲和力；7）减小柱外效应。

(2) 要使相对保留值增加，可以：1)采用最佳线速2）减小流动相对组分的亲和力；3）增加柱长；4)增大相比；5)采用高选择性固定相；6）增加理论塔板数；7)采用细颗粒载体；8)减小柱外效应。

5． 简述HPLC 的色谱峰展宽的主要影响因素及改善方法。

6． 高效液相色谱方法分为哪几类？其本质是什么?7． HPLC 的常用检测器有哪几种?试述其测量原理及应用。

8．说明下面几种情况对组分的分离和检测有何影响？(1)使用紫外吸收检测器时，流动相为含有杂质(芳烃)的己烷；(2)在液固色谱中，用含有少量极性杂质(例如水)的己烷作流动相；(3)在梯度洗脱中，使用含有微量极性杂质的非极性流动相后，更换极性较大的流动相。

说课稿-高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸钠的含量

说课稿-高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸钠的含量

说课稿尊敬的各位评委老师，你们好！今天我要进行说课的内容是：高效液相色谱法的应用——饮料中苯甲酸钠含量的测定一、教材分析高效液相色谱法的应用是选自高等教育出版社《仪器分析》教材第八章第一节。

在此之前，学生们已经学习了色谱法及其基本概念，这为过渡到本节内容的学习起到了铺垫的作用。

由于高效液相色谱法的分析速度快、效率高、灵敏度高以及操作自动化等特点，此方法已经广泛用于化工、农药、医药、环境监测、动植物检验检疫等行业和领域。

因此学好本节内容对于以后的工作有着至关重要的作用。

二、教学目标根据本教材的结构和内容分析，结合着高职学生的认知结构及其心理特征，我制定了以下的教学目标：1、激发学生对学习过程的兴趣及未来工作的期待；2、熟悉高效液相色谱仪的基本构造及工作过程；3、学会使用高效液相色谱仪测量简单有机物的含量；三、教学重点教学重点：高效液相色谱仪的基本构造重点的依据：只有掌握了高效液相色谱仪的基本构造，才能理解其工作原理、学会使用高效液相色谱法测量简单的化合物。

四、教学难点教学难点：1、对高效液相色谱仪工作过程的理解2、应用高效液相色谱法测定有机化合物的含量难点的依据：高效液相色谱仪工作过程较抽象，内部结构复杂、仪器昂贵，不能随意拆卸，很难想象其工作过程；另外实际的样品测量过程中影响因素较多，容易出错，很难独立完成。

为了讲清教材的重、难点，使学生能够达到本节内容设定的教学目标，我再从教法和学法上谈谈：五、教学方法1、直观演示法：利用图片、动画等手段进行直观演示，激发学生的学习兴趣，活跃课堂气氛，促进学生对知识的掌握。

2、观察法让学生独立观察实验仪器设备，将教材中的知识形象化、具体化，让学生切实的感受到高效液相色谱仪的每一个零部件。

3、集体讨论法针对课程的重点难点，组织学生进行集体和分组讨论，培养学生在学习中分析问题解决问题的能力。

使学生始终处于主动的学习状态中，充分体现了“教为主导，学为主体”的原则。

六、学法指导高职学生年龄段分布在18-21岁之间，此阶段学生自我意识逐步增强，抽象思维迅速发展，意志水平明显提高。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。

HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。

具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。

目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。

将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。

C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。

经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。

它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。

HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。

高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和检测化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药学等领域。

