慢病毒颗粒RNA提取试剂盒

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110200887.9(22)申请日 2021.02.23(71)申请人 山东思科捷生物技术有限公司地址 250000 山东省济南市中国（山东）自由贸易试验区济南片区新泺大街786号生产装配车间B座506(72)发明人 冯锐　任光琳　韩小东　程建祥　李昌静　(74)专利代理机构 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 37256代理人 张洁(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法(57)摘要本发明提出一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，属于分子生物学检测技术领域，该细胞RNA快速提取试剂盒包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱，所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris ‑HCl 0.01‑0.1M、N ‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)，所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris ‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。

本发明能够解决现有RNA提取方法存在操作步骤繁琐、耗时长、RNA纯度低且稳定性差等的技术问题。

本发明能够应用于RNA提取方面。

权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 112725334 A 2021.04.30C N 112725334A1.一种细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris ‑HCl 0.01‑0.1M、N ‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)；所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris ‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。

杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://EASYspin Plant RNA KitEASYspin植物RNA快速提取试剂盒目录号：RN09试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次(RN0902)裂解液RLT 室温50 ml去蛋白液RW1 室温40 ml漂洗液RW 室温10 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-free H2O 室温10 mlPLANTaid 室温 5 mlRNase-free吸附柱RA和收集管室温50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项：1.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。

2.需要自备乙醇，研钵(可选)。

3.裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。

若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.关于DNA 的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜已经清除了绝大部分的DNA残留，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：1)选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。

本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。

YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。

（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。

（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。

产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。

Tips :培养基里面不要添加抗生素。

2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。

3. 准备转染。

在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。

室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。

Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。

然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。

置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。

4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。

5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。

Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。

6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。

7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。

慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。

RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明货号：R2000规格：50T/100T保存：室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。

产品内容：试剂盒组成R2000-50R2000-100蛋白酶K1ml2ml洗柱液50ml2ml结合液25ml50ml×2漂洗液15ml50mlRNase free ddH2O15ml15ml×2RNase free吸附柱50个100个RNase free收集管(2ml)50个100个产品介绍：RNA病毒基因组提取试剂盒适合于从血清、细胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因组，不适合于细胞等组织内RNA病毒基因组的提取。

使用本试剂盒提取的基因组RNA可用于RT-PCR实验。

操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入一瓶新开启的无水乙醇，加入到离瓶口约0.5-1cm距离，盖好摇匀。

所有离心步骤均在2-8℃条件下进行。

1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm离心5min，尽量吸尽上清使用，弃去沉淀（如无沉淀可省去此步）。

2、向病毒上清中加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化10min，期间可颠倒离心管混匀数次。

3、吸附柱前处理：从包装中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中待用。

4、向病毒上清中加入500ul结合液，充分混匀。

再向管中加入400ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响RNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。

（吸附柱的最大容积为750ul，可分两次加入。

一次吸附完离心后再将余下的混合液体加入柱中静置离心。

）5、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

病毒滴度检测之慢病毒滴度检测试剂盒方案病毒滴度即病毒的毒力，或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）和半数致死量（LD50），其中以LD50最常用。

它是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量。

前面我们介绍过慢病毒包装，这里重点介绍一下病毒滴度，那么什么是慢病毒滴度？慢病毒滴度是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量，即每升溶液中含有的病毒数量。

转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组。

病毒包装后的效力如何，如何定量，也是必须要检测的，专业术语称为：病毒滴度的测定。

下面我们就来聊下几种常见的慢病毒载体滴度的检测方法。

一、病毒滴度检测ELISA法p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白。

p24 ELISA法测量病毒上清液中p24衣壳蛋白的量，然后将p24的含量水平与病毒滴度关联起来。

Cell Biolabs提供的基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分两种，一种称为传统的p24蛋白ELISA检测（Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)），能检测所有p24蛋白，从而实现对病毒滴度的定量，可检测1 ng/mL HIV p24蛋白，最后分光光度计读取数据。

但是由于这种传统的p24 ELISA 法能检测所有p24蛋白，所以病毒滴度会偏高。

同时Cell Biolabs的新Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分离出包装细胞产生的游离p24蛋白，只检测病毒颗粒表面的p24，因此实验数据更真实准确，可检测1 ng /mL HIV p24蛋白，最后分光光度计读取数据。

