欧文氏菌2酮基醛糖还原酶基因敲除的研究
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醛糖还原酶基因AR的克隆页数:7
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药物代谢中的还原酶和水解酶页数:12
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生化遗传学分析解析页数:67
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第五章 单基因疾病的遗传页数:83
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基因敲除技术研究新进展2021
基因敲除技术研究新进展2021基因敲除技术研究新进展黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了280年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。
该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。
实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。
以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。
三种植物提取物对醛糖还原酶活性的抑制作用
三种植物提取物对醛糖还原酶活性的抑制作用徐庆;刘英华;郑子新;郭波涛;薛长勇【期刊名称】《实用预防医学》【年(卷),期】2008(15)1【摘要】目的分别观察黄柏、生甘草、野菊花的乙醇提取物对醛糖还原酶活性的抑制作用。
方法从正常SD大鼠晶状体提取制备醛糖还原酶,体外实验以槲皮素为阳性对照,比较其与三种植物乙醇提取物对醛糖还原酶活性的抑制作用。
结果随着三种植物乙醇提取物和槲皮素浓度的增加,醛糖还原酶活性逐渐降低。
槲皮素IC50=68.23ug/ml,黄柏提取物IC50=107.34ug/ml,生甘草提取物IC50=185.64ug/ml,野菊花提取物IC50=118.09ug/ml,提示三种植物的乙醇提取物对AR均有抑制作用,抑制强度大小依次为槲皮素>黄柏提取物>野菊花提取物>生甘草提取物。
结论三种植物乙醇提取物均有抑制醛糖还原酶活性的作用,其抑制活力黄柏>野菊花>生甘草。
【总页数】3页(P66-68)【关键词】醛糖还原酶;黄柏;生甘草;野菊花【作者】徐庆;刘英华;郑子新;郭波涛;薛长勇【作者单位】中国人民解放军总医院营养科;中国人民解放军第三军医大学统计学教研室【正文语种】中文【中图分类】R587.1【相关文献】1.鬼针草不同提取物对醛糖还原酶的抑制作用 [J], 李帅;王秋红;匡海学;冈田嘉仁;奥山彻2.银杏叶提取物和黄芪甲苷对牛晶状体醛糖还原酶的抑制作用 [J], 印晓星;张银娣;刘晓;鲁茜;汤道权3.石榴皮多酚提取物对醛糖还原酶的抑制作用 [J], 孙慧;贾冬英;姚开4.金露梅提取物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和醛糖还原酶的抑制作用 [J], 李美华;王渭清;曾阳;郭凤霞;严培瑛;李锦萍5.昆布提取物对糖尿病大鼠肾组织醛糖还原酶活性及丙二醛含量的影响 [J], 全信福;姜英子;沈光海;吕惠子;李镐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用
POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用王琳;袁建林;缪昌;马玉晗;曹三杰;赵勤【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2024(36)2【摘要】为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。
本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。
其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。
再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。
结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR 基因,得到LO2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株。
对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,LO2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);LO2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);LO2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。
基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株
