Septin9基因甲基化检测操作说明

septin9基因甲基化检测标准值解释说明引言部分的内容可以如下所示：1.1 概述随着生物医学研究的深入，基因甲基化检测成为了重要的研究领域之一。

在肿瘤研究中，特定基因的甲基化状态被广泛认为是一种重要的生物标志物。

其中，septin9基因甲基化作为血液中常见的肿瘤标志物，在早期肿瘤诊断和预后评估方面表现出了巨大潜力。

然而，在septin9基因甲基化检测中，如何确定其标准值却成为一个关键问题。

本文将详细阐述septin9基因甲基化检测标准值的重要性和定义，并探讨制定这些标准值所面临的困难和挑战。

1.2 文章结构本文主要包括以下几个方面内容：首先是对septin9基因甲基化检测进行介绍，包括其原理、方法和应用领域等；接着将深入探讨相关研究现状，总结已有文献对septin9基因甲基化检测的报道以及相关进展；随后将着重讨论septin9基因甲基化检测标准值的重要性和定义，包括对其背景与意义的分析以及方法与原则的确定；接下来将探讨septin9基因甲基化检测所采用的技术和方法，包括基于PCR和质谱分析等传统技术，以及近年来涌现的新兴技术；最后，本文将总结已有研究进展，并展望未来septin9基因甲基化检测标准值的发展方向。

1.3 目的本文旨在全面介绍septin9基因甲基化检测标准值这一重要内容，并就其背景、定义、制定过程中所遇到的难题进行详细探讨。

通过对相关技术和方法的探索，为未来该领域的研究提供参考和指导。

同时，本文也旨在为读者提供一个更深入了解septin9基因甲基化检测标准值的文章，并对该领域中存在的问题进行思考和解决。

2. 正文:2.1 septin9基因甲基化检测介绍:septin9基因甲基化是一种通过检测DNA序列上的甲基化修饰来评估癌症风险的方法。

septin9基因在肿瘤细胞中常常表现出异常的甲基化状态，而在正常细胞中则很少发生这种改变。

因此，通过分析septin9基因的甲基化水平，可以作为一种非侵入性的筛查手段来辅助癌症早期诊断。

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(2)血浆游离DNA Septin 9基因甲基化检测方法罗智，胡英斌，卜小云（湖南省肿瘤医院结直肠外科，长沙410013）[摘要]目的：探讨血浆游离DNA Septin 9基因胞嘧啶-磷酸-鸟苷酸(cytosine-phosphoric-guanylic ，CpG)位点与结直肠癌的相关性，旨在开发基于血浆的real-time PCR 检测体系。

方法：采用高通量测序技术对训练样本组织进行甲基化检测，筛选出与结直肠癌临床信息高度一致性的位点，设计基于甲基化敏感性酶切法-real-time PCR 检测体系，用于分析血浆与组织的一致性，进一步以100例临床测试样本评估甲基化敏感性酶切法-real-time PCR 检测体系的性能。

结果：71例训练样本高通量测序筛选出与结直肠癌临床信息高度一致性的位点为CpG 38号位点；基于检测区域筛选的甲基化敏感性酶为BstU 1、Hha I 、HinP 1I ；开发的甲基化敏感性酶切法-real-time PCR 检测下限为0.5%甲基化程度，Ct 值为38.5；临床测试体系的灵敏度为87.27%，特异度为91.49%，阳性预测值为92.31%，阴性预测值为86.00%。

结论：Septin 9CpG 38号位点的甲基化敏感性酶切法-real-time PCR 检测体系能高度预测结直肠癌的发生，具有重大的临床应用价值。

[关键词]Septin 9；甲基化；结直肠癌；实时荧光定量PCR ；胞嘧啶-磷酸-鸟苷酸位点Detection of free DNA septin 9gene methylation in plasmaLUO Zhi,HU Yingbin,PU Xiaoyun(Department of Colorectal Surgery,Hunan Cancer Hospital,Changsha 410013,China)ABSTRACT Objective:To explore the correlation between cytosine-phosphoric-guanylic (CpG)site of Septin 9gene and colorectal cancer,and to develop a real-time PCR detection system in plasma in patients with colorectal cancer.Methods:The methylation of training samples was detected by high-throughput sequencing technology,and the sites highly consistent with the clinical information of colorectal cancer were identified.Then the detection system of real-time PCR was designed to analyze the consistency of plasma and tissue based on methylationa sensitive enzyme digestion.Finally,100clinical trials were conducted to evaluate the performance of the detection system with the methylation sensitive enzyme digestion-real-time PCR.DOI ：10.11817/j.issn.1672-7347.2021.190790/xbwk/fileup/PDF/202102127.pdf收稿日期(Date of reception)：2019-11-26第一作者(First author)：罗智，Email:895745492@,ORCID:0000-0002-6263-1970通信作者(Corresponding author)：胡英斌，Email:huyingbin@,ORCID:0000-0003-1208-4662基金项目(Foundation item)：湖南省卫生与计划生育委员会科研计划项目(C20180348)。