1、传统的p24 ELISA法QuickTiter 慢病毒滴度检测试剂盒（p24蛋白ELISA检测）：慢病毒载体的HIV-1 p24核心蛋白的定量是一种确定慢病毒物理滴度的有效且广为人知的方法。

∗基金项目:北京市自然科学基金资助项目(编号:7192084);首都卫生发展科研专项(编号:2020-2-1152);北京市属医学研究所公益发展改革试点项目(就医研2021-10)作者单位:100069北京市首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所第一作者:霍云飞,男,23岁,硕士研究生㊂E-mail:yunfeihuo@ 共同第一作者:寇卜心,女,32岁,大学本科,检验技师㊂E-mail:koubuxin@通讯作者:石英,E-mail:yingshi@ ㊃实验性肝炎㊃体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定∗霍云飞,寇卜心,柴梦音,豆双双,高明慧,石英,刘晓霓㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达㊂方法㊀设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列㊂shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,并采用Western Blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果㊂结果㊀测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429㊁pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7ˑ108TU/mL㊁6.1ˑ108TU/mL和6.4ˑ108TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后,与对照慢病毒(pHS-ASR-LW429)比,经Western Blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦结果显示两个Lenti-shTP53BP2均能显著下调HepG2细胞TP53BP2基因水平和蛋白表达量㊂结论㊀本研究成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体,其能有效下调HepG2细胞TP53BP2的表达,为进一步研究TP53BP2在肝癌发生发展过程中的机制研究奠定了基础㊂㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀HepG2细胞;肿瘤蛋白p53结合蛋白2;短发夹RNA;慢病毒;体外㊀㊀DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.02.004㊀㊀Construction and functional verification of a shRNA lentiviral vector targeting to TP53BP2gene in HepG2cells in vitro㊀Huo Yunfei,Kou Buxin,Chai Mengyin,et al.Beijing Institute of Hepatology,You an Hospital,Capital Medical University, Beijing100069,China㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀The present paper aimed to inhibit the expression of tumor suppressor p53-binding protein2 (TP53BP2)in liver cancer by short hairpin RNAs(shRNAs)with lentiviral vector.Methods㊀Two pairs of RNA interference sequences targeting to TP53BP52gene were designed,and their corresponding shRNA sequences were synthesized.After annealing of shRNA to form double-stranded oligo sequences,the recombinant plasmid was constructed by gene recombination technique. The correct recombinant plasmid was used after PCR and sequencing identification of the colony for lentivirus packaging and titer determination.The interference effect of lentivirus lenti-shTP53BP2on TP53BP2gene in HepG2cells was observed by Western Blot,qRT-PCR and laser confocal technique.Results㊀The sequencing alignment results showed that each recombinant lentiviral vector was consistent with the designed reference sequence,indicating that each recombinant lentiviral vector was successfully constructed;the titers of pHS-ASR-LW429,pHS-ASR-LW512and pHS-ASR-LW513were9.7ˑ108TU/mL,6.1ˑ108TU/mL and6.4ˑ108TU/mL,respectively;the HepG2cells were infected with lentivirus lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512and pHS-ASR-LW513),and the results of Western blot,qRT-PCR and laser confocal technique showed that the two lenti-shTP53BP2significantly down-regulated the TP53BP2RNA level and itsprotein expression in HepG2cells as compared with the controllentivirus(PHS-ASR-LW429).Conclusion㊀In this study,we successfully construct the shRNA lentiviral vector targeting toTP53BP2gene with the capacity of effectively down-regulation ofTP53BP2expression in HepG2cells,which might lay afoundation for further research on the mechanism of TP53BP2inthe hepatocarcinogenesis.