它的高效性和精密度使其成为许多实验室中不可或缺的工具。

下面将介绍高效液相色谱的使用方法，希望能为您的实验工作提供帮助。

首先，准备好实验所需的仪器和试剂。

检查色谱柱、流动相、样品溶液等是否符合要求，确保实验的顺利进行。

接下来，进行仪器的预处理和平衡。

打开色谱仪，设置好检测波长和流速等参数，进行系统的平衡和稳定。

然后，进行样品的处理和制备。

将待测样品溶解于适当的溶剂中，过滤去除杂质，使其达到适合进样的状态。

注意样品处理的过程中要保持样品的纯度和稳定性，避免对实验结果产生影响。

接着，进行进样和分离。

将处理好的样品通过自动进样器引入色谱柱中，流动相将样品分离并通过检测器进行检测。

在此过程中，需要注意流速、温度、压力等参数的控制，以保证色谱分离的准确性和重复性。

最后，进行数据的处理和分析。

根据检测器输出的信号，得到样品的色谱图谱，通过峰面积、保留时间等参数进行定量和定性分析。

同时，对实验结果进行统计学处理，评估实验的准确性和可靠性。

在实验操作的过程中，需要注意以下几点，一是要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性；二是要及时记录实验过程中的关键步骤和参数，以备后续分析和总结；三是要及时清洗和维护色谱仪器，延长仪器的使用寿命和保证实验结果的准确性。

总之，高效液相色谱是一种重要的分析技术，掌握其使用方法对于化学、生物、药学等领域的科研工作者来说至关重要。

希望以上介绍的使用方法能够为您的实验工作提供一些帮助，祝您实验顺利取得理想的结果！。

中国药典版高效液相色谱法课件

中国药典版高效液相色谱法课件


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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
中国药典版高效液相色谱法
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
中国药典版高效液相色谱法
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三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
中国药典版高效液相色谱法
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现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
《仪器分析》第八章 液相色谱分析

《仪器分析》第八章 液相色谱分析

Si O + SO l2 H C Si Cl
Si Cl
+ R H N 2
Si N R H
热和化学稳定性比酯型好。 热和化学稳定性比酯型好。
Si C l
+ R M X g
Si R
从理论上讲，这种结构具有更好的稳定性， 从理论上讲 ， 这种结构具有更好的稳定性 ， 特别是对于微碱性流动相， 而且R基可以多 特别是对于微碱性流动相 ， 而且 基可以多 次氯化，形成聚烷基键合相， 但是制备困难。 次氯化 ， 形成聚烷基键合相 ， 但是制备困难 。
柱体为直型不锈钢管，内径1～ 柱体为直型不锈钢管，内径 ～6 mm， ， 柱长5～ 柱长 ～40 cm。发展趋势是减小填料 。发展趋势是减小填料 粒度和柱径以提高柱效。 粒度和柱径以提高柱效。 以提高柱效
(7)检测器 检测器
♥ 紫外检测器
70％应用，氘灯，适用于梯度淋洗 对流动相速度变化不敏感 溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波 长；
(5)进样器 进样器
♥ 高压进样阀－用微量注射器将样品注入样品环管（10µL到 2mL）
(6)色谱柱 色谱柱
♥ 色谱系统的心脏 ♥ 优质不锈钢管，内壁光洁平滑 ♥ 接头死体积尽可能小 ♥ 为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根 短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在 卫柱中使用的颗粒大小约10－30 µm。
3. Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）
R Si O + R SiX H 3 Si O Si R R
目前用得最多的类型。 目前用得最多的类型 。 具有良好的热合 化学稳定性， 能够在pH2~8.5的介质中 化学稳定性 ， 能够在 的介质中 使用。 使用。
高效液相色谱法 定义

高效液相色谱法 定义

高效液相色谱法定义
高效液相色谱法是一种分离和分析混合物的方法。

它基于混合物在流动相和固定相之间的分配差异来实现分离。

高效液相色谱法使用高压输液系统将流动相泵入色谱柱中，待分析的混合物通过进样器注入流动相中，然后在色谱柱中进行分离。

色谱柱通常填充有特殊的固体吸附剂或化学键合相，混合物中的成分在流动相和固定相之间分配，根据其分配系数的差异而分离。

分离后的成分依次通过检测器进行检测，常见的检测器包括紫外-可见检测器、荧光检测器、电化学检测器等。

检测到的信号被记录下来，通过对信号的分析和比较，可以确定混合物中各成分的含量和性质。

高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、适用范围广等优点，广泛应用于药物分析、环境监测、食品分析、生物化学等领域。