septin9基因甲基化检测原理引言：近年来，基因检测技术的发展为临床诊断和疾病预防提供了新的可能性。

基于DNA甲基化的检测方法已成为常用的生物标记物检测手段之一。

其中，septin9基因甲基化检测已经被广泛应用于结直肠癌的早期筛查。

本文将介绍septin9基因甲基化检测的原理及其在临床中的应用。

一、DNA甲基化的概述DNA甲基化是一种通过在DNA分子中加入甲基基团来修饰基因表达的机制。

在DNA甲基化过程中，甲基转移酶将甲基基团添加到DNA分子的胞嘧啶（C）碱基上，形成甲基化胞嘧啶（mC）。

DNA 甲基化通常发生在CpG位点上，即胞嘧啶和鸟嘌呤（G）相邻的碱基。

二、septin9基因甲基化检测原理septin9基因位于人类染色体17上，是一个与肿瘤发生和发展相关的重要基因。

在癌症发生过程中，septin9基因的甲基化水平通常会发生改变。

septin9基因甲基化检测是通过检测septin9基因的甲基化状态来判断患者是否存在结直肠癌的一种方法。

septin9基因甲基化检测通常采用基于聚合酶链式反应（PCR）的技术。

具体步骤如下：1. 样本采集：从患者的血液中提取出DNA样本，这一步骤通常采用抽血的方式进行。

2. DNA甲基化处理：将DNA样本进行甲基化处理，使未甲基化的胞嘧啶（umC）转化为甲基化胞嘧啶（mC），以便后续的PCR反应。

3. PCR反应：使用特定的引物和酶，对septin9基因的DNA进行扩增。

PCR反应的结果将根据septin9基因在结直肠癌患者和健康人群中的甲基化差异而有所不同。

4. 产物检测：通过电泳等方法，对PCR反应的产物进行检测。

根据septin9基因的甲基化差异，可以判断样本是否存在结直肠癌。

三、septin9基因甲基化检测的临床应用septin9基因甲基化检测作为一种非侵入性的检测方法，已经在结直肠癌的早期筛查中得到了广泛应用。

相比传统的结直肠镜检查和粪便潜血试验，septin9基因甲基化检测具有以下优势：1. 非侵入性：septin9基因甲基化检测只需要提取血液样本，无需进行疼痛和不适的结肠镜检查。

全基因组甲基化测序的具体方法及步骤全基因组甲基化测序（whole-genome bisulfite sequencing）是一种高通量的测序技术，可以用来检测DNA上的甲基化状态。

