猪肺表面活性物质操作流程

杀猪流程：（6月21日晚上11点30开始杀猪）实验动物：PCV2、PRRSV抗原抗体双阴性断奶仔猪3头；实验器材：解剖刀柄（1）、解剖刀片（3）、大剪刀（1）、塑胶手套（1盒）、大搪瓷盘（1）、酒精棉球（2瓶）；消毒止血钳（3）、灭菌大培养皿（3）实验过程：三点半点到实验室准备实验用具（细胞房中器材）。

八点开始，前腔动脉放血处死仔猪，将前肢、后肢与躯干连接的皮肤和肌肉分离，沿腹中线将皮肤划开，小心分离脾脏；向上划开胸部皮肤，将皮肤和肌肉沿肋骨分离到肋骨末端，用手轻轻拍打一侧肋骨，使肺脏向背心侧脱落，小心剪开最后肋骨（切勿损伤到肺），再次拍打，使肺脏彻底脱离，用剪刀向上剪开肋骨或用解剖刀划开，在颈部用解剖刀小心分离气管，分离开后用消毒的止血钳完全夹住气管，在其上方5mm处划开气管（防止病原进入），渐渐轻轻分离肺脏与背部脊柱相连的部位。

划断食管、韧带等阻碍物，将肺脏与心脏一起取下，放入灭菌培养皿中，用酒精棉球擦拭肺脏表面，同时将血管中血液尽可能排放干净，用培养皿承装进入细胞房，准备下一步操作；该过程大概需要1.5小时；（三头猪）冲肺收集肺泡巨噬细胞步骤：（6月22日晚上九点开始进行）实验准备过程及器材：五点到实验室，将细胞房、超净台打开紫外灯光照射，并事先清理超净台台面，将应用实验器材全部移到细胞房内紫外消毒。

分别有：超净台内：消毒剪刀（1）、10ml玻璃刻度吸管（3）、灭菌纱布（1盒）、三角瓶（3）、打火机（1）、大吸头（1洗耳球）、小胶头滴管（2）、5ml刻度吸管（1管）、巴士吸管（1管）、2mlEP管（2个）、垃圾篓（1）、酒精棉球（1）、1ml枪及枪头（1）、200μl枪及枪头（1）、玻璃纸（高压过）、水浴锅内：DPBS（5瓶）、PBS（2瓶）、红细胞裂解液（1瓶）桌面上：泡有多聚赖氨酸的盖玻片（24片）（配套消毒小镊子）、六孔板（6块）、50ml塑料离心管（30个）、95%酒精（2瓶）、75%酒精（两瓶）、烧杯内放无水乙醇的细胞计数板（两块）、酒精喷壶（2）、乳胶手套（2）、垃圾袋（10只）、口罩（4只）、塑料手套（1）、冰箱内：1640营养液（加双抗和胎牛血清）（2瓶）、胰酶（5管分装好的）、台盼蓝染液（0.4%）、病毒应在晚上12点用单蒸水冲开（注意密封）实验过程：1、完整收取肺脏，止血钳夹持住气管（密闭），酒精擦拭干净放血完全后进入细胞房；2、用止血钳夹住肺气管侧壁，剪刀剪开一个端口，同时用止血钳夹住端口稍下2ml，用10ml玻璃刻度吸管向肺脏灌DPBS，150ml，轻轻揉捏5min，使肺泡充分打开；（千万注意不要多灌，500ml一只肺是最多的）；3、将灌洗液倾入瓶口覆有无菌双层纱布的三角瓶中，注意事先用一块纱布包住血管口，严防血液灌入三角瓶；（★）4、反复两次到三次，重复步骤三，尽量使肺泡巨噬细胞冲出；5、将灌洗液分装到50ml离心管中，1500rpm，10分钟，4度离心；6、DPBS洗涤细胞，重复步骤5；7、将数个管内细胞重悬到2-4管内，重复步骤6；8、如果上清液中红色明显（红细胞较多），则加红细胞裂解液，按红细胞裂解液：DPBS=3:2的比例处理，在37℃恒温箱中作用20-30分钟，再次离心；（尽量不要用红细胞裂解液，因为损伤实在太大。

