非洲猪瘟检测流程

一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程本规程推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的一般性指南，用户可根据实验室需求选择仪器设备型号及耗材，优化最佳的检测程序。

1 样品处理1.1试验材料：待检样品为采集的猪全血，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（缓冲液B1和缓冲液B2）。

1.2 设备与材料：小型离心机，涡旋振荡器，100μl移液器，吸头，1.5ml离心管。

1.3 操作步骤血液混样操作：可将5份猪全血进行混样，每份血样取10μl于离心管后，涡旋振荡混匀，即为混样。

取10μl单样或混样新鲜抗凝全血加入100μl的缓冲液B1中，室温消化3分钟，涡旋混匀3~5次。

向上述混合液中加入100μl的缓冲液B2（恢复至室温并混匀使用），涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸，取2μl PCR待检核酸进行PCR反应。

如在2小时内检测则PCR待检核酸置于4℃保存，否则置于﹣20ºC以下冰箱保存。

2 PCR反应2.1 试验材料：待检样品为PCR待检核酸，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（PCR反应液、反应阳性对照和阴性对照）2.2 设备与材料：荧光定量PCR仪，掌式离心机，20μl移液器，10μl移液器，吸头，荧光定量PCR反应管，乳胶手套，口罩。

2.3 操作步骤扩增试剂准备：每个反应的体积为20μl。

根据检测样品数量每个反应管加入18μl PCR反应液。

依次取2μl阴性对照、PCR待检核酸、反应阳性对照到PCR反应管中。

PCR反应：加样后，将PCR管置于荧光定量PCR仪内进行如下反应：1）95ºC预变性20秒；2）95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。

判定结果的有效性：阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值。

当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct 值<40时可判定为阳性（强阳性样本的Ct 值<30）。

非洲猪瘟实验室检测流程非洲猪瘟是一种高度传染性的猪病，严重危害猪类养殖业。

为了及早发现、确诊和控制非洲猪瘟，需要进行实验室检测。

下面是非洲猪瘟实验室检测流程的详细介绍。

1.采集样品：样品采集是非洲猪瘟实验室检测的第一步。

常见的样品包括猪体组织、血液、粪便、呼吸道分泌物等。

采集时需要遵守无菌操作规范，确保样品的纯净度和准确性。

2.样品预处理：采集到的样品通常需要经过预处理，以提取出样品中的病毒或基因组等重要信息。

不同样品的预处理方法可能有所不同。

例如，血液样品通常需要进行离心分离血浆或血清，粪便样品需要进行离心沉淀，猪体组织样品需要进行玻璃化处理等。

3.样品提取：样品提取是为了从复杂的样品中分离出非洲猪瘟病毒或病原体的核酸。

常见的提取方法包括酚-氯仿法、磁珠法、柱子法等。

提取过程中需要注意避免污染和交叉感染，保证提取的纯度和质量。

4.质检：提取的样品需要进行质检，以确保提取效果和所需浓度。

常见的质检方法包括核酸定量、质量评估、纯度检测等。

质检结果必须满足实验要求才能进一步进行后续检测。

5.PCR扩增：PCR（聚合酶链式反应）是非洲猪瘟实验室检测的主要方法之一、通过PCR扩增病毒或病原体的核酸序列，可以高效地检测非洲猪瘟。

PCR扩增反应包括反应液配置、扩增程序设定和实验仪器操作等。

PCR扩增结果可以通过凝胶电泳等方法进行可视化分析。

6.实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR是一种检测非洲猪瘟的快速敏感方法。

其原理是在PCR扩增过程中实时检测荧光信号的增加量，以判断样品中病毒数量的多少。

实时荧光定量PCR需要选择合适的引物和探针，并进行标准曲线建立和结果分析。

7.ELISA检测：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法。

通过特异性抗体的识别与结合，可以检测非洲猪瘟病毒的抗原或抗体。

ELISA检测方法包括抗原捕获ELISA和抗体间接ELISA等，具体的操作步骤需要根据实验需求进行选择。

8.核酸测序：核酸测序是对非洲猪瘟病毒基因组进行全面分析的方法。

非洲猪瘟病原学检测方法介绍非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种高致病性的猪病，对于猪养殖业来说是一种严重威胁。