第八节高效液相色谱

第八节高效液相色谱

由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。 一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点 较低时，可用GC进行分析；当沸点较高(＞450 ℃)、不能气化或 热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵 的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。
高效液相色谱系统
色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中 所构成的。
柱体为直型不锈钢管，内径1-6 mm，柱长5-40 cm。发 展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
4.检测器：
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化 的装置。
检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的 原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化， 从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。
值。差值与浓度呈正比；
通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）；
灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱；
偏转式、反射式 和干涉型三种；
示差折光检测器
荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光 的特性来检测的，具有很高的灵敏度，适用于检测有ππ共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨 基酸、维生素、稠环芳烃等。有些无π-π共轭体系的分 子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测。
(1) 正相液液色谱法
流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。 洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相 中溶解度大，后流出色谱柱 。
原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相， 由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代。化学键合相 是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱 常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小。氨 基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类 的分析。
高效液相色谱方法及应用课件

高效液相色谱方法及应用课件


七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中，可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用 C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标，用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装 填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成 糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂，如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是 近来日益受到重视的结果。
高效液相色谱法

高效液相色谱法

对多环芳烃，维生素B、黄 曲霉素、卟啉类化合物、农 药、药物、氨基酸、甾类化 合物等有响应；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30～
40μm的玻璃微球，表面附着一层 厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
液相色谱仪器（1）
high performance liquid chromatograph
液相色谱仪（2）
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
三、流程及主要部 件
1.流程
2(1.)主高要压输部液泵件
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
五、离子色谱（ion chromatography）
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
六、离子对色谱（ion pair chromatography）
八、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接上配 基(酶、抗原等)，这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。

2021执业药师《药物分析》章节复习-第八章

2021执业药师《药物分析》章节复习:第八章自己整理的2021执业药师《药物分析》章节复习:第八章相关文档，希望能对大家有所帮助，谢谢阅读！第八章芳香酸及其酯的分析第一节阿司匹林及其制剂的分析一、阿司匹林的分析(1)识别1.氯化铁反应这些药物水解后能产生酚羟基，在中性或弱酸性条件下能与氯化铁试液反应生成紫铁配位化合物。

适宜的pH值应为4 ~ 6，配位化合物应在强酸性溶液中分解。

这种反应极其敏感，只需稀释溶液即可检测。

如果取样量大，颜色太暗，可以用水稀释观察。

2.水解反应将阿司匹林和碳酸钠测试溶液加热并水解，得到水杨酸钠和乙酸钠。

用过量稀硫酸酸化后，白色水杨酸沉淀，出现乙酸气味。

3.红外吸收光谱法用波数(cm-1)对振动类型进行分类3300~2300 OH羟基1760，1695 C=O羰基1610，1580 C=C苯环1310，1190碳氧酯基(2)特殊杂质的检查1.溶液的澄清度：利用溶出行为的差异来检查碳酸钠试液在原料药中的不溶物。

阿司匹林溶于碳酸钠试液，杂质不溶。

不溶杂质：未完全反应的苯酚，或水杨酸在过高温度下精制时产生脱羧副反应的苯酚，以及合成过程中副反应产生的乙酸苯酯、水杨酸苯酯、乙酰水杨酸苯酯。

2.水杨酸：由生产过程中的不完全乙酰化或储存过程中的水解产生。

水杨酸对人体有毒性，分子中的酚羟基在空气中逐渐氧化成一系列醌类有色物质，如淡黄色、红棕色甚至深棕色，使阿司匹林产品变色。

检验原理：阿司匹林结构中没有酚羟基，所以不能与高铁酸盐反应，而水杨酸可以与高铁酸盐反应产生紫色，不能比一定量的水杨酸对照溶液产生的颜色更深。

限值为0.1%。

3.易碳化：检查被硫酸碳化着色的微量有机杂质。

(3)含量测定：酸碱滴定阿司匹林结构中游离羧基的直接滴定可用碱滴定溶液进行。

用于阿司匹林的测定。

方法：取本品约0.4g，准确称量，加入20毫升中性乙醇(中性至酚酞指示剂)，溶解，加入3滴酚酞指示剂，用氢氧化钠滴定溶液(0.1毫升/升)滴定。

第八章 高效液相色谱法及临界流体色谱法

第八章高效液相色谱法及临界流体色谱法基本要求：1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围2. 理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围3. 理解各种分离方式的原理及适用的分析对象及选择原则4. 理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。

