植物组织培养基配制

植物组织培养实验一：培养基的配制学院：风景园林院学号：131001226 姓名：张晟菓一、实验目的1. 掌握植物组织培养实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。

2. 掌握培养基的配置方法。

3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理鉴于微生物种类及代谢类型的多样性，用于培养微生物的培养基的种类也很多。

培养基的配置的程序有器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，以及培养基的无菌检查等。

此次配制400mL MS培养基。

三、实验材料1.药品：激素：BA 1.0L（200mg/L）NAA 0.2L（200mg/L）母液：MS1（大量元素）20mL——浓缩20倍MS2（微量元素）2mL——浓缩200倍MS3（铁盐）2mL——浓缩200倍；MS4（维生素和氨基酸）2mL——浓缩200倍琼脂：2.2g蔗糖：12g（3%）无菌水2.玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、玻璃棒、培养皿3.仪器设备：电子天平4.其他物品：药匙、滤纸、称量纸、pH计、记号笔、棉花等四、实验步骤1.玻璃器皿清洗：将试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水和蒸馏水冲净。

移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。

晾干后备用。

2.量取母液：MS1（20mL），MS2（2mL），MS3（2mL），MS4（2mL）；加激素：BA（1.0mL），NAA（0.2mL）；加蔗糖：12g。

3.加水定容至400mL。

4.搅匀后用pH计、烧碱溶液及硫酸溶液调pH值至5.8。

5.加琼脂2.2g，用电磁炉加热溶解并搅拌5-6分钟，冒泡即可拿出。

6.趁热分装，包扎，贴标签。

五、实验结果培养基配置完成。

植物组织培养MS培养基配方（一）母液配制与保存配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。

为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。

母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。

基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍）1大量元素配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。

2微量元素母液在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。

3铁盐母液由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。

配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。

先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。

4有机物母液按表4中的量分别称取各种有机物，分别溶解后，用蒸馏水或去离子水定容于1000mL，放入细口瓶配成1 mg/ml 。

各100 ml。

6-苄基腺嘌呤（6-BA）用0.5 N的HCl加热溶解。

萘乙酸（NAA）用少量无水乙醇溶解，再加蒸馏水。

植物组织培养基母液的配制
植物组织培养基是培养植物细胞、组织和器官的基础培养介质。

配制
植物组织培养基的母液可以按照以下步骤进行：
1. 准备所需的化学品和试剂，包括无机盐、有机添加剂、维生素和其
他辅助物质。

这些化学品可以根据不同的植物种类和培养目的进行选择。

2. 称取所需的化学品，并依次加入无菌蒸馏水中。

搅拌溶解，直到所
有化学品完全溶解。

3. 调节pH值。

使用pH计测量溶液的pH值，如果需要，可以使用酸
或碱来调节pH值，直到达到所需的pH范围。

4. 向溶液中添加琼脂糖或琼脂糖替代物，作为凝胶剂。

溶解并搅拌直
到完全溶解。

5. 过滤溶液，以去除悬浮固体和杂质。

使用无菌滤纸或滤器进行过滤。

6. 灭菌。

将过滤后的溶液装入无菌烧瓶或容器中，使用高压灭菌器或
自动压力锅进行灭菌，通常在121℃高压下灭菌20-30分钟。

7. 灭菌后，将培养基倒入无菌培养瓶中，密封并保存在冰箱中或低温
环境中。

以上是植物组织培养基母液的配制步骤，具体的操作和配方可以根据
不同的要求和实验目的进行调整。

培养基的配制植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。

MS培养基的配制包括以下步骤。

培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ)KI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇20 000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O 分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

植物组培培养基及其配制培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。

因此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。

一、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。

1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。

磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。

钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。

而钙、钠、镁的需要则较少。

培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。

微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。

培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA(螯合剂)的混合。

2.碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。

因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。

培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。

蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。

3.维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。

培养基中的维生素属于B 族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。

4.有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。

最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。

另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。

5.生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。

如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

(2)细胞分裂素。

如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。

(3)赤霉素。

组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。

二、常用培养基配方及其特点1.常用培养基配方组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。

植物组织培养MS培养基配方MS培养基主要包括两部分：无机盐和有机物。

无机盐部分的配方如下：1.氮源：氮源通常由硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾（KNO3）和硫酸铵（（NH4）2SO4）组成。

氮源的浓度通常为20-30mM。

2.磷酸盐：磷酸盐通常由二氢二钠磷酸盐（NaH2PO4）组成，浓度为10mM。

3.钠盐：MS培养基中含有钠盐，通常由硝酸钠（NaNO3）和硝酸钾（KNO3）组成。

钙盐的浓度为2.0mM，钾盐的浓度为1.0mM。

4.钠盐：MS培养基中含有钠盐，通常由硝酸钠（NaNO3）和硝酸钾（KNO3）组成。

钙盐的浓度为2.0mM，钾盐的浓度为1.0mM。

5.硫酸镁：硫酸镁（MgSO4）的浓度为1.0mM。

6.磷酸铵铁：磷酸铵铁（FeSO4·(NH4)2SO4）的浓度为27.8μM。

7.各种微量元素：包括锌、铜、锰、硼、钼、钴和镍等微量元素。

这些微量元素的浓度通常在微摩尔（μM）级别。

有机物部分的配方如下：1.蔗糖：蔗糖是植物培养基中最常用的碳源，浓度通常为30g/L。

2. 维生素：通常使用的维生素有二硝基地巴泼甲素（2,4-D）和吲哚-3-乙酸（IAA）。

它们的浓度通常在0.1-2.0 mg/L之间。

3. 激素：常用的激素包括植物生长素（BA）和乙烯利（2,4-D）。

它们的浓度通常在1.0-10.0 mg/L之间。

4.混合物：还可以加入一些有机物混合物，如胆固醇、烟酸和核酸酸等。

值得注意的是，这只是MS培养基的一个基本配方，根据具体的研究目的和植物种类的不同，还可以对该配方进行一些调整和优化。

总结起来，MS培养基是一种常用的植物组织培养基，主要用于植物生长和增殖。

其配方包括无机盐和有机物两部分，无机盐包括氮源、磷酸盐、钙盐、镁盐、磷酸铵铁和微量元素等；有机物包括蔗糖、维生素和激素等。

通过适当调整这些配方的浓度和比例，可以实现不同植物的生长和增殖需求。

备注：培养基和激素母液配制方法（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。

（2）200×Fe盐溶液称取1.39g FeSO4•7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2•EDTA溶于热水（B液）；将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解；加水定容至100ml，4℃保存。

如果出现沉淀，需要重新配置。

（4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200m l，4℃保存。

（5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。

使用前加入灭菌培养基。

（7） 0.5mg/ml KT和ABT的配法称取50mg kenetin或ABT生根粉，先用少量1N KOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。

（8）其他附加物的溶解及配制A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。

4℃保存。

B、称取1g L-半胱氨酸(Cys) 溶于2mL 0.2mol/L或10%的NaOH溶液, 用蒸馏水稀释定容至10mL，现用配制。

4℃保存。

C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

4℃保存。

D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。

植物组织培养MS培养基配方（一）母液配制与保存配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。

为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。

母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。

基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍）1大量元素配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。

表1大量元素母液（配1L20倍的母液）2微量元素母液在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。

由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。

配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。

混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中4、有机物母液按表4中的量分别称取各种有机物，分别溶解后，用蒸馏水或去离子水定容于1000mL，放入细口瓶中备用，贴好标签于4℃冰箱中低温保存。