基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂，在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。
作为抗氧化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子。
作为风味稳定剂主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐加成物，减少了啤酒中游离醛类物质的含量。
然而啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒中积累，故其在发酵液中含量一般较低，不能起到稳定啤酒风味的作用。
啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的。
硫酸盐进入酵母细胞后，在ATP-硫酸化酶的催化下，首先被三磷酸腺苷活化，经过一系列酶促反应后，变为亚硫酸盐。
亚硫酸盐是中间产物，其进一步被亚硫酸盐还原酶还原后，形成硫化氢。
亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延长啤酒的保鲜期。
酿酒酵母的met10基因编码了一个115kD的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失met10基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫酸盐的含量可能会大幅度提高，亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含量增加对啤酒的稳定性有利，用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母高得多。
可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐，而引起生成较多的H2S。
影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。
高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种，酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一。
几个世纪以来，酿酒酵母被用于食品和酒精饮料生产，如今它也被应用于制药、表达异源蛋白等不同行业中。
酿酒酵母因其不表达内毒素而不具致病性，使得其被分类为GRAS (Gene- rally Regarded As Safe)生物，其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒。
胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析
ｈ ｒ ｏ ｉｇ ｅ ｐ ｅ ｅ ｗａ ｂｔｉ ｄ． Ａｎ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｒ ｄｕ ｔｗｉｈ ａｍ ｏｅ ｕ ａ ｆ２ ８ｋ ｗｅ ｈ ｓ ｄ ｔ ｃｅ ＤＳ ＰＡＧＥ ｆｅ ｎ ｕｃ ａ ｂ ｕｒｎ ｘ Ｉ ｇ ｎ ｓ ｏ ａｎｅ ｘ ｒ ｓｉ ｎ ｐ ｏ ｃ ｔ ｌｃ ｌｒｏ ４． Ｄ Ｊ ｔｗａ ｅｅ ｔｄ ｂｙ Ｓ － ｇ ａｔｒｉ ｄ —
摘 要 ： Ｐ Ｒ 方 法从 胡 萝 卜 腐 欧 文 氏 菌的 基 因组 Ｄ Ａ 中扩 增 出信 号 分 子 合 成 酶 ｅｐ 基 因 ， 其 克 隆 到 大 肠 杆 用 Ｃ 软 Ｎ ｘｌ 将
菌 表 达 栽体 ｐ Ｔ２ ａ （＋） ， 化 大 肠 杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） 获 得 高 效表 达 ｅ ｌ 因 的 重 组 大肠 杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ２ ｃ Ｅ 一８ 上 转 Ｌ１Ｄ３ ， ｘ 基 ｐ Ｌ １ ｐ Ｔ ８￣ 一
ＨＵＡＮＧ ａ — ｕ ｎ 一 ，ＢＩ Ｙｕ ｎ ｙ ａ ＡＮ ．ｕ ，Ｓ Ｚｉｒ ｉ一 ＯＮＧ ｈ ｉｓ ａ Ｓ ｕ —ｈ ｎ ，
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摘 要 ： Ｐ Ｒ 方 法从 胡 萝 卜 腐 欧 文 氏 菌的 基 因组 Ｄ Ａ 中扩 增 出信 号 分 子 合 成 酶 ｅｐ 基 因 ， 其 克 隆 到 大 肠 杆 用 Ｃ 软 Ｎ ｘｌ 将
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农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用
棉 花 学 报 Ｃ ｏ ￣ ｏ ｎ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ３ ） ： ２ ６ ２ ～ ２ ６ ８
农杆 菌介 导的基 因敲除技术在 丝状真菌基 因功能研
究 中的应 用
李彩红， 李 志芳 ， 冯 自力 ， 赵 丽红 ， 师 勇强 。 王玲飞 ， 刘 义杰 ， 朱 荷琴
