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中国组织工程研究与临床康复第12卷第16期 2008–04–15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 15, 2008 Vol.12, No.16 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH3115 1College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, ChinaHao Rong-zeng★, Studying for master's degree, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China rongzenghao@ Correspondence to: Ma Bao-hua, Associate professor, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, ChinaSupported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30471828*; the Scientific Research Priming Foundation for Returned Persons of Ministry of Education, No. Jiaowaisiliu[2005] 383*Received:2008-01-02 Accepted:2008-02-13化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测**★郝荣增1,2，刘慧姝2，马保华1Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cellsHao Rong-zeng1,2, Liu Hui-shu2, Ma Bao-hua1AbstractAIM: Researching the pertinent literature in China Journal Full-text Database (CJFD) published between 2005 and 2008 indicatedthat the inhibitory effect of small interference RNA (siRNA) was determined by the transfection efficiency in RNA interference. Atpresent, there are few reports about detection of the transfection efficiency for human WISH cells with chemosynthesis siRNA. Inthis study， we use the flow cytometer detected the transfection efficiency and the effect on apoptosis of WISH cells after chemosynthesis siRNA transfected human WISH cells.METHODS: The experiment was performed at the Experimental Medical Research Center of Guangzhou Medical College fromMarch to December 2007. ①WISH cells were bought from Shanghai Life Science Academy of Chinese Academy Of Sciences. ②WISH cell line was transfected with CY3-Negative siRNA (0, 5, 10, 20, 30 nmol/L). Twenty-four hours later, transfectionefficiencies of different protocols were evaluated by fluorescent microscopy and flow cytometer. Apoptosis of WISH cells wasdetected with Annexin V-EGFP kit after 24-hours 20 nmol/L CY3-Negative-siRNA transfection.RESULTS: Red fluorescence was discovered under the fluorescence microscope with 5, 10, 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNAtransfected WISH cells, and no signals were discovered in control group. The transfection efficiency of 20, 30 nmol/L CY3-NegativesiRNA was remarkably higher than 5, 10 nmol/L CY3-Negative siRNA transfection groups (P < 0.05). There was no significant differencein transfection efficiency between 20 nmol/L and 30 nmol/L siRNA groups (P > 0.05). The apoptosis of WISH cells was detected after24-hours transfection with 20 nmol/L Negative siRNA. The apoptotic rates were 1.96% and 2.36% in the transfection and control groups,respectively. There was no significant difference in apoptosis of WISH cells between transfection group and control group.CONCLUSION：①The chemosynthesis siRNA can transfect human amnion-derive WISH cells successfully, and there is no effecton the apoptosis of WISH cells after transfection. ②Better transfection efficiency can be obtained in 20 nmol/L siRNA transfectedhuman WISH cells.Hao RZ, Liu HS, Ma BH.Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells. Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3115-3118(China)[/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]摘要目的：检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示，RNA干扰研究中，转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果，目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见。