它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的，因此气相色谱的许多理论与技术同样适用于高效液相色谱。

高效液相色谱法与气相色谱法的主要差别在于流动相和操作条件。

在气相色谱中，流动相是惰性的气体，分离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力，而在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。

高效液相色谱一般可在室温下进行。

由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。

高效液相色谱法与经典液相色谱法的主要差别在于固定相的性质和粒度等。

高效液相色谱所用固定相颗粒细而规则，孔浅，能承受高压，加上使用高压输液设备和高灵敏度的检测器，其分离效率、分析速度和灵敏度都远远高于经典液相色谱法。

原则上，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱分析，尤其适合那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等。

在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析。

由于此法不破坏样品，因此可方便地制备纯样。

8．1 固定相和流动相8.1.1 固定相高效液相色谱固定相按承受的高压能力可分为刚性固体和硬胶两大类。

刚性固体以二氧化硅为基质，它可以承受较高的压力，若在它的表面键合各种功能团，其应用更广泛。

硬胶由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承受压力较低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。

固定相按孔隙深度可分为表面多孔型和全多孔微粒型两大类，如图8—1所示。

第八章 高效液相色谱各种方法(离子色谱等)

传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： 1.需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； 2.洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
离子色谱是20世纪70年代发展起来的一项 新的液相色谱技术，是离子交换色谱的一种特 殊形式。 以无机、特别是无机阴离子混合物为 主要分析对象, 固定相：离子交换树脂 流动相：电解质溶液 检测器：一般为电导检测器
（1） 双柱离子色谱 淋洗液→泵→进样器→分离柱→抑制柱→电 导检测器→记录仪 通过抑制柱除去流动相的电解质背景，只有被检 离子在检测器上产生讯号。
例：以阴离子交换树脂为分离柱，阳离子交换 树 脂 为 抑 制 柱 ， NaHCO3 为 流 动 相 ， 分 离 F- 、Cl-混合液。
NaF 2R-HCO3 + 交换： NaCl R-F +2NaHCO3 R-Cl
凝胶过滤
{
固定相：亲水性凝胶 （如葡聚糖、凝胶）
流动相：水系溶剂
（如缓冲溶液，水等）
应用：分离聚合电解质，多肽等。
凝胶渗透
{
固定相：疏水性凝胶 （聚苯乙烯等） 流动相：非水系有机溶剂 （如四氢呋喃）
应用：测定聚合物的分子量分布。
讨论： ① B以下分子随溶剂流出，其他均在此 之前，不会残留 ② 不能进行梯度洗脱 ③ 严格按分子大小顺序流出，易定性 ④ 柱容量有限，大小过于接近者 （<10%)不能分离 ⑤ 谱带宽度大致相等
原理: 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂 为固定相， 在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋 洗液的高本底电导; 采用电导检测器检测流出组分。快速分离 分析微量无机离子混合物; 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展 迅速.
离子色谱具有以下优点：
分析速度快：
可在数分钟内完成一个试样的分析；

教案-高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸钠的含量

教案-⾼效液相⾊谱法测定饮料中苯甲酸钠的含量课题：⾼效液相⾊谱仪的应⽤——饮料中苯甲酸钠含量的测定教学时间：第8周星期四下午教材分析：⾼效液相⾊谱法的应⽤是选⾃⾼等教育出版社《仪器分析》教材第⼋章第⼀节。

教学⽬的：1、激发学⽣对学习过程的兴趣及未来⼯作的期待2、熟悉⾼效液相⾊谱仪的基本构造及⼯作过程3、学会使⽤⾼效液相⾊谱仪测量简单有机物的含量教学重点：⾼效液相⾊谱仪的基本构造教学难点：1、对⾼效液相⾊谱仪⼯作过程的理解2、应⽤⾼效液相⾊谱法测定有机化合物的含量教学⽅法： 1、直观演⽰法2、观察法3、集体讨论法学法指导：1、明确⽬标，实现做中学2、运⽤多媒体激发学习兴趣3、在讨论中提⾼分析问题和解决问题的能⼒，实现学⽣在教学过程中的主体性。