Ｌ Ｉ Ｃ ａ ｉ — ｈ ｏ ｎ ｇ ， Ｌ Ｉ Ｚ ｈ ｉ — ｆ ａ ｎ ｇ ， Ｆ Ｅ Ｎ Ｇ Ｚ ｉ － ｌ ｉ ， Ｚ Ｈ ＡＯ Ｌ ｉ — ｈ ｏ ｎ ｇ， Ｓ ＨＩ Ｙ ｏ ｎ ｇ — ｑ ｉ ａ ｎ ｇ， ＷＡ ＮＧ Ｌ ｉ ｎ ｇ — ｆ ｅ ｉ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｙｉ － ｊ ｉ ｅ ， Ｚ Ｈ Ｕ
Ｈｅ — ｑ ｉ ｎ
ห้องสมุดไป่ตู้
（ Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆＣ ｏ ｔ ｔ ｏ ｎ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ／ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｃ ｏ ｔ ｏ ｎ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ， Ｃ ｈ ＆ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ａ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ ，
中 图分 类 号 ： ￥ ４ ３ ５ ． ６ ２ １ 文献标志码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ２ — ７ ８ ０ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ２ ６ ２ ． ０ ７
Ａｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｇｅ ｎ ｅ Ｋｎ ｏ ｃ ｋ ｏ ｕ ｔ ｂ ｙ ＡＴ ＭＴ ｉ ｎ Ｆｉ ｌ ａ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ Ｆｕ ｎ ｇ ｕ ｓ Ｆｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｇｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ ｓ
农杆 菌介 导的基 因敲除技术在 丝状真菌基 因功能研
究 中的应 用
李彩红， 李 志芳 ， 冯 自力 ， 赵 丽红 ， 师 勇强 。 王玲飞 ， 刘 义杰 ， 朱 荷琴
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中 图分 类 号 ： ￥ ４ ３ ５ ． ６ ２ １ 文献标志码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ２ — ７ ８ ０ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ２ ６ ２ ． ０ ７
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植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是现代植物遗传学领域的一项重要研究工具，它通过利用CRISPR/Cas9等工具精确地切断植物基因，从而实现对植物基因组的精准编辑和改造。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，希望对您有所帮助。
植物基因敲除技术步骤一、制备CRISPR/Cas9载体1.选择合适的CRISPR/Cas9载体：首先需要确定用于植物基因敲除的CRISPR/Cas9载体，一般选择含有Cas9核酸酶、sgRNA以及适当的植物选择标记的载体。
2.将目标基因sgRNA序列插入载体：利用分子克隆技术，将设计好的sgRNA序列插入CRISPR/Cas9载体中，确保sgRNA能够专一且高效地识别目标基因序列。
二、转化植物细胞1.选择合适的植物材料：根据研究需要选择适宜的植物组织或细胞系，比如拟南芥、水稻、玉米等。
2.利用农杆菌介导转化技术：将制备好的CRISPR/Cas9载体利用农杆菌介导转化技术导入植物细胞中，促使其整合到植物基因组中。
三、筛选敲除突变体1.培养转化的植物细胞：将转化的植物细胞进行培养，培养条件包括合适的培养基、光照和温度等。
2.筛选突变体：利用PCR、Southern blot等技术筛选出含有目标基因敲除的突变植株，确认其为敲除突变体。
四、鉴定敲除突变体1.验证基因组序列：对候选的敲除突变体进行测序鉴定，确认目标基因已被成功敲除。
2.确认敲除效果：通过表型观察、生物化学分析等方法，评估目标基因敲除对植物的影响，确认敲除效果。
通过以上步骤，可以实现对植物基因的精准敲除，为研究植物基因功能、开发新品种以及改良农作物品质提供了重要的技术手段。
植物基因敲除技术的不断完善和广泛应用，将为农业生产和生物科学研究带来更多的机会和挑战。
基因敲除技术,talen技术
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重
ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生 物学形状的变化进而了解目的基因变化 前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究 目的基因的目的。 •