㊀㊀ʌKey wordsɔ㊀HepG2cells;Tumor suppressor p53-binding protein2;Short hairpin RNA;Lentivirus;In vitro㊀㊀据2019年世界卫生组织统计,恶性肿瘤是大多数国家70岁前死亡的第一或第二大主要原因[1]㊂肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一,在2020年统计研究时显示其新发病例数和死亡病例数分别位居第六位和第三位,依然存在复发率高和生存率低的问题[1-3]㊂肿瘤抑制蛋白p53结合蛋白2(tumor sup-pressor p53-binding protein2,TP53BP2),又称p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein2of p53,ASPP2),是一个由TP53BP2基因编码的全长为1128个氨基酸的肿瘤抑制因子[4]㊂在其C端, TP53BP2具有一个富含脯氨酸结构域(Pro),四个锚蛋白结构域(Ank)和一个SH3结构域;在其N端, TP53BP2具有一个泛素样折叠结构(ULD)和一个α-螺旋结构[5]㊂TP53BP2表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系㊂研究显示,胃癌[6]㊁乳腺癌[7,8]㊁子宫内膜癌[9]㊁口腔癌[10]等多种恶性肿组织TP53BP2呈低表达,而TP53BP2表达与肝癌的发生发展的关系日益得到关注㊂RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的双链RNA诱发的基因沉默现象,能特异性干扰靶基因的表达[11]㊂慢病毒载体能稳定介导基因沉默,具有转染效率高和稳定表达的优势[12]㊂本研究旨在构建靶向TP53BP2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达,为后续TP53BP2在肝癌发生发展中的机制研究奠定基础㊂1㊀材料与方法1.1质粒㊁慢病毒载体㊁细胞与试剂㊀质粒小量快速提取试剂盒(Aidlab公司);限制性内切酶(Thermo 公司);慢病毒载体pLV-hU6-shRNA-hef1a-mNeon-green-P2A-Puro购自北京合生基因科技有限公司㊂HepG2细胞和293T细胞均由本实验室保存㊂T4 DNA ligase㊁慢病毒包装试剂盒㊁EpFect Transfection Reagent㊁EvaGreen2ˑMaster Mix(Syngen Tech公司);FastPure Cell/tissue Total RNA Isolation Kit V2 (Vazyme公司);PrimeScriptTM II1ST Strand cDNA Synthesis Kit㊁TB Green Premix Ex TaqTM(Takara公司);彩虹180广谱蛋白Marker(Solarbio公司); DMEM培养基㊁胎牛血清和Puromycin(Gibco公司);抗β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司);抗TP53BP2单克隆抗体(Abcam公司)㊂1.2目的基因干扰靶点的设计㊀根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology In-formation,NCBI)提供的TP53BP2基因的核酸序列,设计siRNA靶向序列和阴性对照序列(表1)㊂表1㊀siRNA靶向序列siRNA㊀㊀靶向序列TP53BP2shRNA01GGATCTGACTCTTGCTGAACT TP53BP2shRNA02GCTGAGAATCAGGAAGCTAA NC shRNA03AAACGTGACACGTTCGGAGAA 1.3shRNA的合成及退火㊀shRNA由北京合生基因科技有限公司进行合成㊂在合成的shRNA中,loop 茎环结构为CGAA(表2)㊂将合成的单链shRNA用oligo annealing buffer溶解成20μM,互补单链各取30μl进行混合,置于95ħ水浴锅中加热5min,然后室温冷却,形成双链oligo片段㊂取双链oligo片段1μl用于后续的连接反应,其余置于-20ħ保存㊂表2㊀TP53BP2基因沉默慢病毒载体信息载体编号载体内容shRNA序列pHS-ASR-LW512TP53BP2shRNA015 -GGATCTGACTCTTGCTGAACT CGAAAGTTCAGCAAGAGTCAGATCC-3 pHS-ASR-LW513TP53BP2shRNA025 -GCTGAGAATCAGGAAGCTAAG CGAACTTAGCTTCCTGATTCTCAGC-3 pHS-ASR-LW429NC shRNA035 -AAACGTGACACGTTCGGAGAA CGAATTCTCCGAACGTGTCACGTTT-31.4载体质粒与退火的shRNA连接㊀取载体质粒pLV-hU6-shRNA-hef1a-mNeongreen-P2A-Puro,经BsaI酶切线性化后与退火的双链oligo序列在表3的连接反应体系下于16ħ过夜连接,完成慢病毒基因沉默质粒构建(图1)㊂其中,阳性对照所加的退火的双链oligo是经验证连接效果较好的片段,与连接组所加的退火的双链oligo长度一样,但与目的序列无关㊂表3㊀连接反应体系试剂阳性对照(μL)自连对照(μL)连接组(μL)退火的双链oligo10mM1 1线性化的干扰载体40ng/μL333 10ˑT4DNA ligase Buffer222 T4DNA ligase111 dd H2O Up to20Up to20Up to20图1㊀TP53BP2基因沉默慢病毒质粒示意图1.5转化㊁菌落鉴定与测序㊀用构建完成的质粒转化DH5α感受态细胞,然后涂布于含有氨苄西林(ampi-cillin,Amp)抗性的LB固体培养基平板,37ħ培养过夜㊂经培养后挑取单一菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆,对得到的阳性克隆进行测序验证(测序引物序列:CAGGAAGAGGGCCTATTTCCC)㊂对经测序验证正确的阳性克隆,用质粒小量快速提取试剂盒提取质粒,取提取出的质粒用于慢病毒的包装㊂1.6慢病毒包装㊀取3~5ˑ106个293T细胞,接种于10cm细胞培养皿中,置于37ħ,5%CO2的培养箱中过夜培养㊂然后,使用慢病毒包装试剂盒中的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)和EpFect Transfection