新生儿呼吸窘迫综合征诊疗指南【NRDS诊断标准】(一).具有发病的高危因素：母孕期患有糖尿病、胆汁淤积、宫内感染、早产、胎膜早破超过24小时、宫内窘迫、剖宫产、产时窒息等。

(二).具有NRDS临床症状及体征症状：生后6小时内发生进行性加重的呼吸急促(>60/分)。

体征：(1)、发绀、鼻扇、吸气性三凹征和明显的呼气呻吟；(2)、严重时呼吸浅快，呼吸节律不整、呼吸暂停及四肢松弛；(3)、听诊可闻及双肺呼吸音减低。

(三)具有典型的胸部X线检查特征胸片特征性改变是判断NRDS严重程度的重要指标之一，但不是早期诊断的必须条件之一。

NRDS胸片特征性改变包括：Ⅰ级：双肺透光度降低，呈毛玻璃样改变。

Ⅱ级：双肺透光度降低，见明显支气管充气征，心影及肋膈角清楚。

Ⅲ级：双肺透光度明显降低，见明显支气管充气征，心影及肋膈角模糊。

Ⅳ级：全肺透光度严重降低，呈“白肺”样改变。

(四)、辅助检查1、如果可能，应在生后1小时内抽取胃液做泡沫震荡实验。

2、在使用肺表面活性物质(PS)治疗前及治疗后检测血气分析3、尽快完成胸片检查，并在使用PS后6-12小时进行复查，必要时增加复查次数。

4、严重病例应当完善心脏彩超检查，以明确有无肺动脉高压及动脉导管未必。

5、积极完善血糖、乳酸、电解质、肝肾功等检测，了解患儿机体内环境状态。

【NRDS治疗】(一)、PS的应用1、胎龄<28周的早产儿都应接受表面活性物质预防性治疗(生后15 min内)。

2、如果新生儿在产房内需接受气管插管，或母亲未接受产前皮质激素治疗，则对胎龄>28周~<30周的新生儿应预防性使用表面活性物质对已患RDS或RDS高危的新生儿应尽早给予PS，以降低死亡率及肺气漏。

3.在有RDS进展的证据时，如持续需氧、需要机械通气或CPAP 6 cm H2O需氧浓度>50% ，应给与第二或第三剂表面活性物质。

4、对需从CPAP改为机械通气治疗的RDS患儿，应给与第二剂PS。

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。

离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。

弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。

2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

猪肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒说明书Pig lung surface active substances related protein A (SP - A) ELISA kit instructions上海古朵生物科技有限公司猪肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒说明书高灵敏度ELISA试剂盒与常规ELISA试剂盒的区别高灵敏度( High Sensitivity ELISA)在传统比色法的基础上对获得的信号进行放大，从而实现对低表达水平蛋白的检测。

传统夹心法ELISA仅利用生物素/链亲和素-HRP系统对信号进行扩增放大，而高灵敏度ELISA则使用酪胺系统再次对信号进行扩增放大。

生物素化酪胺(信号放大试剂)在HRP存在时，会转变为极富反应活性的短寿命中间体。

这些中间体可以与周围蛋白共价结合而形成酪胺化复合物,因而提供了多个生物素结合位点,可与更多链亲和素-HRP分子结合。

●参与反应的生物素化酪胺总量与微孔中HRP的量成比例●经孵育后，未结合的生物素化酪胺通过洗涤去除●洗涤去除未反应的生物素化酪胺后，加入streptavidin-HRP (信号扩增试剂II) 与复合物的多个生物素位点结合。

此放大步骤可有效增加最终参与催化TMB底物的HRP分子数量肺表面活性物质相关蛋白A样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

前体脂质体型猪肺表面活性物质对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的治疗作用【摘要】目的：观察前体脂质体型猪肺表面活性物质（PPPS）对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的治疗作用。