教学过程：Ⅰ、组织教学、引⼊新课1、组织教学、检查学⽣出勤情况。

2、导⼊新课教师提问：炎炎夏⽇刚刚过去，同学们最喜欢喝的东西是什么？学⽣回答：啤酒、雪碧、可乐、绿茶、果汁……教师提问：那么同学们在喝这些饮料的时候有没有注意过它们的保质期是多长时间呢？为什么加⼯好的饮料能够放置这么久？学⽣回答：保质期⼀般为8-12个⽉，之所以保质时间这么长是因为添加了防腐剂、进⾏⾼温灭菌处理等。

教师提问：有哪位同学知道饮料中⼀般都会添加哪些防腐剂呢？这些防腐剂对⼈体有没有害处？学⽣回答：肯定是有坏处的，但是到底是什么物质呢？为了延长饮料的保质期，增加⼝感，饮料中通常含有苯甲酸钠、柠檬酸钠、糖精钠等⾷品添加剂，这些⼤多是对⼈体有害的有机化合物，那么我们应该如何控制添加剂的含量呢？由于其快速、灵敏、⾼⾃动化，⾼效液相⾊谱法在⾷品检验中得到了⼴泛的应⽤。

今天我们就来应⽤⾼效液相⾊谱法检测饮料中苯甲酸钠的含量。

Ⅱ、新课讲授⼀、实验准备1、苯甲酸钠的性质：⽩⾊颗粒，⽆臭或微带安息⾹⽓味，味微甜，有收敛性；常温下易溶于⽔，化学式如下：2、苯甲酸钠的⽤途：常⽤的⾷品防腐剂，使⽤时转化为有效形式苯甲酸，酸性条件下对多种微⽣物（酵母、霉菌、细菌）有明显抑菌作⽤，对产酸菌作⽤较弱。

(医学课件)高效液相色谱法(HPLC)

阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢 ；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；可对相对分 子质量在103-105范围内的化合物按质量分离
30
7、亲和色谱(AC)
原理：利用生物大分子和固定相表面 存在的某种特异性亲和力，进行选择性分 离先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连 接上配基(酶、抗原等) 。
随着色谱理论的发展、高效细微固定相的 开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用， 高效液相色谱法得到了突破性的发展。
4
类比 液柱色谱法和跑道赛跑
5
二、液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。
兼具分离和分析功能，可以在线检测。
6
• 高效液相色谱法的突出特点： 1）高压（150－350*105Pa） 2）高速 3）高效 4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外 10-9g，荧光 10-11g ）
7
三、液相色谱仪（1）
8
三、液相色谱仪（2）
9
四、液相色谱分析法的原理
• （一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后

HPLC

往复式柱塞泵102. 附属系统
它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏 分收集以及数据处理等装置。 分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高 效液相色谱仪中尤为重要 重要的附属装置 效液相色谱仪中尤为重要的附属装置 . 梯度淋洗装置 将两种或以上不同极性的溶剂按一定的比 例混合，改变色谱柱中流动相的极性， 例混合，改变色谱柱中流动相的极性，离子强 度等，从而改变被测组分的相对保留值， 度等，从而改变被测组分的相对保留值，提高 分离效率。 分离效率。
18
紫外检测器特点
1. 灵敏度高，最小检测浓度可达10-9g/ml, 也适用于对紫 灵敏度高，最小检测浓度可达 外光吸收很弱的物质的检测； 外光吸收很弱的物质的检测； 2. 对流动相的流速和温度变化不敏感； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 3. 线形范围宽； 线形范围宽； 4. 结构简单，流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容 结构简单，流通池可做的很小（ 积 8µL）； ）； 5. 可用于梯度淋洗。 可用于梯度淋洗。 不能检测无紫外吸收的试样；流动相的选择受限, 缺点 不能检测无紫外吸收的试样；流动相的选择受限 流动相无紫外吸收或在被测组分的波长处无吸收。 即流动相无紫外吸收或在被测组分的波长处无吸收。
HPLC缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格 缺点：仪器设备费用昂贵， 缺点
6
第二节 高效液相色谱仪
7
高效液相色谱仪构造
主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。 主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。 辅助装置：梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 辅助装置：梯度淋洗，自动进样及数据处理等。
8
1.高压输液系统 1.高压输液系统
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8— 4