Reagent等试剂进行慢病毒包装系统转染㊂在转染48h后,收集含有慢病毒的上清液,更换新鲜培养基继续培养24h,再次收集上清㊂将收集到的上清和浓缩试剂按照5:1的比例在4ħ过夜进行混合㊂混合后,在4ħ,4000g条件下离心30min,收集沉淀㊂使用PBS重悬沉淀,即得到病毒浓缩液㊂将收集到的病毒浓缩液分装,保存于-80ħ㊂1.7慢病毒滴度测定㊀取1ˑ105个293T细胞,接种于6孔板,置于37ħ,5%CO2的培养箱中过夜培养,用于病毒滴度测定㊂每种病毒分别按0.1μL㊁1μL和10μL体积接种3个孔,并添加终浓度为8μg/mL的促感染试剂Polybrene㊂培养72h后拍照,记录病毒感染后的情况并提取基因组DNA,用于qRT-PCR检测㊂qRT-PCR实验的扩增/检测对象为慢病毒载体上的WPRE序列(WPRE序列可以随目的基因整合入细胞基因组)㊂根据公式TU ml-1= (CˑNˑDˑ1000)/V,即可计算出慢病毒滴度㊂其中,C为平均每基因组整合的病毒拷贝数;N为感染时细胞的数目;D为病毒载体的稀释倍数,V为加入的稀释病毒的体积数(μL)㊂1.8慢病毒转染HepG2细胞和干扰效果鉴定㊀取1ˑ105个HepG2细胞,接种于6孔板,过夜培养后,在孔中加入慢病毒和8μg/mL的Polybrene㊂每孔所加病毒量(μL)=MOIˑ感染时的细胞数/病毒滴度ˑ1000,其中HepG2的MOI值为10~30㊂转染24h 后更换新鲜培养基,继续培养24~48h,拍照,记录感染情况,并加入嘌呤霉素筛选转染成功的细胞㊂收集转染成功的HepG2细胞,分别采用Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察TP53BP2基因在蛋白质和mRNA水平上的表达情况㊂GAPDH 和TP53BP2引物序列见表4㊂表4㊀qPCR引物序列名称序列GAPDH F:GGAGCGAGATCCCTCCAAAATR:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGGASPP2F:ATTCGTCTTTGGAGGGAGAR:ATTGTGAAGAGCCGTGATG1.9统计学方法㊀计量资料以xʃs表示,采用Student s t检验,应用SPSS24.0软件进行分析,P< 0.05为差异有显著性统计学意义㊂2㊀结果2.1TP53BP2基因沉默慢病毒质粒载体构建成功㊀我们将退火的双链oligo序列与经BsaI酶切割后的线性化载体在T4DNA ligase的作用下进行连接,并经菌落PCR筛选阳性克隆和DNA测序,测序比对结果显示各重组质粒载体序列与设计序列一致(图2)㊂由此可见,pLV-hU6-shTP53BP2-hef1a-mNeongreen-P2A-Puro质粒(pHS-ASR-LW512; pHS-ASR-LW513)构建成功㊂图2㊀TP53BP2基因沉默慢病毒质粒测序比对结果A:pHS-ASR-LW429;B:pHS-ASR-LW512;C:pHS-ASR-LW513 2.2慢病毒Lenti-shTP53BP2包装和滴度检测情况㊀我们采用慢病毒包装试剂盒和293T细胞包装基因沉默慢病毒质粒,48h后在荧光显微镜下观察到所有细胞均具有GFP绿色荧光,说明慢病毒包装成功(图3)㊂提取经慢病毒转染后的293T细胞基因组DNA,进行qRT-PCR检测,经数据分析得出慢病毒的滴度,其中pHS-ASR-LW429为9.66ˑ108TU/ mL,pHS-ASR-LW512为6.13ˑ108TU/mL,pHS-ASR-LW513为6.36ˑ108TU/mL(表5㊁表6和表7)㊂2.3Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞干扰效果情况㊀我们使用Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)和对照Lenti-NC shRNA(pHS-ASR-LW429)转染HepG2细胞24h后,更换新鲜培养基继续培养24~48h,添加含有6μg/mL嘌呤霉素的培养基进行筛选㊂当未转染慢病毒的细胞在含有嘌呤霉素的培养基中全部死亡后,转入2μg/mL 嘌呤霉素的培养基维持筛选,所有细胞表达GFP绿色荧光,提示转染成功(图4A)㊂经Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察HepG2细胞TP53BP2表达,发现在mRNA水平和蛋白质水平上pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513两种慢病毒感染的HepG2细胞TP53BP2表达均显著降低(图4 B~E)㊂表5㊀pHS-ASR-LW429滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11047.22ˑ10519.4ˑ10821 5.12ˑ1051 1.0ˑ1099.7ˑ108 30.10.52ˑ10519.4ˑ108表6㊀pHS-ASR-LW512滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11032.62ˑ1051 6.5ˑ10821 3.42ˑ1051 6.9ˑ109 6.1ˑ108 30.10.32ˑ1051 5.0ˑ108表7㊀pHS-ASR-LW513滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11028.42ˑ1051 5.7ˑ10821 3.32ˑ1051 6.6ˑ109 6.4ˑ108 30.10.32ˑ1051 6.8ˑ1083㊀讨论TP53BP2作为一个重要的肿瘤抑制基因,在肿瘤,尤其是肝癌的发生发展过程中发挥着重要作用㊂研究表明,TP53BP2参与自噬[13]㊁细胞增殖[14]㊁化疗耐药性[15,16]等信号的调节,影响着肝癌的发生发展和患者预后㊂我们先前的研究也发现,敲除TP52BP2基因可促进二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌的发生[17]㊂本研究针对TP53BP2基因设计合成了2条RNA干扰寡核苷酸链,采用基因重组技术和慢病毒包装技术成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体㊂进一步利用成功构建的Lenti-shTP53BP2慢病毒转染HepG2细胞,经Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察其靶向沉默图3㊀TP53BP2基因沉默慢病毒包装过程中239T 细胞GPF 绿色荧光表达情况(48h)图4㊀Lenti -shTP53BP2对HepG2细胞的干扰效果A:荧光显微镜观察HepG2细胞经慢病毒感染后GFP绿色荧光表达(100ˑ);B:激光共聚焦观察HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2蛋白表达;C /D:Western blot 验证HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2蛋白表达;E:qRT -PCR 验证HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2mRNA 水平与pHS -ASR -LW429比,∗P <0.05,∗∗P ∗<0.001TP53BP2基因的效果㊂结果发现无论是从蛋白水平还是mRNA 水平,pHS -ASR -LW512和pHS -ASR -LW513两种慢病毒均能有效抑制HepG2细胞TP53BP2的表达㊂实验的成功为进一步研究TP53BP2基因在肝癌发生发展过程中的机制奠定了基础㊂ʌ参考文献ɔ[1]Sung H,Ferlay J,Siegel R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185countries.Ca Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.