dNTPmixture溶液10mM-生工生物工程

六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验五 RNA的制备和质量鉴定
一、实验目的
掌握利用试剂盒提取植物细胞总RNA的方法。
二、实验原理
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µ L）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验四 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织 中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖 凝胶电泳检测。
二、实验原理
核酸是生物体的重要成分，在细胞中常与蛋白质结合在一 起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。 在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大， RNA核蛋白的溶解度小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可 利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品 中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。

一.常用贮液与溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。

10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。

不要涡旋混合。

加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。

或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。

8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。

1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。

3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。

或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。

1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。

1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。

b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。

**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。

Control引物退火温度为55℃。

*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。

**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。

Control引物延伸时间45s。

c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。

使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。

可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达曹菁菁;张晓梅;鲁维飞;郭豫杰;韩立强;王林枫;杨国宇【摘要】本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布.基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律.克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5％、69.0％、77.3％、70.4％;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5％、79.4％、89.4％、88.2％;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)009【总页数】5页(P75-79)【关键词】猪;硫辛酸合成酶基因;克隆;组织表达【作者】曹菁菁;张晓梅;鲁维飞;郭豫杰;韩立强;王林枫;杨国宇【作者单位】河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q786硫辛酸最初是在酵母、菠菜和肉类中发现的生物因子，其主要生物活性是抗氧化，是已发现的唯一具备脂水兼容性的抗氧化剂(Gokhan等，2008;Smith 等，2004)，学名为 6，8－二硫辛酸(6，8－thioctic acid)，其分子内含有二硫键，是丙酮酸脱氢酶、2－酮戊二酸脱氢酶、支链ɑ酮酸脱氢酶、3羟基丁酮酸脱氢酶、甘氨酸裂解系统等(Cronan等，2005)代谢中关键酶的辅因子。

Pபைடு நூலகம்0113 | dNTP Mixture (2.5 mM each) 超纯
Catalog No：PH0113 Size： 0.5mL | 5×0.5mL | 1mL Store at -20℃
dNTP Mixture 可以用于以下分子生物学反应：PCR、实时 PCR、高保真 PCR、长片段 PCR、cDNA 合成、RT-PCR、DNA 标记和 DNA 测序等。 本产品分为 2.5 mM each、10 mM each 两种浓度。均为 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的等摩尔混合物。dNTP 纯度均达到 99％以上（HPLC 纯度），不含 DNase 和 RNase，适合多种聚合酶的扩增反应。 用于 PCR 的标准使用量： 2.5mM dNTP 是 50 μl 反应体系用 4 μl（终浓度为各 200 μM）。 10mM dNTP 是 50 μl 反应体系用 1 μl（终浓度为各 200 μM）。
PCR 鉴定
①以λDNA 为模板进行 PCR 反应，能很好扩增 500bp~20kb 产物。 ②以 HL60 细胞由来的 RNA 为模板，对 TFR 领域进行 RT-PCR 反应，能很好扩增 4.4kb 片段。

实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。

【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。

（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。

（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。

（4）4℃离心，12,000g×15min。

（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。

（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。

（7）4℃离心，12,000g×10min。

（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。

（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。

一70℃保存备用。

二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。

组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。

例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。

这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。

在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。

另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。

DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。

中国农业科技导报，2021,23(2)：73-80Journal of Agricultural Science and Technology高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性刘璐1,名晓东1,张晓艳2,郝俊杰2,付丽平1,王乾坤1,吕鑫1,陈旺1,刘全兰1*(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266042；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛266100)摘要:为了分析蚕豆种子内生细菌的多样性，采用1llumina MiSeq高通量测序技术，从日本大白皮(S18P23.1、S18P23.2)和启豆2号(S18P24.1.S18P24.2)的种子获得16S RNA V3~V4区有效序列133855条。

将高于97%相似度的序列划分为一个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),优化后得到1598个OTUs。

内生细菌种群分析结果表明，拟杆菌门(Bacteroidetes,丰度为30%-33%)、变形菌门(Proteobacteria,23%~25%)、厚壁菌门(Firmicutes,23%-25%)和放线菌门(Actinobacteria,5%~7%)为两个蚕豆品种共有的优势菌门，但属水平的优势菌群在供试蚕豆种子中均有差异。

这些结果表明，蚕豆种子具有 丰富的内生细菌资源，含有多种具有益功能性状的细菌类群，值得进一步跟踪研究这些益生菌在蚕豆种植到土壤后的变化规律;启豆2号种子中益生菌的种类和丰度高于日本大白皮，值得进一步分离和研究这些益生菌的益生或促生特性，筛选获得在食品和生物肥料等领域有应用潜力的菌株。