各类高效液相色谱法及其固定相、流动相
按固定相的聚集状态： LSC、 LLC
按分离原理： 吸附色谱法、分配色谱法 离子交换色谱法、空间排阻色谱法 其他色谱类型：亲和色谱法、手性色谱法 胶束色谱法、电色谱法


常见色谱类型： 一、化学键合相色谱 二、液固吸附色谱法 三、液液分配色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC）
1）储液瓶 惰性材料制成，坚固，易清洗，有足够的容积，滤棒/膜过滤器， 可滤去颗粒状物质 2）脱气装置： 氦气脱气，超声脱气， 真空脱气，在线脱气（膜过滤器）。 3）高压输液泵 • 主要部件之一，压力：150~350MPa • 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10um)，液体的流动相高 速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。 • 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调，耐腐蚀等特点
n理 (

) 2 5.54(
neff
' ' t t ( ) 2 16( R ) 2 5.54( R ) 2 W W1 2
tR '
H eff L / neff
neff/n理 = (tR’/tR)2 = {tR’/[tM(1+k)]}2 = [k/(1+k)]2
neff k 2 n理 ( ) 1 k
经典LC 用途 柱内径 固定相粒径 柱效 流动相的输送 分离混合物 1~15 cm 不均匀，>100μm 低（H↑，n↓） 1~6 mm 球形，均匀，<10μm 高（H↓，n↑） HPLC 分离、分析混合物
常压（重力或毛细作用） 高压（高压泵）分Leabharlann 周期能否在线检测长
否
短
能
二、HPLC与GC的异同
相同点：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象、流动相以及操作条件
dp 2 C Dm
Dm
T

dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3、HPLC降低板高、提高柱效的方法 1）采用小粒度、颗粒均匀的球形固定相，首选化学 键合相； 2）用低黏度的溶剂作流动相； 3）流动相采用低流速（1mL/min）； 4）适当提高柱温，25—30º C。
2）涡流扩散项（多径扩散项）：A
产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 → 路径不同→涡流扩散
涡流扩散系数 A 2 dp
— 填充不规则因子
dp — 填充颗粒直径
讨论：
，dp A H n 柱效
，dp A H ，n 柱效
3）荧光检测器（FD）：只能分析自身或是衍生化后能够产生荧光的物 质，灵敏度高（专属） 原理：利用某组分在溶液中受光激发后，能发射荧光的性质来进行检测。 优点：灵敏度高；选择性好 缺点：只适合具有荧光性的物质
4、检测器：将流出色谱柱的洗脱液中组分的量或浓度定量 转化为电信号
4）示差折光检测器（RID）：利用折光率的差别，灵敏度低，温度要 求严格（通用） 原理：利用纯流动相和含有待测组分流动相之间折射率的差别进行检测 的。 优点：灵敏度适宜；通用型检测器 缺点：对温度变化敏感；不能用于梯度洗脱法中 5）电化学检测器（ECD） 6）化学发光检测器 7）MS、FTIR、NMR等
4）梯度洗脱装置
洗脱方式——等度和梯度两种
洗脱装置——低压梯度和高压梯度装置 低压梯度 高压梯度
高压泵 混合阀 高压泵 混合阀 高压泵
梯度洗脱剂
一台高压泵，常压下通过比例调节阀，将各种不同极性的溶剂按一 定的比例混合后，再被抽入高压泵中增压送入色谱柱
利用两台高压输液泵，程序控制每台泵的输出流量，在泵后的高压 状态下混合，混合后进入色谱柱
三、化学键合相色谱法（BPC）
1、化学键合相 2、反相键合相色谱 3、正相键合相色谱 4、离子对色谱和离子抑制色谱
1、化学键合相：目前应用最广、性能最佳的固定相； 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 A、硅氧碳键型： ≡Si—O—C B、硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 C、硅碳键型： ≡Si—C D、硅氮键型： ≡Si—N
保护柱、色谱柱、恒温装置、连接阀 常用：直径4~6mm，柱长10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验： R ， n ， T （拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 发展趋势：减小填料粒度和柱径以提高柱效
4、检测器：将流出色谱柱的洗脱液中组分的量或浓度定量转 化为电信号
各种检测器： 1）紫外检测器（UVD）：适于具有紫外吸收的物质（常用、专属） 原理：基于待测组分对特定波长的紫外光有选择性的吸收，被测物浓度与 吸光度的关系服从比尔定律。 优点：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、对温度及流动相流速变化不敏感 缺点：不适用于无紫外吸收的物质；流动相的截止波长应小于检测波长 常用仪器：可变波长型检测器（VWD）、二极管阵列检测器（PDAD） 2）蒸发光散射检测器（ELSD）：适用于挥发性低于流动相的组分，特 别适用于无紫外吸收的样品。（通用）
影响因素： dp：降低dp，采用小粒度固定相，常用3-5m。 ：降低，球形、粒度均匀的固定相。 使用小而均匀的填充颗粒能改善柱效
3）传质阻抗项
C Cm Csm Cs Cm Csm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
第八章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
8—1 8—2 8—3 8—4 8—5 8—6 8—7 概述 HPLC色谱仪 HPLC基本理论 各类HPLC及其固定相、流动相 HPLC分析条件的选择 定性与定量分析 液相色谱—质谱联用技术
8— 1
GC
分析对象
HPLC
热稳定性好、沸点较低、分 能溶于流动相的样品，不受样品挥发性和 子质量小的样品，占有机物 热稳定性的限制，占有机物的80% 的20% （1）气体（H2、He、N2）； （ 2 ）组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相作用，通 过改变固定相提高分离选择 性； （ 3 ）流动相种类少，可选择 范围小 加温操作 柱温 H=A+B/u+Cu（填充） H= B/u+Cu（空心毛细管） （1）液体； （ 2 ）流动相与组分间有亲合作用力，可 选用不同性质的溶剂作为流动相，提高分 离效率； （3）流动相种类多，选择范围广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重 要作用 室温；高压 流动相 H=A+Cu=A+Cmu+Csmu
不敏感 不敏感 不敏感 敏感
0.1-10ng
不敏感 不敏感
8—3 HPLC基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论
动力学理论：速率理论——Van deemter方程 一、塔板理论
二、速率理论
一、塔板理论
n理 L H理
tR
或 H 理 L / n理
tR 2 t ) 16( R ) 2 W1 2 W
二、速率理论
B 2 Dm
Dm
T