[2]Tian G,Yang S,Yuan J,et parative efficacy of treatmentstrategies for hepatocellular carcinoma:systematic review and network meta -analysis.BMJ Open,2018,8(10):e21269.[3]Kulik L,El -Serag H B.Epidemiology and management of hepato-cellular carcinoma.Gastroenterology,2019,156(2):477-491.[4]Samuels -Lev Y,O'Connor D J,Bergamaschi D,et al.ASPP pro-teins specifically stimulate the apoptotic function of p53.Mol Cell,2001,8(4):781-794.[5]Ahn J,Byeon I L,Byeon C H,et al.Insight into the structural ba-sis of pro -and antiapoptotic p53modulation by ASPP proteins.JBiol Chem,2009,284(20):13812-13822.[6]Gen Y,Yasui K,Kitaichi T,et al.ASPP2suppresses invasion andTGF -beta1-induced epithelial -mesenchymal transition by inhibiting Smad7degradation mediated by E3ubiquitin ligase ITCHin gastric cancer.Cancer Lett,2017,398:52-61.[7]Wu T,Song H,Xie D,et al.Mir -30b -5p proliferation,migration,and invasion of breast cancer cells via targeting ASPP2.Biomed Res Int,2020,2020:7907269.[8]Wu T,Song H,Xie D,et al.Silencing of ASPP2promotes theproliferation,migration and invasion of triple -negative breast cancercells via the PI3K /AKT pathway.Int J Oncol,2018,52(6):2001-2010.[9]Konno T,Kohno T,Okada T,et al.ASPP2suppression promotesmalignancy via LSR and YAP in human endometrial cancer.Histo-chem Cell Biol,2020,154(2):197-213.[10]Patel K D,Barasiya Y V,Patel J B,et al.Apoptosis stimulatingprotein of p53(ASPP)1and ASPP2m -RNA expression in oral cancer.Arch Oral Biol,2020,119:104920.[11]Mondal M,Klimov P,Flynt A S.Rewired RNAi -mediated genomesurveillance in house dust mites.PLoS Genet,2018,14(1):e1007183.[12]Poling B C,Tsai K,Kang D,et al.A lentiviral vector bearing a re-verse intron demonstrates superior expression of both proteins andmicroRNAs.RNA Biol,2017,14(11):1570-1579.[13]Chen R,Wang H,Liang B,et al.Downregulation of ASPP2im-proves hepatocellular carcinoma cells survival via promoting BECN1-dependent autophagy initiation.Cell Death Dis,2016,7(12):e2512.[14]Liang B,Chen R,Song S,et al.ASPP2inhibits tumor growth byrepressing the mevalonate pathway in hepatocellular carcinoma.Cell Death Dis,2019,10(11):830.[15]Xu L,Tong X,Zhang S,et al.ASPP2suppresses stem cell -likecharacteristics and chemoresistance by inhibiting the Src /FAK /Snail axis in hepatocellular carcinoma.Tumour Biol,2016,37(10):13669-13677.[16]Yang T,Gao Y,Liu D,et al.ASPP2enhances chemotherapeuticsensitivity through the down -regulation of XIAP expression in a p53independent manner in hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun,2019,508(3):769-774.[17]Wang S,Kou B,Chai M,et al.Knockout of ASPP2promotes DEN-induced hepatocarcinogenesis via the NF -kappaB pathway inmice.Cancer Gene Ther,2022,29(2):202-214.(收稿:2022-10-14)(本文编辑:陈从新)。