f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在 一对染色体上中一条染色体中,所以如 果 要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型， 需要进行至少两代遗传。[8]（见图2）
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基因同源重组法敲除靶基因的步骤
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有嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠
条件性基因敲除法
• 利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官 或特 定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基 因组的靶位点上 装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细 胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过 将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠 杂交(也可以其他方式向小 鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如 特定的组织特 异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基 因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故 “1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因 小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因 切除。这样，靶基因的 修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决 定了靶基 因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修 饰 (切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因 在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性 和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
欧文氏杆菌CXJZ11_01基因组文库的构建
６２０
湖 北 农 业 科学
２００８ 年
匀， ３７℃温浴 １ ｈ， 加 １００ μＬ ５ ｍｏｌ·Ｌ－１ ＮａＣｌ， 充分混 匀， 再加 ８０ μＬＣＴＡＢ ／ＮａＣｌ 溶液， 混匀， ６５℃温浴 １０ ｍｉｎ， 加入等体积的氯仿 ／异戊醇， 混匀， 离心 ４￣５ ｍｉｎ， 留上清， 加入等体积的酚 ／氯仿 ／异戊醇， 混匀， 离心 ５ ｍｉｎ， 留上清， 加入 ０．６ 倍体积异戊醇， 轻轻混 合到 ＤＮＡ 沉淀下来， 用 １ ｍＬ７０％乙醇洗涤， 离心 ５ ｍｉｎ， 弃上清， 稍干燥 ＤＮＡ， 重新溶于 １００ μＬ ＴＥ 缓 冲液中。 １．２．３ 基 因 组 ＤＮＡ 的 酶 切 首 先 选 用 Ｓａｐ Ι， ＭｂｏΙ， Ｓａｕ３Ａ Ι， ＤｐｎⅡ， ＭｓｅΙ， 进行限制性酶切， 然后 选定酶切效果最好的 Ｓａｕ３Ａ Ｉ 梯度酶切， 确定最适 酶用量。 １．２．４ 基因组 ＤＮＡ 的连接转化 制备载体ｐＵＣ１８。 采用 ＯＭＥＧＡ 试剂盒 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＩＩ 提取， 按实验操作手册进行。加入 ＢａｍＨ Ｉ， 酶切 过夜， 用 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 凝胶回收， 按 实 验 操 作 手 册 进 行 ， 然 后 采 用 ＣＩＡＰ 去 磷 酸 化 ３０ ｍｉｎ， 醋酸—无水乙醇沉淀法去杂回收， 然后溶于适 量双蒸水或 ＴＥ 中， － ２０℃保存。加入 ＤＮＡ 连接酶， 将酶切后的 ＤＮＡ 片断与载体 １６℃连接过夜。 １．２．５ 基 因 文 库 的 构 建 采 用 钙 激 法 制 备 大 肠 杆 菌感受态细胞， 通过蓝白斑筛选重组子， 构建了欧 文氏杆产木聚糖酶菌株的 选择培养基上， ３７℃恒温箱培养 ２￣３ ｄ 后 ， 碘 液 染 色， 结果发现有菌落周围出现了清晰的透明圈， 筛 选到阳性克隆。采用 ＰＣＲ 方法对阳性克隆进行了进 一步的分析鉴定。
基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法