为了及时有效地进行疫情监测和病原学分析，科学家们发展了多种非洲猪瘟病原学检测方法。

本文将对这些检测方法进行详细的探讨。

PCR方法传统PCR1.样品收集：从患病猪只的脾脏、淋巴结或血液中收集样品。

2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒将样品中的DNA提取出来。

3.PCR反应体系：设置PCR反应体系，其中包括引物、模板DNA、酶和缓冲液。

4.PCR扩增程序：设定PCR扩增程序，包括一系列不同温度的循环反应。

5.结果分析：利用凝胶电泳的方法，观察PCR产物的大小。

实时定量PCR1.样品收集和DNA提取：与传统PCR相同。

2.PCR反应体系：与传统PCR相同，但引入了荧光探针。

3.实时定量PCR程序：设定实时定量PCR程序，包括多个不同温度的循环反应。

4.数据分析：根据荧光信号的强度和阈值周期数，计算出病毒数量。

优点•灵敏度高：PCR方法能够检测到非洲猪瘟病原体的极低浓度。

•特异性强：引物的设计使得PCR方法能够区分非洲猪瘟病原体和其他相关病原体。

•快速性：PCR方法可以在短时间内得到结果。

缺点•对实验操作要求高：PCR方法需要精确计量样品和试剂。

•易受污染：PCR方法容易受到外部环境中目标DNA的污染。

•不适合现场应用：PCR方法的设备和试剂有一定的成本，不适合一些资源有限的地区。

ELISA方法直接ELISA1.样品准备：从患病猪只的血液中收集样品。

2.酶标板涂层：将非洲猪瘟病毒的抗原涂在酶标板上。

3.样品加入：将已稀释的血清样品加入到酶标板中。

4.洗涤步骤：用洗涤缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的抗体。

5.反应步骤：加入与非洲猪瘟病毒抗体标记的酶联二抗。

6.洗涤步骤：洗涤酶标板，去除未结合的酶联二抗。

7.显示步骤：加入底物，使酶与底物反应产生可见的颜色。

8.终止反应：加入终止液停止酶的反应。

非洲猪瘟检测试剂操作方法非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种高度传染性疾病，对猪群健康和养殖业都造成了巨大损失。

为了迅速检测和诊断非洲猪瘟，科学家们开发了多种检测试剂。

下面将详细介绍非洲猪瘟检测试剂（包括PCR、ELISA和纸条快速检测试纸）的操作方法。

1. PCR检测方法：PCR（聚合酶链反应）是一种通过扩增病原体的特定基因片段来检测病原体的方法。

下面是非洲猪瘟PCR检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备PCR试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR引物和酶。

- 准备PCR工作站和仪器（如PCR仪）。

- 防止污染，使用无菌器材和顶级实验室规范的操作。

b. 样本提取：- 取非洲猪瘟病畜体、组织或血液样本。

- 使用合适的试剂盒进行DNA提取，按照操作手册中的指示进行。

- 将提取的DNA储存到低温条件下，避免降解。

c. PCR扩增：- 准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶和缓冲液。

- 按照PCR反应液体积的要求逐一加入反应管中。

- 定量PCR反应溶液，确保所有反应中的成分配比准确。

- 放入PCR仪中，按照所使用的引物设计好的程序运行PCR反应。

d. 结果分析：- 运行PCR反应后，获取PCR反应管。

- 将PCR产物经电泳分离，依据目标基因片段大小来判断是否存在非洲猪瘟病毒。

- 使用显色剂或转印装置对PCR产物进行直接检测。

- 分析PCR结果并记录，确认样本是否为非洲猪瘟阳性。

2. ELISA检测方法：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测非洲猪瘟病毒的抗体或抗原。

下面是非洲猪瘟ELISA检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备ELISA试剂盒，包括抗体/抗原、酶标记物、底物等。