甲基化是一种常见的DNA化学修饰形式，对基因表达和细胞分化等过程具有重要影响。

全基因组甲基化测序可以精确地测定基因组DNA的甲基化位点和水平，为研究基因组表观遗传变异和疾病发生机制提供了有力的工具。

以下是全基因组甲基化测序的具体方法和步骤：1.DNA提取：从研究对象的细胞或组织中提取总DNA。

常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、磁珠法等。

2. DNA酶切：使用专门的酶（如MspI）对DNA进行切割，得到平衡的DNA片段。

3. 甲基化处理：将DNA暴露于亚硫酸盐（sodium bisulfite）的甲基硫湿气中。

亚硫酸盐可以将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（T），而甲基化的胞嘧啶不受影响。

这样，通过对比未经处理和经过处理的DNA序列，就可以确定甲基化位点的位置。

4.DNA纯化：使用一系列的纯化步骤，包括酚酸萃取、氯仿萃取和乙醇沉淀等，来去除杂质，使DNA适合进一步的测序分析。

5. 碱基浏览：将经过甲基化处理的DNA片段扩增，并进行高通量测序。

最常用的测序方法是Illumina测序技术。

6. 数据分析：对测序产生的原始数据进行质量控制、序列比对和甲基化位点检测等分析。

这些分析可以使用专门的软件包，如Bismark、Bisulfite-Seq等进行。

7.数据解释：统计和分析甲基化的结果，包括甲基化位点的数量、分布和甲基化水平等信息。

可以使用一系列统计方法和可视化工具，如R语言和基因组浏览器等，进行数据解释和结果展示。

以上就是全基因组甲基化测序的主要方法和步骤。

这种技术的主要优点是可以全面、高通量地测定整个基因组的甲基化状态，为基因组表观遗传变异和疾病发生机制的研究提供了重要的信息。

但是，全基因组甲基化测序也存在一些技术难题，比如DNA片段的扩增偏差和测序误差等，需要在实验设计和数据分析过程中加以考虑和解决。

实战经验：甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。

DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。

因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。

两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第一天只需下午半天即可下午3点开始，先配好试剂再开始做实验需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml离心管，开水浴锅，第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃水浴期间配制： 4：20mM对苯二酚氢醌【0.022g氢醌定容至10ml，用15ml离心管配】，加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：用15ml离心管配，1.88 g 亚硫酸氢钠使用3ml 双蒸水稀释，【一次性加350ul 3M NaOH，，然后谨慎每次加入10ul 3M NaOH仔细观察】并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。

抽血就能检测结直肠癌septin9基因甲基化检测早提示大肠癌呈现出年轻化、高发病率的特点，要想提升患者的长期生存率，就要尽早发现。

以往需要做肠镜及大便暗血实验，取病理活检进行诊断，然而很多人都害怕做肠镜检查，使得一些患者由于肿瘤较大导致肠梗阻才去就诊，已经发展到局部晚期。

当前医学已步入到靶向治疗、基因检测、免疫治疗时期，而septin9基因甲基化检测，可以在大肠癌早期检测中应用，受到了人们的认可。

1、肠癌的高危人群肠癌是一种高发病率的恶性肿瘤，很多患者发现就是晚期。

随着人们的饮食习惯改变等因素影响，疾病的患病率日益提升，且年轻人患疾病的数量不断增加。

有几类人群容易患上肠癌，主要包括：第一，有家族遗传病史。

如果家庭中有直系亲属换过该疾病，那么相较于其他人，其患病概率要高出八倍。

有1/4的患者有家属患病史。

第二，有结肠息肉。

部分大肠癌是从癌前病变发展的，即息肉。

绒毛样腺瘤样息肉更易发展成癌症，几率为25%。

管状腺瘤样息肉变成癌症的概率是1%-5%。

第三，慢性溃疡性结肠炎患者。

第四，中老年人。

患者很多都超过50岁，随着年龄增加，相关的致病因素对于大肠黏膜的刺激时间增加，因此，患者年龄较高，也有一些患者年龄较小。

最后，吸烟喝酒人群。

有研究显示，吸烟的人相较于没有吸烟的人，患大肠癌的风险更高。

如果有大肠息肉及大肠癌的家族病史，每天喝酒超过30g，会提升患大肠癌的概率。

2、什么是septin9基因甲基化检测？septin9基因是直肠癌及结肠癌病人特有的血液标志物，septin9基因甲基化是早期筛查直肠癌的方式之一，特异性较高，通常在95%左右。

通过这一检测，能够了解检测人员的血液样本中是不是有septin9基因的DNA，若是检查发现，代表着患者可能会患结肠癌或直肠癌，需要继续做肠镜以及病理检查，综合检查结果之后做出诊断。