方法：将PPPS水化后，经气管滴入治疗整肺灌洗型成年兔呼吸窘迫模型，观察兔的生命体征、血气、动态肺顺应性等指标的变化。

结果：整肺灌洗后模型兔的血气pH、PaO2急剧下降，PaCO2 轻度上升，心率明显减慢而呼吸频率增加，SBP和DBP均明显下降；支气管肺泡灌洗液中PS含量明显下降；病理检查提示出现肺出血、肺不张、肺泡萎缩、透明膜形成等病变，符合Ⅰ型重症呼吸衰竭临床诊断标准。

经气管滴入PPPS后，可以使RDS模型兔的各项指标（pH、PaO2、PaCO2、HR、BR、SBP、DBP）明显改善，肺部的病理改变也明显减轻。

统计学分析结果提示，治疗组和对照组pH（F=4.572，P=0.046）、PaO2(F=557.586，P=0.000)、PaCO2（F=96.798，P=0.000）、TV（F=117.851，P=0.000）、Cydn（F=276.996，P=0.000）、HR（F=34.975，P=0.000）、BR（F=28.167，P=0.000）、SBP（F=124.751，P=0.000）和DBP（F=108.672，P=0.000）比较差异均有统计学意义；在治疗组中，各个时间点的 pH、PaO2 、PaCO2、TV、Cydn、HR、BR、SBP和DBP比较差异均有统计学意义。

结论：PPPS对实验性PS缺乏和肺损伤造成的呼吸窘迫有显著的治疗作用。

【关键词】肺表面活性物质；前体脂质体；呼吸窘迫综合症［Abstract］Objective:To observe adult rabbits with acute respiratory distress syndrome (ARDS) treated by the proliposomes of pig pulmonary surfactant (PPPS). Methods:PPPS was instilled intratracheally. The control group was given saline only.Results:The following phenomena were observed:the Ph， PaO2 of the model rabbits descended sharply， the PaCO2 increased lightly， the HR slowed down obviously， but the BR increased， the SBP and DBP of the model rabbits descended markedly，and the PS content decreased dramatically. The pneumonic pathology changes showed pneumorrhagia， atelectasis， shrink of alveolus and pulmonary hyaline membrane. The above results indicated that it accorded with the standard of I-type of acute respiratory distress syndrome (ARDS). After the PPPS was applied to the model rabbits， each index nearly reached the normal level， and pneumonic pathology changes were also alleviated distinctly. The analytic result of statistics indicated that there was statistical significance in pH (F=4.572， P=0.046)， PaO2 (F=557.586， P=0.000)， PaCO2 (F=96.798， P=0.000)， TV (F=117.851，P=0.000)， Cydn (F=276.996， P=0.000)， HR (F=34.975， P=0.000)， BR(F=28.167， P=0.000)， SBP (F=124.751， P=0.000)， DBP (F=108.672，P=0.000) between the control group and the treated group. This showsPPPS has a great treatment effect on the model of the respiratory disdress syndrome in vivo lung-lavaged rabbits.Conclusions:PPPS has a great curative effect on the model of the respiratory distress syndrome in vivo lung-lavaged rabbits.［Key words］Pulmonary surfactant; Proliposomes; Respiratory distress syndrome肺表面活性物质（Pulmonary surfactant，PS）的缺乏可引起呼吸窘迫综合征，特别是早产儿的发病率和死亡率都很高。

猪肺泡表面活性物质治疗晚期早产儿呼吸窘迫综合症疗效观察摘要] 目的探讨猪肺泡表面活性物质治疗晚期早产儿呼吸窘迫综合症的临床疗效。

方法选取2014年5月-2015年6月期间在我院接受治疗的晚期早产儿呼吸窘迫70例，随机分成2组，每组35例。

对照组进行常规治疗，观察组在常规治疗基础上应用猪肺磷脂治疗。

比较两组治疗效果。

结果观察组PaO2、SaO2和PH值明显高于对照组，PaCO2明显低于对照组，差异显著(P＜0.05)；对照组吸氧时间、机械通气时间、呼吸困难消失时间以及住院时间明显高于观察组，差异显著(P＜0.05)。