- 准备ELISA板（包括微孔板或膜）和读板机。

- 防止交叉污染，使用不同的器材和操作台进行样本分析。

b. 样本处理：- 取非洲猪瘟血清样本，通过离心等操作去除杂质。

非洲猪瘟怎么检测，潜伏几天才发现1、免疫电泳试验：抗原于待检血清间出现白色沉淀线者为阳性。

2、直接免疫荧光试验：在荧光显微镜下观察细胞，若细胞浆内有明亮的荧光团，则为阳性。

3、间接酶联免疫蚀斑试验：直接用肉眼观察蚀斑，若颜色为棕色，则表示为阳性。

4、酶联免疫吸附试验：对照成立后，若待检样品的吸收值大于0.3，则可以判定为阳性。

一、非洲猪瘟怎么检测1、免疫电泳试验若抗原于待检血清间出现白色沉淀线，则为阳性。

2、直接免疫荧光试验在荧光显微镜下观察细胞，如果发现细胞浆内有明亮的荧光团，则表示为阳性。

3、间接酶联免疫蚀斑试验直接用肉眼（或使用显微镜）观察蚀斑，若颜色是棕色，则表示为阳性，没有颜色则表示为阴性。

4、酶联免疫吸附试验对照成立后（阳性血清对照吸收值＞0.3，阴性血清吸收值＜0.1），若待检样品的吸收值＞0.3，则可以判定为阳性。

5、红细胞吸附试验将健康猪的白细胞加上病猪的血液（或组织提取物）放在37°C 的环境中培养，若观察到大量的红细胞吸附于白细胞上面形成玫瑰花状（或桑椹体状），则表示为阳性。

6、间接免疫荧光试验在长满Vero细胞的盖玻片上接种非洲猪瘟病毒，并准备未接种病毒的Vero细胞对照。

试验后若对照正常，待检样品在细胞浆内出现明亮的荧光团和荧光细点，则可以判定为阳性。

二、非洲猪瘟潜伏几天才发现1、非洲猪瘟的潜伏期（1）一般情况下，非洲猪瘟的潜伏期为4-19天左右，潜伏期的长短与病毒的毒力、被感染猪群的抗病能力等因素有关。

（2）非洲猪瘟病毒的毒力可分为3个等级，即低毒力（潜伏期最长，发病最晚，可造成慢性、亚急性或不明显的发病）、中等毒力（潜伏期中等，临床症状有所减轻，会造成慢性或不明显症状）、强毒力（潜伏期较短，临床会表现出急性症状，而且病猪的皮肤上会出现出血点，并伴有厌食或呕吐、体温升高的情况，病死率达到100%）。

2、防控方法（1）避免外来人员、车辆、其他动物进入养殖场，场内的用具、饲料都要严格消毒。

Archimed实时荧光定量PCR系统Archimed Analyzer（Software Version1.08）简明操作手册非洲猪瘟检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司利用Archimed荧光定量PCR仪完成一个非洲猪瘟检测实验共分8个步骤，如下图所示操作流程图：1.启动系统1.1启动电脑显示器、主机；1.2打开仪器后底板的电源开关，电源状态灯POW为蓝色，常亮；1.3等待系统自检，自检过程中状态灯STU为绿色闪烁状态，自检通过后为绿色常亮；1.4双击桌面软件图标，启动软件；1.5软件启动中界面；1.6软件启动完成后界面；2.创建实验2.1点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；2.2点击菜单栏的“从模板创建”，可以通过之前已保存的实验运行模板创建新实验。

3.设置实验属性点击页面左侧的实验属性选项，进入实验属性设置界面：3.1实验名称：系统默认以实验当前的时间而命名，也可以自己命名，但目前不支持中文和特殊字符，这里以系统默认名称命名；3.2仪器型号：根据实际使用机型进行选择，这里以选择Archimed-X6系统为例；3.3反应管类型：根据实际使用的反应管类型进行选择，这里以选择白管为例；3.4实验类型：选择绝对定量和相对定量（ΔΔCt）都可以，但是不能选择熔解曲线，我们这里选择绝对定量。

3.5实验试剂：根据实际使用的试剂类型进行选择，非洲猪瘟检测试剂盒多采用TaqMan试剂，所以这里以Taqman试剂为例进行说明。

4.设置运行条件实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面：4.1反应体积设置：建议在5-25ul，实际实验可在1-30间选择一个值，明日达和郑州中道都选择25ul体系，反应体系后面显示热盖温度为100°C；4.2反应阶段设置：根据实际使用的试剂说明书设置反应阶段及步骤，如需增加或减少PCR反应阶段，如“保温”、“PCR反应”等，可将鼠标移至反应阶段区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此阶段前或后增加一个阶段，中间“-”代表去掉此阶段；如需增加或减少PCR某阶段中的反应步骤，可将鼠标移至该步骤区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此步骤前或后增加一个步骤，中间“-”代表去掉此步骤；4.3反应温度设置：时间、温度、升温速度（熔解曲线模式）的设定可以通过在数值区输入数值或点击进行，其中温度的设置还可通过点击拖拽温度曲线中的进行温度更改，拖动时温度以1°C为单位发生改变；注意：时间设置最小值不能小于00:01秒，进行实际更改时请避免4.4信号采集的相机图标：在每个反应步骤的时间框下面都有一个信号采集的相机图标，相机图标有两种状态，当为深蓝色时，代表处于信号采集开启状态，当为浅蓝色时，代表处于信号采集关闭状态，软件默认在每个循环扩增完成后进行信号采集；根据4.1到4.4的设置方法设置好后，明日达试剂盒运行条件如下图所示：根据4.1到4.4的设置方法设置好后，郑州中道试剂盒运行条件如下图所示：4.5运行条件模板保存：设置好的运行条件，可以点击界面左上角的保存按钮后的下拉菜单，单击另存为，即会弹出保存对话框。