Abstract:ually,geneflankingfragmentsareusedtosubstituteitsgenomichomogeneoussequencesbyusingantibioticasselected marker,but therearestillmanyproblemstobesolved,likescreeninginefficiency,highfalsepositive,andcomplicatedoperation.Inthisstudy,weoptimizedtheknockouttechniquesusingafilamentousfungiMagnaportheoryzae asanexample.Thegeneknockoutstrategyincludes:1)HPH-GFPfusionexpressionvectorconstruction.2) Thespecificgeneflankingsequencesamplification;3)Thechimerafragmentscomposition;4)Fungiprotoplasttransformation.5)Transformantsidentification.Theresultsdemonstratedthatthemethodimprovesthe mutantidentificationefficientlybyusinghygromycinandGFPasscreenmarkers,whichcouldbesalutaryfor genefunctioninvestigationoffilamentousfungi. Keywords: filamentousfungi;geneknockout;Magnaportheoryzae;PCRamplification
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物仍具有酶活。在此基础上，我们构建了基因敲除质粒，利用同源重组的方法用体外突变 失活的２一ＫＲ基因替换基因组上正常的２一ＫＲ基因，进行了基因敲除的初步研究。此项研 究体现了基因敲陈技术在微生物代谢工程方面的应用，使我们可以从宿主菌基因水平上 彻底阻断旁路代谢，为实现工程菌从葡萄糖到２．ＫＬＧ的高效转化打下基础。
４０卷５期 ２０００年１０月
微生物 学报
Ａｃｍ Ｍｌｃ，０６ｆｏ蛔ｆ妇ｓｉ＾ｉ∞
ｖｏ】４０ Ｎ。．５ ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００
欧文氏菌２一酮基醛糖还原酶基因敲除的研究＋
陈 芳 陈策实李越尹光琳
（中国科学院上海生物工程研究中心 上海２００２３３）
摘要：根据已知基因序列，利用ＰｃＲ技术．从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒ叫ｚ”谊ｓｐ．）ｓＣＢｌ２５染
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ＴⅢ∞ｔｍＢ十＊自＃＃一ｎ＆｝＊１０ ４ⅫＪ ０ ５日∞￡日Ⅲ日∞ｑＭＲ目∞＊９７℃，１０ｍｉｎ，７２℃，２ｍｉｎ，加入Ｔａｑ酶。循环参数：９５ ℃变性１ｍｉｎ；４５℃复性１ｍｉｎ．７２℃延伸３ｍｉｎ；３５个循环，７２℃５ｍｉｎ使产物延伸完全。混 合物取５ｎＬ用琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增产物通过ＰＣＲ回收试剂盒纯化。 １．３．４ ２一ＫＲ酶比活测定方法：参照文献［１０，１１］并略加改进。离心收集表达的菌体．用
的细胞。在无抗性压力或低磷条件下培养１０～５０代就会出现很多质粒丢失的细
胞－５·”，…。因此将突变基因构建在此类质粒上，再让发生重组后的质粒丢失即可。构建
时将从质粒ｐＤＲｌ２１上用Ｓ研ｄＩ切下的链霉素抗性基因片段插入ｐＧＥＭ—ＴＡ中拍，Ａ内
部（７７６ｂｐ）的ｓｆ“Ｉ位点，在ＡｍｐＳｔｒ ＬＢ平板上筛选得到重组克隆，酶切鉴定后用ＲｆＩ切
环素敏感的正向筛选方法先初筛四环素敏感的菌株，再 分别在Ｔｃ、Ｓｔｒ、ＫａｎＬＢ平板上进行抗性验证。
＊国家自然科学基金资助项目（３９７７００２１）
作者简介：陈芳（１９７４），女，四川成部人．南京大学生物化学系毕业，现为中国科学院上海生物工程研究中心
９７级硼士研究生．主要从事分子生物学研究
收藕日期：１９９９ ０８－２７．惨回日期：１９９９．１１ ３０
口ｆ
万方数据
４７６
微
生
物
学
报
４０卷
够提高２一ＫＬＧ的产量【３“】，我们着手对其进行基因敲除。 本文报道了两个２一ＫＲ基因在大肠杆菌中成功表达，证实发生了突变的基因表达产
近于３０℃，因而这是比较合适的载体。 ２．３敲除质粒的构建殛基因敲除菌株的初步筛选
在证实两个２一ＫＲ都具有酶活的基础上，对它们的基因敲除进行了初步探索。先从 施以Ａ手，构建敲除载体，利用同源重组的方法用体外突变失活的２一ＫＲ基因替换基因
组上正常的２．ＫＲ基因。ｐＢＲ３２２质粒分配不稳定，在细胞分裂过程中易于出现质粒丢失
的Ｂｕｆｆｅｒ Ａ中，测定ＯＤ３４０的变化，酶活力以第ｌ ｍｉｎ内ＯＤ３４０下降值来计算。根据标准 曲线换算成ＮＡＤＰＨ浓度变化，计算酶活力。酶活力单位（Ｕ）定义为：每分钟氧化１“ｍｏｌ ＮＡＤＰＨ所需的酶量。蛋白浓度采用Ｂｒａｆｏｒｄ法［１２１以牛血清白蛋白为标准测定［１ ３】，计算 酶的比活力。 １．３．５重组欧文氏菌的低磷培养：参照文献［１４，１５］，将Ｋａｎ换为ｓｔｒ。 １．３．６基因敲除菌株的初筛方法：将低磷培养后的苗液适度稀释，参照文献［１６］阳性筛 选四环素敏感菌落，再用灭菌牙签分别点到含Ｔｃ、Ｓｔｒ及Ｋａｎ的ＬＢ平板上加以验证。 Ｓｔｒ７Ｋ口＂‘ｎ’的菌株即为初筛所需目的菌株。
ｌ材料和方法
１．１菌株与质粒（表１）
表１菌株与质粒
Ｓｔ㈣ｓ Ｔａｂｌｅ １
ａｎｄ ｄａｓｍｌｄｓ
