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碱性蛋白酶活力的测定

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碱性蛋白酶活力的测定

1、实验原理 蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸

等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。

2、实验试剂 2.1 福林试剂的制备

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、

水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫

酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色

需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1 000mL。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。 2.2. 碳酸钠溶液（Na 2CO3）=0.4mol／l 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1 000mL。 2.3. 三氯乙酸c（CCl 3·COOH）＝0.4mol／l 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1 000mL。 2.4. 氢氧化钠溶液（NaOH）＝0.5mol／l 2.5. 盐酸溶液（HCl）＝lmol／l及0.lmol／l

2.6. 硼酸缓冲溶液（pH10.5）

甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1 000mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1 000mL。

使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1 000mL。 上述各种缓冲溶液，均需用pH计校正。 2.7. 10g／L酪素溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol／L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，

用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3天。 2.8. 100μg／mL L-酪氨酸标准溶液

（1）称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol／L盐酸60mL

溶解后定容至100mL，即为1mg／mL酪氨酸标准溶液。

（2）吸取1mg／mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol／L盐酸定容至l00mL，即得到100μg

／mL L-酪氨酸标准溶液。 （二）实验仪器 1. 恒温水浴（40+0.2）℃。2. 分光光度计应符合GB 9721的规定。

3、实验步骤 3.1标准曲线的绘制

3.1.1. L-酪氨酸标准溶液 表1 L-酪氨酸标准溶液 管号 酪氨酸标准溶液的浓度c/(μg

／mL) 100μg／ml 酪氨酸标准溶液的体积

V/mL 取水的体积V/ml

0 0 0 10

1 10 1 9

2 20 2 8

3 30 3 7

4 40 4 6

5 50 5 5 3.1.2. 分别取上述溶液各100mL（需做平行试验），各加0.4mol／L碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液l.00mL，置于（40±0.2）℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，

以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，

绘制标准曲线（此线应通过零点）。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K

值应在95-100范围内。 3.2测定

3.2.1. 待测酶液的制备

称取酶粉1-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣

研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研3-4次，最后全部

移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用4层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.25-0.40范围内）。 3.2.2. 测定

（1）先将酪素溶液放入（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min。

（2）按下列程序操作：

试管A（空白） 试管B（酶试样，需做3个平行试样） ↓ ↓

加酶液1.00mL 加酶液1.00mL ↓（40±0.2）℃，2min ↓（40±0.2）℃，2min

加三氯乙酸2 .00mL（摇匀） 加酪素1.00mL（摇匀） ↓（40±0.2）℃，10min ↓（40±0.2）℃，10min 加酪素1.00mL（摇匀） 加三氯乙酸2 .00mL（摇匀）

↓ ↓

取出静置10min，过滤 取出静置10min，过滤

↓ ↓ 取1.00mL滤液 取1.00mL滤液 ↓ ↓ 加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL

↓ ↓

加福林试剂使用液1.00 mL 加福林试剂使用液1.00mL

↓（40±0.2）℃，显色20min ↓（40±0.2）℃，显色20min 于680nm波长，用10mm比色皿， 于680nm波长，用10mm比色皿，

测其吸光度 测其吸光度

4、实验数据整理 X＝A×K×4／10×n=2／5×A×K×n

式中：X—样品的酶活力（IU／g或IU／mL） A—样品平行试验的平均吸光度

K—吸光常数

4—反应试剂的总体积（mL）

10—反应时间

n—稀释倍数 所得结果表示至整数，平行实验相对误差不得超过3%。

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酶学实验四 碱性蛋白酶活力的测定

酶学实验四 碱性蛋白酶活力的测定

实验四 碱性蛋白酶活力的测定

（赖凌峰 李佳佳 邓仕彬）

一、原理

以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin 法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。

二、试剂

1、0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）

2、5%三氯醋酸

3、1%酪蛋白溶液：

称取5g 酪蛋白置于500mL 0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解。

4、0.4mol/L 碳酸钠溶液

5、100μg/mL 酪氨酸溶液

6、Folin 试剂，稀释3 倍使用

如果自己配制，可按下法：于2000mL 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO2.2H2O）25g，加水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10 小时。取下回流冷凝器，加入硫酸锂50g，水50mL 和浓溴水（99%）数滴，再煮沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤，制得的试剂应显金黄色，贮于棕色瓶内。

三、步骤

1、酶液的萃取

称取1g 粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL 酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。

2、酶活力的测定

样品管：

取不同量的酶液（0.2，0.4，0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL 预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀并开始计时，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。

测定蛋白酶活力实验

测定蛋白酶活力实验

测定蛋白酶活力实验

一、实验目的

1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理

酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂

仪器:

恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料

枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。 试剂

1. Folin-酚试剂：

在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液

3. L 氢氧化钠溶液

4. L 碳酸钠溶液

5. 10%三氯乙酸溶液

6. 磷酸缓冲液：

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。

蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定

QB/TXXX—20XX

蛋白酶活力的测定

1范围

本文件规定了酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定方法。

本文件适用于酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

3.1

中性蛋白酶活力单位neutralproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为7.2的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1

个中性蛋白酶活力单位。

3.2

酸性蛋白酶活力单位acidicproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为3.0的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1

个酸性蛋白酶活力单位。

3.3

碱性蛋白酶活力单位alkalineproteaseactiveunit

在温度为40℃、pH值为10.5的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1

个碱性蛋白酶活力单位。

4原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），

在碱性条件下，可将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正

比。采用分光光度计（波长660nm）测定其吸光度，进而计算蛋白酶活力。

5试剂和材料

5.1试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

5.1.1钨酸钠（Na2WO4·2H2O）。QB/TXXX—20XX

5.1.2钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）。

5.1.3硫酸锂（Li2SO4）。

5.1.4溴（Br）。

5.1.5无水碳酸钠（Na2CO3）。

5.1.6三氯乙酸（CCl3COOH）。

5.1.7磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）。

实验四蛋白酶活力的测定

实验四蛋白酶活力的测定

实验四、蛋白酶活力的测定

1.实验目的 掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。

2.实验原理 蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨

酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量

成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3.主要仪器和试剂 试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA溶液

仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。

4.实验步骤 （1）标准曲线绘制 管号 标准酪氨酸标准液 0.55mol/L碳酸

钠溶液（mL） 稀Folin试剂

（mL） 吸取量（mL） H2O（mL） 浓度（µg/mL）

1 0 10 0 5 1

2 1 9 10 5 1

3 2 8 20 5 1

4 3 7 30 5 1

5 4 6 40 5 1

6 5 5 50 5 1 （2）样品的测定

取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将

三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反

应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。三支试管中反应液用

滤纸过滤。另取三支试管（一支空白。两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加

入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却