关于三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较【摘要】目的：比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法：利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3，流式细胞仪观察转染效率，普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况，激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果：相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度，细胞内的定位不同，转染效率不同，三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论：荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时，要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.【关键词】荧光标记；siRNA；转染【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for moni toring theirtransfection efficiency with flow cytometry， tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution， transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps totracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.【Keywords】 fluorescence label；small interfering RNA；transfection0 引言化学合成的siRNA可以高效特异地抑制靶基因的表达，不仅是分析基因功能的有力工具且有望成为新型药物［1］，但递送效率低和体内有效性问题仍然是其应用的瓶颈，因此，深入研究其在体内的分布和动力学过程已逐步受到重视［2］.利用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等方法检测荧光标记siRNA［3］，观察其摄取、分布及代谢情况，借以推断无荧光标记siRNA的转染效率和分布. 然而目前虽有多种商品化无沉默效应的荧光标记siRNA可供选择，但它们的分布和转染效率是否一致尚少见报道. 本研究比较三种常用荧光标记siRNA利用脂质体转染时转染效率、荧光淬灭情况和细胞内分布特点，以探讨应用荧光标记siRNA时需注意的问题.1 材料和方法1.1 材料三种荧光siRNA分别为：BLOCK iTTM荧光寡聚物(序列未公开)购自Invitrogen公司；FAM no��target siRNA(正义链5′��UUCUCCGAACGUGUCACGU��3′，FAM标记于5′端)购自广州锐博公司；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA(靶序列5′��AATTCTCCGAACGTGTCACGT��3′，正义链3′端3标记Alexa Fluor 546)购自Qiagen公司. 前两种为即用型，后一种按照说明书方法加入退火缓冲液，90℃变性并退火，分装后避光保存于-20℃. 三种荧光siRNA的储备液浓度均为20 μmol/L. 小鼠胚胎纤维细胞系NIH3T3由中山大学实验动物中心细胞库冻存；高糖DMEM培养基和DPBS购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所；脂质体LipofectamineTM 2000，Opti��MEM低血清培养基购自Invitrogen公司；Hochest33342购自美国Sigma公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂.1.2 方法1.2.1 细胞培养与转染NIH3T3细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清无抗生素高糖DMEM培养基，每孔4×104个细胞接种24孔板，24 h后细胞的汇合度达40％. 用LipofectamineTM 2000转染荧光siRNA，按照说明书操作进行. 不同浓度转染效率时siRNA各组终浓度分别为0.5，5，40，120 nmol/L，LipofectamineTM 2000均为1 μL. siRNA进入细胞速度时转染复合物孵育时间分别为1，2，4，6和24h，siRNA浓度均为40 nmol/L，每组不同时间重复3次；观察淬灭情况和共聚焦观察细胞内分布时采用40 nmol/L，观察时间为4 h.1.2.2 流式细胞仪检测荧光siRNA转染效率各组细胞用DPBS冲洗2次，0.25 g/L胰蛋白酶消化，用DPBS制成150 μL单细胞悬液，冰上运输，BD FACSAria流式细胞仪检测，CellQuest软件记录分析.1.2.3 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式转染后6 h后将24孔板直接置于倒置荧光显微镜(Leica DMIRE)载物台上观察，cold CCD数码相机Leica Qwin软件照相. 拍第一张照片时间记为0 min，分别于3 min和5 min后不改动成像参数同一位置再拍摄两张，观察荧光淬灭情况.1.2.4 激光共聚焦显微镜观察［4］细胞铺板时24孔板中放灭菌圆形盖玻片，转染后6 h培养液中加入Hoechst 33342(终浓度5 mg/L)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，取出爬片，-20℃预冷丙酮固定10 min，PBS洗3遍，抗淬灭水性封片剂封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜40倍物镜下观察，BLOCK��iTTM荧光寡聚物和FAM no��target siRNA使用488 nm激发光和515～540 nm滤片检测；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA使用568 nm激发光和575～640 nm检测滤片.