ｌ ２培养基和试剂 １．２．１培养基：ＬＢ培养基按常规配制¨Ｊ，使用前根据需要加入１００肚ｇ／ｍＬ Ａｍｐ、 ５０ｐｇ／ｍＬ ｓｔｒ、５０ｐｇ／ｍＬ Ｋａｎ、２０旭／ｍＬ Ｔｃ等。 １．２．２酶与试剂：ＰＣＲ及回收Ｋｉｔ购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司，限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购 于Ｐｒｏｍｅｇａ公司和ＴａＫａＲａ公司，质粒抽提Ｋｉｔ购于ＱＩＡＧＥＮ公司，ＮＡＤＰＨ购自 ＣＡＬＢＩｏＣＨＥＭ公司，ＳＤｓ＿ＰＡＧＥ低分子标准蛋白购于上海丽珠东风生物技术有限公司， ２一ＫＤＧ、５一ＫＤＧ、萎蔫酸（Ｆｕｓａｒｉｃ ａｃｉｄ）和金霉素（Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）为Ｓｉｇｍａ 产品，２一ＫＬＧ从山梨糖采用混合菌发酵制备，２，５一ＤＫＧ从葡萄糖经发酵制备。 １．３方法 １．３．１ ＤＮＡ操作技术和表达产物的ｓＤＳ—ＰＡＧＥ分析：按常规方法【５１及操作说明书进 行。转化欧文氏菌用改进的Ｃａｃｌ２法进行”ｊ。 １．３．２欧文氏菌基因组ＤＮＡ的提取方法：参考文献［８，９］。 １．３．３引物合成与ＰｃＲ扩增：根据文献报道的２一ＫＲ基因及其两端序列，用Ｐｃ／ＧＥＮＥ 软件中ＰＣＲ引物设计程序，设计了ＰＣＲ反应的引物，合成时在５’端加上酶切位点和保护
文献标识码：Ａ
文章编号：０００１ ６２０９（２０００）０５—０４７５ ８１
基因敲除作为近几十年新兴的一种重要的重组ＤＮＡ技术，在微生物代谢工程研究 中，与基因克隆技术同等重要，广泛应用于构建具有特定突变的工程菌，改变生物代谢途 径，阻断副反应的进行，防止副产物或有毒产物形成，促进目的产物积累等方面。随着重 组ＤＮＡ技术的发展，研究者多采用将克隆的目的基因进行定点体外突变．然后导入宿主 细胞，利用某些机制筛选得到目的基因敲除突变株。目前国内关于基因敲除在微生物代 谢工程研究方面的工作未见报道。
下此突变基因连接到质粒ｐＢＲ３２２中，在Ｓｔｒ，ｒｃＬＢ平板
￡ｃ０Ｒｌ
上筛选得到的重组克隆，酶切鉴定后再插入从质粒
ｐＵＣ４Ｋ上用踟ＲＩ切下的卡那霉素抗性基因片段，连
接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ｎ，在ＳｔｒＴｃＫａｎＬＢ平板上筛选
得到最终重组克隆，酶切鉴定后定名为ｐＣＦ（图３）。 质粒ｐｃＦ转化到欧文氏菌经低磷培养后，采用对四
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．】：ｌ：５：蕊：基曩麓＝， ＩⅢⅡｕ【【…，５Ｈ…＿＂ｚ）…Ｊ…５…Ｊ】，…（１＿ｎ【ｉＴｊ
万方数据
５期
陈芳等：欧文氏菌２一酮基醛糖还原酶基因敲除的研究
４７９
接酶活力测定方法测定表达在大肠杆菌中的２一ＫＲ活力，结果表明表达的２一ＫＲＡ和 Ｂ都具有很高的生物学活性，对底物２一ＫＬＧ，２．ＫＲＡ达到了５３５６ｕ／ｎ填，２一ＫＲＢ达到了 ３８８９Ｕ／Ｉｎｇ；对底物２，５．ＤＫＧ，２一ＫＲＢ也达到６４２８Ｕ／ｍｇ，与对照（含有ｐＢＵＩ）表达的２，５． ＤＫＧ还原酶ＩＩ的活力相当。通过不同的温度诱导，从结果可见４２℃诱导能够得到高得 多的蛋白表达量，但上清中酶的比活力和３０℃诱导保持基本相同的水平。这说明４２℃诱 导的大量表达产物形成了包涵体，胞质中的可溶性蛋白可能已经达到饱和，同时说明突变 的ＣＩｔｓ８５７蛋白抑制Ｐ１启动子转录不是十分严谨．而欧文氏菌ＳＣＢｌ２５正常发酵温度接
色体中重新扩增得到含有２一酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２一ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段，分别用于基因
表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＤＨ５ａ后，获得高酶
活表达。在汪实发生ｒ突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上．对其进行基因敲除的研
究。在体外将链霉素抗性基因插入到￡＾ｒＡ内部使其突变失活并作为阳性筛选标记．再将此
万方数据
５期
陈芳等：欧文氏苗２一酮基醛糖还原酶基因破除的研究
４７７
碱基可以方便地进行克隆。 基因表达采用引物： 如ｒＡ
５’端引物：５’ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴ ３’
３ ７端引物：５’ＥｆＡｏＡＲＩＧＣＴＴＧＣＧＡｍＡＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣ ３’
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突变基因构建到分配不稳定型质粒ｐＨＲ３２２上，导＾宿主菌后与染色体上正常基因进行同源
重组交换．筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢，实现从
葡萄糖一步发酵产生维生索ｃ前体２一酮基古龙酸（２，ＫＩ。Ｇ）打下基础。
关键词：维生紊ｃ，２．酮基醛糖还原酶，表达．基因敲除，欧文氏菌
中围分类号：Ｑ９３３