关键词：高通量测序;蚕豆；内生细菌;多样性doi:10.13304/j.nykjdb.2019.0860中图分类号:S664.143.6文献标识码：A文章编号：1008-0864(2021)02-0073-08Diversity of Endophytic Bacteria in Faba BeanSeeds by High-Throughput SequencingL1U Lu1,M1NG Xiaodong1,ZHANG Xiaoyan2,HAO Junjie2,FU Liping1,WANG Qiankun1,LYU Xin1,CHEN Wang1,L1U Quanlan1*(1.College of Marine Science and Biological Engineering,Qingdao Lniversity of Science&Technology,ShandongQingdao266042,China； 2.Qingdao Academy of Agricultural Sciences,Shandong Qingdao266100,China)Abstract：1n order to analyze the species abundance and diversity of endophytic bacteria in faba bean seeds,taking Japan^s white skin(S18P23.1,S18P23.2)and Qidou2(S18P24.1,S18P24.2)as materials,133855effective sequences were obtained by1llumina MiSeq high-throughput sequencing of the16S rRNA V3~V4region.The sequence with similarity above97%was divided into one operational taxonomy unit(OTU),so1598OTUs were obtained after optimization.The results showed that majority of the endophytic bacteria belonged to Bacteroidetes (30%~33%),Proteobacteria(23%~25%),Firmicutes(23%~25%),and Actinobacteria(5%~7%),which were therefore the dominant bacterial Phyla in these four faba bean seeds.The dominant genera at genus level in these endophytic bacteria sequenced from faba bean seeds were different.Above results indicated faba bean seeds were rich in endophytic bacteria,the abundance of probiotics in one faba bean variety(Qidou2)were higher than another variety(Japan's white skin).Key words:high-throughput sequencing；faba bean seed；endophytic bacterium；diversity蚕豆(Vicia faba L.)属豆科蝶形花亚科野豌豆族野豌豆属，起源于亚洲西南部和非洲北部[1-2]o蚕豆营养丰富，含有蛋白质、糖类、脂质、膳食纤维以及钙、铁、胡萝卜素、维生素等;蚕豆中含有人体中不能合成的8种必需氨基酸，其中赖氨酸含量较高[3]o蚕豆还有利湿消肿、清热健收稿日期：2019-10-17；接受日期：2019-12-18基金项目：国家食用豆产业技术体系项目(CARS-08)；青岛市农业科学研究院院长基金项目。

SSR 分析实验流程1. PCR扩增采用3 条引物来进行PCR 扩增。

第1 条引物是SSR正向引物的5′端和M13（-21）的序列相连组成带M13尾巴序列（5′- TGT AAA ACG ACG GCC AGT -3′）的引物（例如：GCPM_1037的正向引物序列为5′- ATG AAA TTC GCA AAG TCA GT -3′，那么GCPM_1037的正向引物为5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATG AAA TTC GCA AAGTCA GT -3′），第2 条引物为正常的SSR反向引物，第3 条引物是5′端标有CY5荧光标记的M13 尾巴引物。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

反应体系成分及用量见表1，反应体系中使用一管便携式PCR MasterMix（天根生化科技有限公司），其主要成分的含量为Taq酶（0.1 U/μL），dNTP Mixture (500 μM)，MgCl2 (3 mM)，KCl(100 mM)，Tris-HCl（20 mM）。

表1 PCR反应体系(20μL)Table2-2 Concentration of reaction compositions (20μL)成分Composition 用量（μL）Dosage2×Taq PCR MasterMix 10.00无菌去离子水超纯水 Sterile ddH2O 8.28M13+引物F (10μM) M13+Primer F 0.04引物R (10μM) Primer R 0.32M13荧光引物M13 Fluorescence Primer 0.32DNA (20 ng μL-1) 1.00 注：每次反应均以无菌去离子水替代模板 DNA 作为对照，检测反应成分中有无污染。

Note:Using sterile ddH2O replace template DNA as control in every reaction to check whether reactioncomposition was contaminatedPCR反应采用如下循环参数：预变性：95℃ 5 min变性：95℃30s退火：最佳退火温度30s 30个循环延伸：72℃45s变性：95℃30s退火：53℃30s 8个循环延伸：72℃45s抚平：72℃10min2 CEQ/GeXP电泳分离将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取20 uL加入上样板中，再加入1 uL稀释 10倍的PCR产物。