统计学处理：采用SPSS 13. 0统计软件处理，χ2分析转染效率差异，P<0.05为差异具有统计学意义.2 结果2.1 FCM检测荧光siRNA转染效率每一样品收集2×104个细胞，设定一个单细胞区域P1用于荧光分析. 以未转染的细胞作为空白对照，设定阳性细胞区(P2区)使阴性对照P区细胞数不超过0.1%(图1A). 40 nmol/L siRNA转染4 h时转染效率Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率为(62.7±2.4)%， BLOCK��iTTM荧光寡聚物的转染效率为(85.1±5.2)%， FAM no��target siRNA的转染效率为(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率显著低于BLOCK iTTM荧光寡聚物(P=0.037)，BLOCK��iTTM荧光寡聚物的转染效率显著高于FAM no��target siRNA的转染效率(P=0.017)，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率低于FAM no��target siRNA BLOCK��iTTM荧光寡聚物(P=0.000). 随着siRNA浓度增加(图1B)和转染复合物孵育时间延长(图1C)，三种荧光标记siRNA的转染效率增加， 6 h和24 h转染效率相差不大，唯FAM no��target siRNA 24 h转染效率为(59.3±2.5)%. BLOCK��iTTM荧光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L浓度时，转染效率就达FAM��siRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%，孵育1 h和2 h 转染效率达(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%，高于其它两种(P=0.000).2.2 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式三种荧光siRNA在普通荧光显微镜下的荧光模式不同. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA倾向于以较大颗粒分布在核周胞浆内(图2A， B， C， D)；BLOCK��iTTM荧光寡聚物胞浆、胞核中都有，在胞核中的荧光强度很高(图2E，F， G， H)；FAM no��target siRNA为细小点状荧光信号，分布于胞浆和胞核中(图2I， J， K， L). 用荧光显微镜照射3 min(图2C， G， K)和5 min(图2D， H， L)发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA抗淬灭能力最高，BLOCK��iTTM荧光寡聚物居中，FAM no��target siRNA最低，3 min已几乎完全淬灭. BLOCK��iTTM荧光寡聚物胞浆中的荧光信号先淬灭，而后是胞核中的. 无siRNA只加LipofectamineTM 2000转染试剂的细胞未见荧光(结果未显示).2.3 激光共聚焦显微镜观察三种荧光siRNA细胞内定位40 nmol/L各种siRNA转染后4 h，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA为点状的荧光，多数位于近核胞浆中(图3A，D)；BLOCK��iTTM荧光寡聚物(图3B，E)和FAM no��target siRNA(图3C，F)的模式相似，在核内和胞浆中都可见，部分呈荧光颗粒.3 讨论脂质体转染是体外导入化学合成siRNA的标准方法，siRNA体外转染实验报道中使用最多的转染试剂是LipofectamineTM 2000，对许多细胞可以获得很高的转染效率和基因沉默效率［3］，所以本研究也选用该试剂作为转染试剂比较三种荧光标记siRNA的体外转染特性.本实验发现在相同的转染条件下，三种荧光siRNA的转染效率不同；BLOCK��iTTM荧光寡聚物更易进入细胞，原因可能因为它的核糖骨架经过磷硫酰化修饰［5］，所以其进入细胞的速度明显增加. 转染6 h和24 h的效率相差不大，可见LipofectamineTM 2000推荐4 h和6 h更换转染复合物比较合理，但注意到Alexa Fluor 546阴性对照siRNA 4 h和6 h的转染效率相差仍比较明显，所以6 h更换转染复合物更加合适. FAM no��target siRNA 24 h转染效率降低为59.3%，原因可能是荧光素淬灭而非转染效率低.关于淬灭情况：标记siRNA的荧光物质有许多种，最早有荧光素(fluorescein，FAM)，后来的藻红素(cy系列)，alexa系列的荧光稳定性和可选择波长更进了一步. 本研究三种荧光siRNA中荧光素FAM no��target siRNA采用的是FAM标记，BLOCK��iTTM荧光寡聚物采用的FITC，似乎都为荧光素，但后者经磷硫酰化修饰，稳定性增强，所以其抗淬灭能力也有所增强. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA采用的是Alexa fluor546，其中Alexa fluor546标记的siRNA的抗淬灭能力最强.关于细胞内的定位：脂质体转染情况下，siRNA脂质体复合物首先沉积并粘附于细胞表面，然后通过胞吞作用进入细胞形成内含体，在胞浆中通过动力蛋白驱动定向运送到核周区，并迅速在核周区聚集［6］，最后siRNA从脂质体复合物中释放出来才能发挥作用. 本研究中用共聚焦显微镜观察发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA几乎只以颗粒状分布于近核胞浆中，与Chiu等［3］报道的用LipofectamineTM 2000转染cy3标记的siRNA结果一致，而BLOCK��iTTM荧光寡聚物和FAM no��target siRNA在核内和胞浆中都有，在胞浆中核周区可见大的荧光颗粒. 其中BLOCK��iTTM荧光寡聚物的核定位考虑与其磷硫酰化修饰有关，而FAM no��target siRNA为正义链5′标记，其核定位可能为与其复合物中混合有单链siRNA有关. Ohrt等［7］显微注射荧光标记的siRNA入Hela细胞的胞浆中，发现双链siRNA不能进入细胞核，而单链siRNA有明显聚集于核内的倾向. 而Alexa Fluor 546阴性对照siRNA未于见核中可能因为siRNA还未从脂质体复合物中释放. 而siRNA从复合物中释放是与基因沉默效果相关的，是否说明荧光标记影响基因沉默效果还有待分析.综上所述，选取合适的荧光标记siRNA作为转染效率评估指标和用于细胞内分布研究时，要注意荧光标记物对siRNA的影响，以及靶向目的基因的siRNA与所选用荧光标记的对照siRNA在化学修饰等因素方面的相似性.