1、组织处理：将组织于液氮内研磨，每50-100mg加1mL裂解液MRL后匀浆，组织样品容积不能超过MRL的10%；2、将匀浆剧烈混匀，在15-30℃条件下孵育5min，是核蛋白体完全分解；3、可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。

4、每1ML加0.2ml氯仿。

剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min；5、于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分3层，上层为水相，RNA存在于水相中，水相层的容量大约为锁甲MRL体积的60%，把水相转移到新管仲，进行下一步操作；6、加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中；7、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。

）滤出小RNA.8、加入700ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；9、加入500ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；10、空液离心2min，1200rpm；11、取出吸附柱RB，放入RNase free离心管中，根据预期RNA产量，在吸附膜中间部位加入60-80ul，RNase free water事先在65-70℃水浴加热，室温放置2min，12000rpm 离心1min，收集得到microRNA,保存于-20摄氏度或更低。

1、组织+裂解液每50-100mg加1mL 15-30℃条件下孵育5min2、每1ML加0.2ml氯仿剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min 4℃12000rpm离心10分钟3、把水相转移到新管仲加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中4、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。

Lenti-Pac TM HIV表达包装试剂盒——优化重组慢病毒·使用手册目录1 产品概述2 试剂盒组成3 其它所需细胞及试剂4 实验前准备5 制备慢病毒颗粒6 病毒颗粒滴度检验7 以制得慢病毒颗粒感染目的细胞8 使用许可与质量保证GeneCopoeia, Inc. 广州复能基因有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：sales@网址：© 2013 GeneCopoeia, Inc.1.产品概述复能基因现提供40000多套人源及小鼠源ORF表达克隆，同时提供针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶标基因的小发夹结构RNAi（shRNA）克隆。