柱温T 低，流动相 大 B相忽略
HPLC：H A C u
1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u 1mL / min 时，H u u H ，n 柱效 ，但t R
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
3、流动相： 基本要求： 1）与色谱柱不发生不可逆的化学变化； 2）溶解被分离的样品； 3）与所用检测器匹配 基本原则： 极性大的试样用极性较强的流动相； 极性小的试样用低级性的流动相 要精细的调节流动相的极性，可用混合溶剂法； 如果样品中组分的极性相差太大，可用梯度洗脱。
4、影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5、出柱顺序：弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱 6、硅胶含水量较小，吸附色谱，硅胶极性较大 硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量>17%，分配色谱，硅胶失活→载体，吸附 的水→固定液
二、液液分配色谱法（LLC） 固定相与流动相均为液体
1）作为固定相的液相与流动相不互溶； 2）固定液对被分离组分是很好的溶剂。
1、分离机制：利用组分在两相间有不同的分配系数——分配定律 2、固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 3、分类 1）正相色谱：固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 2）反相色谱：固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离弱极性、中等极性组分
ODS：十八烷基键合相，十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基反应键合而成
1）分离机制： 双重分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） （键合基团的覆盖率决定分离机理） 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；
2）特点： A、不易流失 B、热稳定性好 C、化学性能好 D、载样量大 E、适于梯度洗脱
2、反相键合相色谱 1）分离机制：疏溶剂理论 2）固定相：极性小的烷基键合相 C2、C8柱，C18柱（ODS柱：HPLC约80%）C30柱、苯基柱 键合相的键合基团的碳链长度增长后极性减小 3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂（水）+ 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇、乙腈、THF等 4）流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5）出柱顺序： 极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6）适用：非极性~中等极性组分