参考文献［1］Dykxhoorn DM， Lieberman J. Running interference: Prospects and obstacles to using small interfering RNAs as small molecule drugs［J］. Annu Rev Biomed Eng， 2006， 8:377-402.［2］Corey DR. RNA learns from antisense［J］. Nat Chem Biol，2007， 3(1): 8-11.［3］Chiu YL， Ali A， Chu CY， et al. Visualizing a correlation between siRNA localization， cellular uptake， and RNAi in living cells ［J］. Chem Biol， 2004， 11(8):1165-1175.［4］Akita H， Ito R， Khalil IA， et al. Quantitativethree��dimensional analysis of the intracellular trafficking ofplasmid DNA transfected by a nonviral gene delivery system usingconfocal laser scanning microscopy［J］. Mol Ther， 2004， 9(3):443-451.［5］Fisher TL， Terhorst T， Cao X， et al. Intracellular disposition and metabolism of fluorescently��labeled unmodified and modified oligonucleotides microinjected into mammalian cells［J］. Nucleic Acids Res， 1993， 21(16):3857-65.［6］Iwasa A， Akita H， Khalil I， et al. Cellular uptake and subsequent intracellular trafficking of R8liposomes introduced at low temperature［J］. Biochim Biophys Acta， 2006， 1758(6):713-720.［7］Ohrt T， Merkle D， Birkenfeld K， et al. In situ fluorescence analysis demonstrates active siRNA exclusion from the nucleus by Exportin 5［J］. Nucleic Acids Res， 2006， 34(5):1369-1380.。
化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测郝荣增;刘慧姝;马保华【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)016【摘要】目的:检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示,RNA干扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果,目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见.实验应用化学合成siRNA转染人羊膜WISH细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响.方法:实验于2007-03/12在广州医学院试验医学研究中心完成.①实验材料:实验中应用的人羊膜WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所.②实验方法:应用0,5,10,20,30 nmol/L化学合成的CY3-Negative siRNA转染人羊膜WISH细胞,转染后24 h应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA转染细胞24 h后,应用Annexin V-EGFP试剂盒检测细胞早期凋亡情况.结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号.20 ,30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于5,10 nmol/L组(P < 0.05);20 nmol/L和30 nmol/L siRNA组转染效率差异不显著(P > 0.05).检测20 nmol/L Negative siRNA转染细胞24 h后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早期凋亡率分别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著.结论:①化学合成的siRNA可以成功转染人羊膜WISH细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响.②20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果.【总页数】4页(P3115-3118)【作者】郝荣增;刘慧姝;马保华【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西省杨凌,712100;广州医学院第三附属医院,广州市妇产科研究所,广东省广州市,510150;广州医学院第三附属医院,广州市妇产科研究所,广东省广州市,510150;西北农林科技大学动物医学院,陕西省杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较 [J], 王巍;张晓希;刘新光2.Smad2特异性siRNA转染肝星状细胞的效率检测 [J], 罗海峰;王洪江;王忠裕3.靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米载体介导siRNA质粒对肝癌细胞BEL-7402的转染效率检测 [J], 聂常富;韩风;张玲;庞春;王云检;陈规划4.Gal-PEG-PEI/psiRNA肝靶向性纳米基因载体对人胎肝细胞系L-02细胞的转染效率检测 [J], 聂常富;张彤;陈规划;韩风;邱大鹏;王云检;庞春5.体外化学合成bcl-2 siRNA及脂质siPORT脂质体转染siRNA至细胞HL-60的鉴定 [J], 燕春艳;雷小勇;涂玉林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
siRNA的制备⽅法及各种⽅法优缺点分析siRNA的制备⽅法及各种⽅法优缺点分析越来越多的研究⼈员开始采⽤⼩分⼦⼲扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因表达。