【 注意 】
本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。此外，对于本产品的 有害性调查还不十分全面，因此，在使用过程中，请严格遵守实验室作业的一般 注意事项，适当使用保护用品，安全操作。
组分中的5×RT Buffer在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品 质。此时，请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。
G3PDH mRNA
Primer F 559
intron
Size(bases)
1634
1237
1110 Primer R
90 129 90 92 k-193 104
图 2. Control Primer F，R 的 location
[Positive Control RNA]
本 试 剂 盒 作 为 Positive Control 用 RNA ， 添 附 有 Human G3PDH (Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)遗传基因的 in vitro 转录产物。 （在 3’末端添加了 22mer 的 Poly（A）tail）（请参照图 3）。
G3PDH 基因是在各种哺乳类组织上表达的“管家基因”。其 mRNA 表达水 平不受一部分细胞因子和含有 Tumor-promoting Phorbol Esters 等的诱导物质 的影响，并且，在几乎所有组织上都是恒定的。因此，使用从各种组织中抽提出 来的 RNA 样品的时候，可以作为最合适的对照而使用。
cDNA
5’
Synthesis of the Second Strand cDN A
DN A Polym erase
Am plification
PCR
图1. RT-PCR法的原理

硕士研究生《昆虫生理生化实验技术》课程代码：3012100018开课单位：植物科技学院责任教师：牛长缨研究生：学号：实验一昆虫血淋巴中蛋白质的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）一、实验目的掌握凝胶电泳基本方法，并测定各种昆虫，以及同一种昆虫不同发育阶段的血淋巴的蛋白谱。

二、实验原理昆虫的各种组织，均含有多种蛋白质和各种酶类。

在血淋巴中经分离和纯化后已鉴定的蛋白质有：卵黄原蛋白，脂蛋白，贮存蛋白，滞育蛋白，抗菌蛋白，抗冷蛋白等。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质和酶类，可以得到满意的蛋白谱和酶谱，通常能分离到20－30条带。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸胺）与加速剂（四甲基乙二胺）的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛的作用，因此常用它作为电泳支持物。

对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。

此外，凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH和凝胶孔径梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带。

从而提高了分离效果。

三、实验材料和仪器供试昆虫：菜青虫试剂及配制：1．Acr:丙烯酰胺Bis:甲叉双丙烯酰胺TEMED:四甲基乙二胺AP:过硫酸胺Tris:三羟甲基氨基甲烷A：1mol/L HCl 48ml；Tris 36.3g；加水至100ml，pH 8.9；贮存于棕色瓶内，4℃保存。

B：Acr 30g；Bis 0.8g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存。

C：10%AP 1gAP加9ml水，最好现用现配，贮存于棕色瓶内。

D：1mol/L HCl 48ml；Tris5.98g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存.E：Tris6g；甘氨酸28.8g；加水至1000ml，pH8.3(电极缓冲液)2．1％溴酚蓝指示剂，苯硫脲3．染色液：考马斯亮蓝R250 1.25g; 水227ml; 冰乙酸46ml; 甲醇227ml; 共500ml,溶解后过滤。

实验一大肠杆菌感受态的制备，质粒抽提，酶切，电泳大肠杆菌感受态的制备(以50ml菌为例)试剂：0.1M CaCl2步骤：（50ml菌）1．划平板活化菌种DH5α或者Top10，挑单菌落37°C摇小管2ml过夜，1:100放大（0.5ml菌 50 ml菌）,待OD600=0.3-0.4（约需2h）,将装菌的瓶子置于冰上10-30min。

同时冰上预冷0.1M CaCl2，冷冻离心机4°C预冷。

2．3000rpm离心10分钟,迅速弃尽上清。

3．用10ml CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。

置于冰上30分钟。

4．3000rpm离心10分钟,迅速弃尽上清。

5．用2ml 0.1M CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。

每管200μl，管子需预冷。

6．置于冰上2hr-48hr内用于热击转化。

（热击转化：冰上30min, 42°C 90sec, 冰上10min。

加入200ul LB 37°C复苏1hr，涂板，培养。

）（不做）小量制备质粒DNA方法1．取1.5ml菌液于1.5ml离心管中。

（也可以再加入1.5ml菌液，获得更浓的质粒）2．13200rpm离心30秒。

3．弃上清，加入Solution I 100μl, 剧烈震荡致完全溶解菌的沉淀。

4．加入Solution II 200μl, 盖紧管口，迅速颠倒离心管5次混匀。

室温5min。

5．加入Solution III 150μl, 盖紧管口，迅速颠倒离心管5次混匀，置于冰上3-5min。

6．13200rpm离心5min，将上清移入另一个1.5ml离心管中。

7．加入酚-氯仿400μl, 剧烈震荡，13200rpm离心5min，将上清移入另一个1.5ml 离心管中。

8．加入1000μl无水乙醇，混匀。

9．13200rpm离心5min。

弃上清，用70%乙醇洗沉淀一次，13200rpm离心5min。

10．弃上清，吹干，加入60 μl 水或TE（含20ug/ml RNaseA）溶解。

分子生物学实验常用试剂配制(1) 0.01M PBS缓冲液：一袋粉制PBS缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。