HIV（人类免疫缺陷病毒）载体是近来使用最普遍的慢病毒表达载体，它能有效从体外或体内介导外源基因转导进入多种分化或非分化哺乳动物细胞。

慢病毒表达载体可整合到靶细胞基因组，产生稳定的转基因表达。

根据疾病控制中心作出的标准，复能基因第三代HIV慢病毒载体需要生物安全第二级的实验室操作。

复能基因提供的Lenti-Pac TM HIV表达包装系统包括：优化的慢病毒包装质粒混合物、eGFP阳性对照质粒、可优化病毒产物的复能基因EndoFectin TM转染试剂、可5-10倍提高病毒滴度的复能基因TiterBoost TM滴度增强剂。

结合复能基因HIV载体的慢病毒克隆，制得慢病毒颗粒具有高滴度及高表达水平的特质。

Lenti-Pac TM HIV骨架的表达包装系统可保证重组转录本在哺乳动物细胞的表达。

OmicsLink TM慢病毒ORF表达克隆和shRNA克隆的优点·从体外或体内高效转导基因至所有类型的哺乳动物细胞·ORF表达克隆转导后获得高表达水平·高效敲除靶标mRNA转录本·病毒载体自身失活，不产生其它病毒复制2．试剂盒组成试剂盒组成及推荐储存环境(表格内容参照货号Cat. No. HPK-LvTR-20/HPK-LvTR-40)3. 其它所需细胞及试剂1. GeneCopoeia GCI-L3化学感受态细胞(GeneCopoeia Cat No. STK300-10)，亦可选择Stbl3™化学感受态细胞(Invitrogen Cat No. C7373-03)2. GeneCopoeia 293Ta 慢病毒包装细胞系(GeneCopoeia Cat No. Clv-PK-01)，亦可选择HEK293T/17细胞系(ATCC Cat No. CRL-11268)3. H1299细胞系(ATCC Cat No. CRL-5803)或HT-1080细胞系(ATCC Cat No. CCL-121)，该细胞系用于测定慢病毒滴度。

RNA 提取试剂盒1、总RNA 提取试剂（TRI Reagent，RNA Isolation Reagent）TRI ® Reagent 是改进型的一步法细胞总RNA 纯化试剂。

它可以快速、经济、有效的提取人、动物、植物、酵母、细菌和病毒的总RNA。

也可以同时提取DNA 和蛋白质。

该产品含有硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA 和蛋白质。

在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。

水相的RNA 经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA 或者蛋白质污染，可以用于Northern blots、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 酶保护分析、克隆或者PCR 等等。

该产品可以有效分离0.1-15 kb 长度单位内的RNA 分子，每毫升TRI® Reagent 可以提取5-10×106细胞、50-100mg 组织或者10 cm 2培养瓶表面的单层培养细胞。

完全移走水相的离心产物加入无水乙醇沉淀DNA，用柠檬酸钠乙醇溶液洗涤，溶解后可用于PCR、限制性酶切以及Southern blotting 等。

沉淀DNA 后的水相加入异丙醇沉淀蛋白质，用盐酸胍乙醇溶液洗涤，分离的蛋白质可用于Western blotting 等。

优点：1）可用于多种组织：人、动物、植物、酵母、细菌和病毒。

2）提取大量或者少量的组织细胞效果良好。

3）比传统的硫氰酸胍/氯化铯方法产率高。

4）1 ml 最多可以提取107细胞或者100 mg 组织。

货号名称适用范围产品规格价格T9424TRI Reagent组织，培养细胞，细胞团25ml, 100 ml, 200ml506，1590，2860T3809TRI ReagentBD全血，血浆，血清25ml, 100 ml, 200ml536，1699，2978T3934 TRI Reagent LS 细胞悬浮液，脑脊液，羊水25ml, 100 ml, 200ml938，2603，43362、哺乳动物细胞总RNA 提取试剂盒（GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kits）该试剂盒结合了硅质膜技术和离心柱技术，可以快速结合、洗涤、溶解获得高质量的细胞总RNA。