维生素Ｃ是人体必需的一种维生素和抗氧化剂，其重要前体２一酮基一Ｌ一古龙酸（２， ＫＬＧ）的生物合成近几十年来一直受到广泛重视。我们实验室在“八五”攻关期间开展了 采用欧文氏菌（Ｅｒｗ抽缸ｓｐ）和棒状杆菌（ｏｒ州曲口ｃ∞ｒ拙ｍ ｓｐ．）进行串联发酵产生２一 ＫＬＧ的一系列研究…。为进一步简化工艺，开始构建从葡萄糖一步发酵产生２一ＫＬＧ的 基因工程菌，现已在宿主菌欧文氏菌ＳＣＢｌ２５中成功表达了有活力的２，５．ＤＫＧ还原酶， 同时在测酶活过程中发现存在高背景２一酮基醛糖还原酶（２一ＫＲ）活力．并通过活性凝胶染 色初步验证＿２ Ｊ。随后根据国外草生欧文氏菌ＡＴｃｃ２１９９８的两个２一ＫＲ（２一ＫＲＡ和Ｂ）基 因序列【３ Ｊ，采用ＰＣＲ技术克隆得到两个２一ＫＲ基因（硅以和￡凫ｒＢ）。酶切和浏序证明： 珐ｒＡ发生多处突变，而雎ｒＢ基本保守。由于２一ＫＲ能够利用ＮＡＤＰＨ或ＮＡＤＨ辅酶将 工程菌代谢中重要的中间产物２，５一ＤＫＧ及终产物２一ＫＬＧ转化为副产物５一酮基一Ｄ一葡萄 糖酸（５一ＫＤＧ）和Ｌ一艾杜糖酸（Ｌ—ＩＡ），通过代谢工程研究减少或解除旁路代谢的关键酶能
４０卷５期 ２０００年１０月
微生物 学报
Ａｃｍ Ｍｌｃ，０６ｆｏ蛔ｆ妇ｓｉ＾ｉ∞
ｖｏ】４０ Ｎ。．５ ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００
欧文氏菌２一酮基醛糖还原酶基因敲除的研究＋
陈 芳 陈策实李越尹光琳
（中国科学院上海生物工程研究中心 上海２００２３３）
摘要：根据已知基因序列，利用ＰｃＲ技术．从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒ叫ｚ”谊ｓｐ．）ｓＣＢｌ２５染
Ⅸ№ｈ日§＃ｔ＊ＤＢＬｉ§女＆皿Ｌ｝∞舶十＂目“％＊ｍｆＮｒｂ２ｍ＊＊★％
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扩增产物通过ＰＣＲ回收试剂盒纯化。 １．３．４ ２一ＫＲ酶比活测定方法：参照文献［１０，１１］并略加改进。离心收集表达的菌体．用
的细胞。在无抗性压力或低磷条件下培养１０～５０代就会出现很多质粒丢失的细
胞－５·”，…。因此将突变基因构建在此类质粒上，再让发生重组后的质粒丢失即可。构建
时将从质粒ｐＤＲｌ２１上用Ｓ研ｄＩ切下的链霉素抗性基因片段插入ｐＧＥＭ—ＴＡ中拍，Ａ内
部（７７６ｂｐ）的ｓｆ“Ｉ位点，在ＡｍｐＳｔｒ ＬＢ平板上筛选得到重组克隆，酶切鉴定后用ＲｆＩ切
环素敏感的正向筛选方法先初筛四环素敏感的菌株，再 分别在Ｔｃ、Ｓｔｒ、ＫａｎＬＢ平板上进行抗性验证。
＊国家自然科学基金资助项目（３９７７００２１）
作者简介：陈芳（１９７４），女，四川成部人．南京大学生物化学系毕业，现为中国科学院上海生物工程研究中心
９７级硼士研究生．主要从事分子生物学研究
收藕日期：１９９９ ０８－２７．惨回日期：１９９９．１１ ３０
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万方数据
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４０卷
够提高２一ＫＬＧ的产量【３“】，我们着手对其进行基因敲除。 本文报道了两个２一ＫＲ基因在大肠杆菌中成功表达，证实发生了突变的基因表达产
近于３０℃，因而这是比较合适的载体。 ２．３敲除质粒的构建殛基因敲除菌株的初步筛选
在证实两个２一ＫＲ都具有酶活的基础上，对它们的基因敲除进行了初步探索。先从 施以Ａ手，构建敲除载体，利用同源重组的方法用体外突变失活的２一ＫＲ基因替换基因
组上正常的２．ＫＲ基因。ｐＢＲ３２２质粒分配不稳定，在细胞分裂过程中易于出现质粒丢失
的Ｂｕｆｆｅｒ Ａ中，测定ＯＤ３４０的变化，酶活力以第ｌ ｍｉｎ内ＯＤ３４０下降值来计算。根据标准 曲线换算成ＮＡＤＰＨ浓度变化，计算酶活力。酶活力单位（Ｕ）定义为：每分钟氧化１“ｍｏｌ ＮＡＤＰＨ所需的酶量。蛋白浓度采用Ｂｒａｆｏｒｄ法［１２１以牛血清白蛋白为标准测定［１ ３】，计算 酶的比活力。 １．３．５重组欧文氏菌的低磷培养：参照文献［１４，１５］，将Ｋａｎ换为ｓｔｒ。 １．３．６基因敲除菌株的初筛方法：将低磷培养后的苗液适度稀释，参照文献［１６］阳性筛 选四环素敏感菌落，再用灭菌牙签分别点到含Ｔｃ、Ｓｔｒ及Ｋａｎ的ＬＢ平板上加以验证。 Ｓｔｒ７Ｋ口＂‘ｎ’的菌株即为初筛所需目的菌株。
ｌ材料和方法
１．１菌株与质粒（表１）
表１菌株与质粒
Ｓｔ㈣ｓ Ｔａｂｌｅ １
ａｎｄ ｄａｓｍｌｄｓ
ｌ ２培养基和试剂 １．２．１培养基：ＬＢ培养基按常规配制¨Ｊ，使用前根据需要加入１００肚ｇ／ｍＬ Ａｍｐ、 ５０ｐｇ／ｍＬ ｓｔｒ、５０ｐｇ／ｍＬ Ｋａｎ、２０旭／ｍＬ Ｔｃ等。 １．２．２酶与试剂：ＰＣＲ及回收Ｋｉｔ购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司，限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购 于Ｐｒｏｍｅｇａ公司和ＴａＫａＲａ公司，质粒抽提Ｋｉｔ购于ＱＩＡＧＥＮ公司，ＮＡＤＰＨ购自 ＣＡＬＢＩｏＣＨＥＭ公司，ＳＤｓ＿ＰＡＧＥ低分子标准蛋白购于上海丽珠东风生物技术有限公司， ２一ＫＤＧ、５一ＫＤＧ、萎蔫酸（Ｆｕｓａｒｉｃ ａｃｉｄ）和金霉素（Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）为Ｓｉｇｍａ 产品，２一ＫＬＧ从山梨糖采用混合菌发酵制备，２，５一ＤＫＧ从葡萄糖经发酵制备。 １．３方法 １．３．１ ＤＮＡ操作技术和表达产物的ｓＤＳ—ＰＡＧＥ分析：按常规方法【５１及操作说明书进 行。转化欧文氏菌用改进的Ｃａｃｌ２法进行”ｊ。 １．３．２欧文氏菌基因组ＤＮＡ的提取方法：参考文献［８，９］。 １．３．３引物合成与ＰｃＲ扩增：根据文献报道的２一ＫＲ基因及其两端序列，用Ｐｃ／ＧＥＮＥ 软件中ＰＣＲ引物设计程序，设计了ＰＣＲ反应的引物，合成时在５’端加上酶切位点和保护