0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

(2) 0.01M枸橼酸盐缓冲液：一袋粉制枸橼酸盐缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。

0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

(3)1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl 调至pH8.0,加水至1000ml。

(4) 1‰DEPC水：1mlDEPC加入1000ml新鲜三蒸水中，剧烈震荡20分钟使充分混匀，37o C至少放置2h或过夜，HIRAYAMA HV-50高压灭菌器高温高压30分钟降解DEPC，4℃保存。

(5) 1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.2g置烧杯中，加入20ml的1×TAE缓冲液，封闭锥形瓶口，放入微波炉内加热，不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，待琼脂糖全部熔化后取出摇匀，冷却至60℃左右，加入10mg/ml溴化乙锭（EB）1µl，EB的终浓度为0.5μg/ ml，充分混匀。

将温热的凝胶倒入已经放好梳子的凝胶槽中，厚度约为3-5mm，注意不要有气泡，将凝胶放置室温待其自然凝固。

凝固后从胶槽中轻轻取出梳子。

(6)0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。

(7) 50×TAE缓冲液：Tris碱242g，17.4mol/L冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA (PH8.0)100ml加蒸馏水至1000ml。

分子生物学实验常用实验试剂配制（一）溶液I（TEG缓冲液）：使用浓度为（25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA, 50mmol/L葡萄糖，pH8.0）。

1、先称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL，配制成pH8.0 Tris-HCl 缓冲液100mL；（1mol/L HCl溶液：即取8.6毫升36%的盐酸加水、搅拌、定容至100毫升即可；或37% 的HCL相当于约12mol/L，即稀释12倍）2、再加入0.37g EDTA·Na2·2H2O和[0.99g（Glucose.H2O，分子量198.17）或0.9g Glucose，分子量180.1572]葡萄糖，灭菌后4℃保存备用。

（二）溶液II （碱裂解液）：使用浓度为（0.2 mmol/L NaOH, 1% SDS）。

配制母液：0.4M NaOH 称1.6g NaOH 定溶于100 mL蒸馏水；2% SDS 称2 g定溶于100 mL蒸馏水。

常温保存，使用时等体积混合。

（三）溶液III（乙酸钾溶液）：使用浓度（pH8.0, [K +]=3mol/L, [Ac -]=5mol/L）。

1、先配制60mL 5 mol/L KAc；称g KAc 定容至60 mL。

2、再加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸馏水。

4℃保存备用。

（四）LB培养基配制：LB（液体）：称取0.5g 氯化钠，0.5g腋蛋白胨，0.25g酵母提取粉，加水50ml。

LB（固体）：称取0.5g 氯化钠，0.5g腋蛋白胨，0.25g酵母提取粉，0.75g琼脂粉，加水50ml。

（五）琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶的配制是分子实验室比较基本的操作，大体流程如下：称量、熔胶、倒胶、拔梳。

1.称量：我们通常所说的0.8%、1%的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量（g）比所加的TBE缓冲液的体积（mL）即胶的浓度。

缓冲液的体积根据胶板的大小而定。

生物实验常用溶液的配制常用溶液的配制贮存液配方solution Ingredients MW Dose Note 10M/L NaOH NaOH 40.00 4g 搅拌溶解T·H2O 10ml1M/L Tris·ClTris(HOCH2)3CNH2121.14 12.11g 微波炉加热溶解，冷却后浓盐酸调pH至8.0，加三蒸水定容至100ml浓盐酸约5ml T·H2O 80ml0.1M/L EDTA EDTA（C10H6N2O8）292.25 2.92g 微波炉加热溶解，冷却后10M/L NaOH调pH至8.0，加三蒸水定容至100mlT·H2O 80mlRNA酶A母液10mg/ml RNA酶A 100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。

冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/L NaCl工作液配方solution Ingredients materials Dose Note溶液Ⅰ50mmol/L Glucose Glucose (C6H12O6?H2O)198.170.99g 搅拌溶解后定容至100ml，高压灭菌4℃保存25mmol/L Tris·Cl 1M/L Tris·Cl 2.5ml10mmol/L EDTA 0.1M/L EDTA 10ml T·H2O 50ml溶液Ⅱ1％SDS SDS 1g 分开常温保存，用时临配。

1ml溶液Ⅱ：1%SDS 980μl+10mol/L NaOH20μlT·H2O 100ml0.2mol/L NaOH溶液Ⅲ5 mol/L KAc CH3COOKMW:98.1460ml 定容至100ml, 并高压灭菌。

溶液终浓度：K+3mol/L,Acˉ5mol/L。

冰醋酸11.5mlT·H2O 28.5mlLB液体培养基(Luria-Bertani) 蛋白胨(Tryptone) 10 g 溶于800ml去离子水中NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟酵母提取物(Yeastextract)5 gNaCl 10 gLB固体培养基LB液体培养基100ml 高压灭菌后成凝胶状，用时微波炉加热至100℃以上溶解，加入5mg/mlAmpcillin 1ml（终浓度为50ug/ml），摇匀后倒入培养皿中，冷却凝固即可涂板琼脂粉 1.2g氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)工作液Ampcillin（规格0.48g,80万U）1支5mg/ml贮存液（终浓度为50ug/ml）,-20℃保存备用三蒸水100ml溶菌酶溶液(10mg/ml) 溶菌酶溶液0.1g 分装成1ml/小份，保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃10mmol/LTris·Cl(pH8.0)10ml3mol/l NaAc (pH5.2) NaAc·3H2O 40.81g 冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱三蒸水50mlTE缓冲液10mmo/LTris·Cl，1M/LTris·Cl(pH8.0) 0.5ml 加水定容至50ml，高压灭菌后EP管分装备用1mmol/L EDTA 0.1M/LEDTA(pH8.0) 0.5mlT·H2O 49mlTBE 缓冲液(5×)Tris 54g 定容至1000ml硼酸27.5g，0.5M/LEDTA(pH8.0) 20m l上样缓冲液(6×)0.25% 溴酚蓝溴酚蓝0.25g 定容至100ml40% (w/v)蔗糖水溶液蔗糖40g三蒸水80ml0.7％琼脂糖凝胶琼脂糖粉0.14g 微波炉加热溶解。

生物化学实验常用试剂的配制方法使用Ctrl+F 组合键可以快速的查找所需的配方。

1、0.5mol/L氢氧化钠溶液组份浓度0.5mol/L ；配制量2L配置方法1.准确称取氢氧化钠40g。

2.用去离子水溶解并稀释至2L。

2、0.5mol/L盐酸溶液组份浓度0.5mol/L ；配制量2L配置方法1.准确量取盐酸83.4mL。

2.用去离子水稀释至2L。

3、含0.5mol/L氯化钠的0.5mol/L氢氧化钠溶液组份浓度0.5mol/L氯化钠、0.5mol/L氢氧化钠；配制量1L配置方法1.准确量取氯化钠29.3g。

2.准确量取氢氧化钠20g。

3.用去离子水稀释至1L。

注意：此溶液供回收纤维素时使用。

4、0.2％葡萄糖标准溶液组份浓度0.2％；配制量1L配置方法1.称取葡萄糖2.5g置于称量瓶中，在70℃干燥2小时。

2.干燥器中冷却至室温，重复干燥，冷却至恒重。

3.准确称取葡萄糖2.000g。

4.用去离子水溶解并定容至1L 5.于4℃保存。

5、250μg/mL牛血清白蛋白标准液组份浓度250μg/mL ；配制量2L配置方法1.准确称取250mg标准牛血清白蛋白。

2.用0.03mol/LpH7.8的磷酸缓冲液溶解并定容至1L。

3.4℃保存。

6、Folin试剂甲配置方法1.称取10g氢氧化钠溶于400mL去离子水中，加入50g无水碳酸钠，溶解，待用。

2.称取0.5g 酒石酸钾钠，溶于80mL去离子水中，加入0.25g硫酸铜?5水，溶解。

3.将1：2：去离子水按20：4：1的比例混合即可。

4. 4℃保存，可用一周。

7、Folin试剂乙配置方法：1.在500mL的磨口回流装置内加入钨酸钠?2水25.0359g，钼酸钠?2水6.2526g，去离子水175mL，85％磷酸12.5mL，浓盐酸25mL，充分混合。

2.回流10小时，再加硫酸锂37.5g，去离子水12.5mL及数滴溴。

3.然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到250mL。