septin9基因甲基化在I期结直肠癌检测中的应用，灵敏度约为60%；在II-III期检测中应用，灵敏度超过80%；在IV期检测中应用，灵敏度超过90%。

基因甲基化水平检测方法嘿，咱今儿个就来唠唠基因甲基化水平检测方法。

这可真是个神奇又重要的玩意儿啊！你想想看，基因就像是我们身体里的一本神秘大书，而甲基化呢，就像是给这本书做的一些标记。

检测这些标记，那可太关键啦！就好比你要了解一本书的重点内容，不就得看看那些特殊的标注嘛。

目前呢，常用的检测方法有好几种。

比如说重亚硫酸盐测序法，这就像是一个超级侦探，能非常准确地找出基因甲基化的具体位置和情况。

它就像是一个细心的考古学家，一点点地挖掘出基因里的秘密。

还有甲基化特异性 PCR 法，这可厉害啦！它能快速又灵敏地检测出基因甲基化的存在与否，就好像是一个敏锐的警报器，一旦发现有异常，马上就发出信号。

免疫沉淀法也不错哦！它就像是一个精准的捕捉器，专门抓住那些和甲基化有关的蛋白质，从而了解基因甲基化的情况。

这就好像你要抓鱼，得先找到鱼爱吃的鱼饵一样。

这些检测方法各有各的特点和用处，就像我们生活中的各种工具一样。

你不能说哪个就一定最好，得根据具体的情况来选择合适的。

比如说，有时候你需要非常精确的结果，那可能就会选择重亚硫酸盐测序法；要是你着急要个大概的情况，那甲基化特异性 PCR 法可能就更合适啦。

咱再打个比方，这检测方法就像是医生看病的手段。

医生得根据病人的症状和需求，选择合适的检查方法来诊断病情，对吧？这基因甲基化水平检测方法也是一样的道理呀！而且哦，随着科技的不断进步，检测方法也在不断地更新和完善呢。

说不定哪天又会出现一种更加神奇、更加好用的检测方法。

这多让人期待啊！你说，要是没有这些检测方法，我们对基因的了解不就少了很多吗？那可不行！我们得靠着这些方法，一点点地揭开基因的神秘面纱，更好地了解我们自己的身体。

总之呢，基因甲基化水平检测方法可真是太重要啦！它们就像是打开基因秘密宝库的钥匙，让我们能更好地探索生命的奥秘。

咱可得好好了解了解这些方法，说不定哪天就能派上大用场呢！你说是不是呀？。

血浆Septin9基因甲基化检测质控品制备及其应用王雪亮;权静;魏萌;徐幸;孔骏;肖艳群;王华梁【摘要】目的制备可模拟临床标本的血浆Septin9基因甲基化(mSEPT9)质控品并用于室间质量评价.方法选择Septin9区域已发生/未发生甲基化的HeLa/Jurkat细胞进行培养,收集并抽提细胞基因组DNA,经mSEPT9试剂盒检测,依据检测Ct值用阴性血浆稀释分装成含有不同浓度的质控品,对质控品均匀性和稳定性进行评价后,将5个样品随机编号后发送至参评实验室,分析评价回报结果.结果抽提得到的细胞基因组DNA纯度和浓度均可满足使用需求,且可用作mSEPT9检测的质控品.均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品要求.部分参评实验室出现假阳性和假阴性情况,仅有约55.6％实验室的检测结果(Ct值)呈良好线性相关.9家参评实验室中,7家实验室(77.8％)成绩优秀,1家实验室(11.1％)成绩合格,1家实验室(11.1％)成绩不合格.结论成功研制血浆mSEPT9检测的质控品并应用于室间质评,有利于评估并提升临床实验室检测能力.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2019(037)006【总页数】3页(P445-447)【关键词】Septin9;Septin9基因甲基化;结直肠癌;质控品;室间质量评价【作者】王雪亮;权静;魏萌;徐幸;孔骏;肖艳群;王华梁【作者单位】上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126【正文语种】中文【中图分类】R446血浆Septin9基因甲基化(mSEPT9)是诊断结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的特异性生物标志物[1-4]。

Septin9基因甲基化检测操作说明
Septin9基因甲基化检测
1.3.5ml血浆+3.5ml裂解液，涡旋混匀，RT静置10min。

2.加入90ul混匀磁珠、2.5ml无水乙醇，颠倒混匀5-6次，10-20rpm旋转混匀40-50min。

3.取下15ml离心管，置于磁力吸附架，弃上清。

4.加入1.5ml洗液A，涡旋重悬磁珠，转移到2.0ml离心管，置于磁力吸附架上。

5.吸附磁珠，弃上清；短暂离心，再次吸弃上清。

6.加入100ul洗脱液，涡旋混匀，80℃ 1000rpm震荡10min。

7.短暂离心，置于磁力吸附架，收集洗脱液至新的2.0ml离心管。

（4℃可保存24h，不可冷冻）
8.加入150ul亚硫酸盐溶液、25ul保护液，涡旋混匀，80℃静置孵育40-50min。

9.降温震荡仪至23℃；离心管中加入1000ul洗液A，20ul磁珠，涡旋混匀，23℃1000rpm震荡40-50min。

10.短暂离心，置于磁力吸附架，弃上清。

11.加入800ul洗液A，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；
12.加入800ul洗液B，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；
13.加入400ul洗液B，涡旋洗涤磁珠，离心吸附弃上清；
14.再次离心吸附弃上清x2。

15.室温干燥10min。

16.加入60ul洗脱液，涡旋混匀，23℃1000rpm震荡10 min。

17.短暂离心，吸附。

PCR反应液：
每个反应配置32ulPCR反应液+1.6ulTaq酶。