蛋白结合标签

GST标签的蛋白纯化

1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。

2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。

3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。沉淀于-30℃保存。

4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3

Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0

分别加入1mM DTT用于洗脱和结合

8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。避免空气进入柱内。

9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。

10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速清洗柱。

11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。共收集10柱体积的产物。剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。

12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。

13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。

14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。

根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中

接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品

根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。 Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。

Instruction Manual

ProBondTM Purification System

For purification of polyhistidine-containing

recombinant proteins

Catalog nos. K850-01, K851-01, K852-01, K853-01, K854-01,

R801-01, R801-15

Version K

2 September2004

25-0006 ii iiiTable of Contents

Kit Contents and Storage..................................................................................................................................iv

Accessory Products...........................................................................................................................................vi

Introduction.................................................................................................................................1

Overview..............................................................................................................................................................1

蛋白结合率相关知识

第 1 页 共 1 页 蛋白结合率相关知识

血浆蛋白结合率：药物与血浆蛋白结合的程度，即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数。

血浆蛋白结合率为可逆性疏松结合，结合型药物分子量增大，不能跨膜转运、代谢和排泄，并暂时失去药理活性，某些药物可在血浆蛋白结合部位上发生竞争排挤现象。药物分子与血浆蛋白结合的特点（和药物与受体蛋白结合情况相似）：具有饱和性与可逆性、结合物无活性、有竞争置换现象。

药物进入循环后，有两种形式：

结合型药物：药物与血浆蛋白结合。

特点：

（1）暂时失去药理活性。

（2）体积增大，不易通过血管壁，暂时“储存”于血液中。

意义：结合型药物起着类似药库的作用。药物进入相应组织后也与组织蛋白发生结合，也起到药库作用，影响药物作用和作用维持时间长短，一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长。

游离型药物：未被血浆蛋白结合的药物。

特点：能透过生物膜，进入到相应的组织或靶器官，产生效应或进行代谢与排泄。

药物与血浆蛋白结合方式： 蛋白结合率相关知识

第 2 页 共 2 页 酸性药物与白蛋白结合：华法林、非甾体抗炎药、磺胺类药物主要与血浆白蛋白结合，三环类抗抑郁药、氯丙嗪也与白蛋白结合。

碱性药物与α1-糖蛋白结合：β-糖蛋白和α-酸性糖蛋白虽然量比白蛋白少很多，但在癌症、关节炎、心肌梗死等疾病中可增高，能与奎宁结合。

特点：

（1）可逆性

药物与血浆蛋白的结合是可逆的，极少数是共价结合（如烷化剂）。

药物在血液中转运时，结合型与游离型药物快速达到动态平衡。游离型药物→透过生物膜→血液中游离型药物浓度降低→结合型药物，释出游离型药物。

（2）饱和性

血浆中蛋白有一定的量，与药物的结合有限，因此，药物与血浆蛋白结合具有饱和性。

当药物浓度大于血浆蛋白结合能力时→饱和→游离型药物急剧增加→毒性反应。

蛋白质融合表达的标签及切割研究

作者：佚名 文章来源：生物谷 点击数：164 更新时间：2008-6-12

蛋白质融合表达的标签及切割研究

摘要：随着蛋白质组学技术的迅猛发展，重组蛋白的使用在近年来大大增加。许多蛋白质、结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于目标蛋白的纯化和检测这个优点被广泛赞同。本文对多种融合标签及切割方法做了简单的概述。

引言

近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质.这些亲和标签系统具有以下特征:(a)一步的吸附纯化,(b)对三级结构和生物活性影响小,(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质,(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确,(e)适用于大量的不同蛋白质.有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质.其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰.使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, S-, and

Strep II-tag等. 对于某些应用,小标签无需去除.这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体. 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成.另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合蛋白.，它们的使用可以增加目标蛋白的溶解性.缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除.一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统.这取决于目标蛋白本身(如稳定性,疏水性),表达系统,纯化后蛋白的用途.

1．融合标签

融合标签的作用是用于检测和纯化目的蛋白，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。

亲和标签 基质 洗脱条件

Poly-Arg 阳离子交换树脂 在碱性pH>8.0 NaCl线性梯度0-400mM Poly-His Ni2+-NTA, Co2+-CMA (Talon) 150