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。

本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。

3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。

3.3引物探针3.3.1采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

A PPLICATION N OTE利用Archimed定量PCR进行非洲猪瘟病毒检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司阳性对照阴性样本非洲猪瘟荧光定量PCR 分析2018年8月非洲猪瘟疫情在中国爆发，爆发地区分布交广，对我国畜牧养殖造成了巨大损失。

我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，非洲猪瘟（ASF ）是由非洲猪瘟病毒（ASFV ）引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，对生猪致病率高，致死率高达100%。

应用实时荧光PCR 技术可以从低微含毒量样品中扩增获得病毒特异性核酸片段，进行病毒鉴定。

通过扩增捕获ASFV 主要免疫原基因VP72，进而测定其核酸序列，可进行以毒株间核苷酸序列同源性比较为主要技术手段的非洲猪瘟分子流行病学研究。

利用Archimed 荧光定量PCR 进行非洲猪瘟检测一般流程为了帮助实验人员更便捷地进行非洲猪瘟检测，Archimed 定量PCR 在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。

利用Archimed 软件智能设置向导，完成一个非洲猪瘟荧光定量PCR 分析实验只需简单的6个步骤：1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择相对绝对定量。

创建实验•创建新的相对定量实验文件并设置实验属性设置反应条件•进行相对定量运行条件的设置设置孔板•对反应孔进行属性及分布设置运行实验•开始非洲猪瘟荧光定量PCR 运行查看及分析结果•查看非洲猪瘟荧光定量图谱实验结果并进行分析导出实验结果•将图谱及实验数据导出保存以进行后续分析2.设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面3.设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。

根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性注：Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。

非洲猪瘟病原学检测方法一、病原学检测方法的意义非洲猪瘟是一种高度传染性、致死性极强的疾病，对于保障畜牧业生产和人类健康具有重要意义。

因此，开展非洲猪瘟的病原学检测可以及时发现感染情况，采取相应措施防止疫情扩散。

二、样品采集与处理1. 畜禽样品采集在非洲猪瘟流行地区，应优先选择临床表现明显的动物作为样本。

如发现有死亡或严重呼吸道感染等情况，应优先采集样品。

同时，在采集样品时要注意不要污染环境和其他动物。

2. 样品处理将采集到的血液、组织、粪便等样品放入离心管中，离心3000-5000转/分10-15分钟，将上清液转移到新管中保存。

如需长期保存，在-80℃下冷冻保存。

三、实验室检测方法1. PCR法检测PCR法是目前最常用的非洲猪瘟检测方法之一。

其基本原理是利用DNA聚合酶扩增技术，将病原体的DNA扩增到足够数量，再通过凝胶电泳等方法进行检测。

PCR法具有灵敏度高、特异性强、快速准确等优点。

2. ELISA法检测ELISA法是一种基于抗体抗原反应的检测方法，可以检测非洲猪瘟病毒的抗体水平。

其基本原理是将样品中的抗体与标记有特定抗原的酶结合，通过比色反应来判断是否存在非洲猪瘟抗体。

3. 病毒分离法检测病毒分离法是通过将样品中的病毒分离出来，并通过电镜、PCR等方法进行检测。

该方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但需要较长时间和专业技术支持。

四、注意事项1. 样品采集时要注意防止污染和交叉感染。

2. 在实验室操作时要严格遵守操作规程，注意个人防护措施。

3. 不同检测方法的结果可能存在差异，应综合考虑多种因素进行判断。

4. 检测结果应及时报告相关部门，采取相应的防控措施。

五、总结非洲猪瘟是一种严重的畜牧业疾病，开展病原学检测可以及时发现感染情况，采取相应措施防止疫情扩散。

在样品采集和实验室检测过程中要注意个人防护和操作规程，选择合适的检测方法进行检测，及时报告检测结果并采取相应的防控措施。