结论猪肺泡表面活性物质治疗晚期早产儿呼吸窘迫综合症疗效显著，能够有效改善患儿肺功能和临床症状，缩短患儿住院时间，促使患儿早日康复，具有较高的临床应用价值。

[关键词] 猪肺泡表面活性物质；早产儿呼吸窘迫综合症；疗效Porcine alveolar surfactant therapy in late preterm children with respiratory distress syndrome EfficacyXue Ying (Yucheng County People's Hospital of Henan Yucheng 476300)[Abstract] Objective To investigate the porcine pulmonary surfactant late preterm children the clinical efficacy of the treatment of respiratory distress syndrome. Methods May 2014 --2015 during June in our hospital late preterm children treated 70 cases of respiratory distress, were randomly divided into two groups, 35 cases in each group. Control group conventional treatment, observation group poractant treatment based on routine treatment. Treatment effects were compared. Results observation group PaO2, SaO2 and PH value significantly higher, PaCO2 was significantly lowerthan the control group, the difference was significant (P <0.05); the control group oxygen time, mechanical ventilation time, dyspnea disappeared time and length of hospital stay was significantly higher than the observation group, the difference was significant (P <0.05). Conclusion swine alveolar surface active substances in patients with advanced respiratory distress syndrome in premature children significant effect, can effectively improve the clinical symptoms and pulmonary function in children, children with shorter hospital stay, prompting a speedy recovery of children with high clinical value.[Key words] porcine pulmonary surfactant; respiratory distress syndrome in premature children; efficacy呼吸窘迫综合征是新生儿常见疾病，是指新生儿出生不久后出现呼吸衰竭和呼吸困难等症状，主要原因为肺泡表面活性物质的缺乏，导致肺泡萎陷，严重威胁患儿的生命健康[1]。

猪肺表面活性剂的使用流程简介猪肺表面活性剂是一种用于呼吸机辅助通气的药物，主要用于治疗呼吸窘迫综合征（ARDS）患者。

它可以改善病人的肺功能，降低氧合指数，减少气道压力，缓解呼吸困难，并减少合并症。

使用流程以下是猪肺表面活性剂的使用流程，供医务人员参考：1.安全检查：–确保猪肺表面活性剂的包装完好无损，无异常变色或异味。

–核对使用剂量和使用方法，确保准确无误。

2.患者准备：–检查患者的基本情况，包括血压、心率、氧饱和度等。

–与患者及家属进行充分沟通，解释猪肺表面活性剂治疗的目的和过程。

–准备呼吸机和其他必要的设备。

3.执行前准备：–手部消毒，佩戴好手套和口罩。

–打开猪肺表面活性剂的包装，准备好注射器。

4.注射猪肺表面活性剂：–根据医嘱计划，将猪肺表面活性剂注入注射器中。

–将注射器连接到呼吸机的药物输入端口。

–慢速均匀注射猪肺表面活性剂，确保完全注入。

–注意注射速度，避免过快或过慢。

5.监测呼吸机参数：–监测患者的呼吸机参数，包括氧饱和度、呼吸频率、潮气量等。

–注意观察患者的情况，如出现呼吸急促、血氧饱和度下降等异常情况，及时通知医生。

6.观察患者反应：–在猪肺表面活性剂注射后，密切观察患者的反应。

–注意患者的呼吸情况、氧饱和度变化以及血压等指标的稳定性。

7.护理措施：–保持患者呼吸道通畅，定时吸痰，避免积痰。

–注意患者的体位，保持舒适，防止压疮发生。

–做好患者的护理与疼痛评估，定期记录相关观察指标。

8.定时评估：–在猪肺表面活性剂治疗期间，定期进行患者的生命体征和呼吸机参数评估。

–记录患者的相关指标，如呼吸频率、潮气量、氧饱和度等。

9.存储与处置：–将剩余的猪肺表面活性剂妥善保存，避免阳光直射和高温环境。

–按照医疗废物管理规范，将用过的注射器和包装物妥善处置。

注意事项在使用猪肺表面活性剂时，需要注意以下事项：•严格按照医生的处方和使用剂量使用猪肺表面活性剂。

•在使用过程中，密切观察患者的反应和生命体征变化。