siRNA是⼀种短⽚断双链RNA分⼦，能够以同源互补序列的mRNA 为靶⽬标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA⼲扰途径（RNA interference pathway）。
RNAi的应⽤包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信号传导通路分析等等。
⽬前为⽌较为常⽤的5种制备siRNAs的⽅法包括·化学合成·体外转录·长⽚断dsRNAs经RNase III 类降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)·siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs·PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达前⾯3种⽅法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导⼊哺乳动物细胞后⾯两种⽅法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。
每种⽅法都有⾃⼰的优点和缺点。
哪种是最好的⽅法，其实取决于实验⽬的。
这⾥简单介绍这5种⽅法，优点和缺点，以及它们最适合的应⽤。
siRNA的设计除了⽅法3以外，其他的⽅法都在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。
关于怎样设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。
但这仍然不是精确的。
通常来说，每个⽬标序列设计3—4对siRNAs，在后⾯的实验中选择最有效的那个。
⽹上有提供免费的siRNA设计⼯具。
体外制备1.化学合成尽管化学合成是最贵的⽅法，但是却是最⽅便的——研究⼈员⼏乎不需要做什么⼯作。
包括Ambion和Qiagen公司都可以根据⽤户要求提供⾼质量的化学合成siRNA。
主要的缺点包括价格⾼，定制周期长，特别是有特殊需求的。
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度金小花;秦高【摘要】目的：探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数（ multiplicity of infection，MOI）及BSD基因筛选抗生素（ blasticidin）浓度。
方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120（ TU number／cell）分别侵染INS-1空白细胞，培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率（％）及死亡率（％），以确定最佳MOI值。
小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg／mL blasticidin，第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率，以确定细胞抗生素敏感浓度。
使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒（病毒滴度：1×108 TU／mL）按照最佳MOI值侵染细胞，并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选，获得混合系细胞。
当细胞的荧光率达90％时，进行单克隆稳转细胞系的构建。
结果最佳MOI值为60，此时细胞的荧光率达100％，但细胞的死亡率＜0.5％，细胞保持原有的形态。
当blasticidin敏感浓度为2μg／mL，此时空白细胞失去原有的贴壁性，全部死亡。
INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58，且siRNA的干扰效率为77.78％，siRNA 成功表达，混合稳转细胞系构建成功。
成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。
结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。
%Objective To optimize multiplicity of infection ( MOI) and antibiotics ( blasticidin) concentration selecting BSD gene in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.Methods The INS-1 cells were transfected byfluorescence labeled negative control SGMS2-siRNA lentivirus at MOI of 0, 10, 30, 60 and 120 TU number/cell.The cells were photographed under fluorescent microscopy after 72 h cultivation, then fluorescence ratio and apoptosis rate were calculated to determine optimal MOI.The INS-1 cells were treated by blasticidin with different concentrations of 0, 1, 2, and 3 μg/mL, and the apoptosis rate was observed to acquire optimal concentration of antibiotics.The INS-1 cells were transfected by negative control SGMS2-siRNA lentivirus and SGMS2-siRNA lentivirus (virus titer:1 ×108TU/mL) at optimal MOI and positive-transfected cells were selected by blasticidin at optimal concentration, then mixed cell lines were acquired.The monoclonal cell line was constructed at fluorescence ratio of 90%.Results The optimal MOI was 60 with 100% fluorescence ratio, less than 0.5% apoptosis rate and keep original cellular morphology.The optimal concentration of blasticidin