文献标识码：Ａ
文章编号：０００１ ６２０９（２０００）０５—０４７５ ８１
基因敲除作为近几十年新兴的一种重要的重组ＤＮＡ技术，在微生物代谢工程研究 中，与基因克隆技术同等重要，广泛应用于构建具有特定突变的工程菌，改变生物代谢途 径，阻断副反应的进行，防止副产物或有毒产物形成，促进目的产物积累等方面。随着重 组ＤＮＡ技术的发展，研究者多采用将克隆的目的基因进行定点体外突变．然后导入宿主 细胞，利用某些机制筛选得到目的基因敲除突变株。目前国内关于基因敲除在微生物代 谢工程研究方面的工作未见报道。
下此突变基因连接到质粒ｐＢＲ３２２中，在Ｓｔｒ，ｒｃＬＢ平板
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上筛选得到的重组克隆，酶切鉴定后再插入从质粒
ｐＵＣ４Ｋ上用踟ＲＩ切下的卡那霉素抗性基因片段，连
接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ｎ，在ＳｔｒＴｃＫａｎＬＢ平板上筛选
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陈芳等：欧文氏菌２一酮基醛糖还原酶基因敲除的研究
４７９
接酶活力测定方法测定表达在大肠杆菌中的２一ＫＲ活力，结果表明表达的２一ＫＲＡ和 Ｂ都具有很高的生物学活性，对底物２一ＫＬＧ，２．ＫＲＡ达到了５３５６ｕ／ｎ填，２一ＫＲＢ达到了 ３８８９Ｕ／Ｉｎｇ；对底物２，５．ＤＫＧ，２一ＫＲＢ也达到６４２８Ｕ／ｍｇ，与对照（含有ｐＢＵＩ）表达的２，５． ＤＫＧ还原酶ＩＩ的活力相当。通过不同的温度诱导，从结果可见４２℃诱导能够得到高得 多的蛋白表达量，但上清中酶的比活力和３０℃诱导保持基本相同的水平。这说明４２℃诱 导的大量表达产物形成了包涵体，胞质中的可溶性蛋白可能已经达到饱和，同时说明突变 的ＣＩｔｓ８５７蛋白抑制Ｐ１启动子转录不是十分严谨．而欧文氏菌ＳＣＢｌ２５正常发酵温度接
色体中重新扩增得到含有２一酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２一ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段，分别用于基因
表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＤＨ５ａ后，获得高酶
活表达。在汪实发生ｒ突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上．对其进行基因敲除的研
究。在体外将链霉素抗性基因插入到￡＾ｒＡ内部使其突变失活并作为阳性筛选标记．再将此
万方数据
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陈芳等：欧文氏苗２一酮基醛糖还原酶基因破除的研究
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碱基可以方便地进行克隆。 基因表达采用引物： 如ｒＡ
５’端引物：５’ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴ ３’
３ ７端引物：５’ＥｆＡｏＡＲＩＧＣＴＴＧＣＧＡｍＡＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣ ３’
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突变基因构建到分配不稳定型质粒ｐＨＲ３２２上，导＾宿主菌后与染色体上正常基因进行同源
重组交换．筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢，实现从
葡萄糖一步发酵产生维生索ｃ前体２一酮基古龙酸（２，ＫＩ。Ｇ）打下基础。
关键词：维生紊ｃ，２．酮基醛糖还原酶，表达．基因敲除，欧文氏菌
中围分类号：Ｑ９３３
维生素Ｃ是人体必需的一种维生素和抗氧化剂，其重要前体２一酮基一Ｌ一古龙酸（２， ＫＬＧ）的生物合成近几十年来一直受到广泛重视。我们实验室在“八五”攻关期间开展了 采用欧文氏菌（Ｅｒｗ抽缸ｓｐ）和棒状杆菌（ｏｒ州曲口ｃ∞ｒ拙ｍ ｓｐ．）进行串联发酵产生２一 ＫＬＧ的一系列研究…。为进一步简化工艺，开始构建从葡萄糖一步发酵产生２一ＫＬＧ的 基因工程菌，现已在宿主菌欧文氏菌ＳＣＢｌ２５中成功表达了有活力的２，５．ＤＫＧ还原酶， 同时在测酶活过程中发现存在高背景２一酮基醛糖还原酶（２一ＫＲ）活力．并通过活性凝胶染 色初步验证＿２ Ｊ。随后根据国外草生欧文氏菌ＡＴｃｃ２１９９８的两个２一ＫＲ（２一ＫＲＡ和Ｂ）基 因序列【３ Ｊ，采用ＰＣＲ技术克隆得到两个２一ＫＲ基因（硅以和￡凫ｒＢ）。酶切和浏序证明： 珐ｒＡ发生多处突变，而雎ｒＢ基本保守。由于２一ＫＲ能够利用ＮＡＤＰＨ或ＮＡＤＨ辅酶将 工程菌代谢中重要的中间产物２，５一ＤＫＧ及终产物２一ＫＬＧ转化为副产物５一酮基一Ｄ一葡萄 糖酸（５一ＫＤＧ）和Ｌ一艾杜糖酸（Ｌ—ＩＡ），通过代谢工程研究减少或解除旁路代谢的关键酶能