was 2 μg/mL with cell adherence disappear and all cells apoptosis.The Ct value of INS-1-SEMS2 cells detected at the second time was 28.21, which was greater than 27.58 at the first time.The interfering efficiency of siRNA was 77.78% which indicated a successful expression of siRNA and construction of monoclonal stable cell line ( INS-1-SEMS2 ).Conclusion The monoclonal stable cell line was successfully constructed by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】4页(P51-53,56)【关键词】小鼠胰岛素瘤INS-1细胞;感染复数;BSD基因筛选抗生素;细胞稳转株【作者】金小花;秦高【作者单位】苏州农业职业技术学院食品科学系化学与生物技术教研室，苏州215008;上海诺百生物科技有限公司，上海 200233【正文语种】中文【中图分类】Q78在动物细胞学和分子学试验中，将外源目的基因通过病毒介质转入动物细胞中，是一个非常重要的试验步骤[1]。
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Masercycler；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler和BIOER的LineGene系列。
筛选介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳试剂王玉洁;吴韶菊;吴芹【摘要】背景:理想的细胞转染试剂应具有高效安全的特点.目的:筛选能够高效介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳转染试剂.方法:应用Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导FAM-siRNA和多药耐药基因MDR1siRNA转染原代肝癌细胞,分别于转染6和48 h后应用流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测转染效率,然后用MTT法检测3种转染试剂处理原代肝癌细胞24 h后的细胞毒性.结果与结论:对于Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导的FAM-siRNA 和MDR1siRNA转染,流式细胞仪和实时荧光定量PCR仪检测出RNAiMAX转染效率最高(P < 0.05),分别为70.3%和71.5%.MTT法检测结果表明RNAiMAX对原代肝癌细胞没有表现出细胞毒性.结果提示,由于RNAiMAX介导的FAM-siRNA 和MDR1 siRNA转染的效率最高,并且对细胞的毒性最小,所以RNAiMAX是最适合介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的转染试剂.%BACKGROUND: The ideal transfection agent should efficient and low-toxic.OBJECTIVE: To screen transfection agent which efficiently transfect chemosynthesis siRNA to primary liver cancer cells.METHODS: FAM-siRNA and MDR1 siRNA was transfected to primary liver cancer cells by LipofectamineRNAiMAX,Lipofectamine 2000 and DharmaFECT1. The transfection efficiency was evaluated by flow cytometer and real time-PCR at 6 and 48 hours after transfection. Moreover, the cytotoxicity of transfection agents in primary liver cancer cells was tested by MTT method.RESULTS AND CONCLUSIONS: The results of flow cytometer and real time-PCR indicatedthat, the transfection efficiency of siRNA tranfection to primary liver cancer cells mediated by RNAiMAX was highest (P ＜ 0.05), which was 70.3％ and 71.5%,respectively. The cytotoxicity of RNAiMAX in primary liver cancer cells did not show in MTT detection (P ＜ 0.05). RNAiMAX was suitable to transfect siRNA to primary liver cancer cells because the efficiency of siRNA tranfection to primary liver cancer cells mediated by RNAiMAX was the highest and the cytotoxicity of RNAiMAX in primary liver cancer cells was the lowest.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)002【总页数】4页(P245-248)【关键词】原代肝癌细胞;siRNA;转染;Lipofectamine RNAiMAX;Lipofectamine 2000;DharmaFECT1;组织工程【作者】王玉洁;吴韶菊;吴芹【作者单位】临沂师范学院生命科学学院,山东省临沂市,276005;临沂师范学院生命科学学院,山东省临沂市,276005;临沂市第四人民医院精神科,山东省临沂市,276005【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言RNA干扰(siRNA)是含19～21个核苷酸的小分子RNA片段，介导双链RNA进入细胞内，特异性识别并降解其同源基因，达到诱导靶基因表达抑制或沉默，并且siRNA成为研究基因在肝癌发生和发展中功能的重要工具[1-2]。
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
