高效液相色谱法测定婴儿配方奶粉中乳铁蛋白含量.

高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽魏敏，李兴佳，柴艳兵，李飞，刘丽，张耀广*（石家庄君乐宝乳业有限公司，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，河北石家庄 050021）摘 要：建立一种高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）含量的方法。

对3 种样品前处理方法及2 种上机条件进行优化，确定最优条件。

结果表明：最优前处理条件为用盐酸（1 mol/L）调节乳粉样品溶液pH 4.6后用水转移至50 mL容量瓶中，用滤纸过滤后作为待测液；上机检测时用0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系进行梯度洗脱；样品加标回收率为94.50%～95.45%，线性良好（R2=0.999 8），方法检出限为2.0 mg/100 g。

该方法样品前处理简单、稳定性和可靠性好，检测结果满足线性、精密度、准确度及检出限要求，可用于婴幼儿配方乳粉中CPP含量的测定。

关键词：婴幼儿配方乳粉；高效液相色谱法；酪蛋白磷酸肽Determination of Casein Phosphopeptides in Powdered Formulae for Infants and Young Children byHigh Performance Liquid ChromatographyWEI Min, LI Xingjia, CHAI Yanbing, LI Fei, LIU Li, ZHANG Yaoguang*(Key Laboratory of Dairy Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shijiazhuang Junlebao Dairy Co. Ltd.,Shijiazhuang 050021, China)Abstract: An analytical method was developed for the determination of casein phosphopeptides (CPP) in powdered formulae for infants and young children by high performance liquid chromatography. Three pretreatment methods and two operating conditions were optimized. The results showed that the optimal pretreatment conditions were as follows: transferring samples to a 50 mL volumetric flask after pH adjustment to 4.6 with 1 mol/L hydrochloric acid, and then filtering them through a filter paper. The chromatographic separation was carried out by gradient elution using 0.05% trifluoroacetic acid as mobile phase A and 0.05% acetonitrile as mobile phase B. The spiked recovery was between 94.50% and 95.45%, good linearity was observed with R2 = 0.999 8, and the detection limit was 2.0 mg/100 g. The method had the advantages of simple sample pretreatment as well as good stability and reliability, and the results from this method met the requirements in terms of linearity, recovery, accuracy, precision and detection limit. Thus it could be used to determine the content of CPP in powdered formulae for infants and young children.Keywords: powdered formulae for infants and young children; high performance liquid chromatography; casein phosphopeptidesDOI:10.15922/ki.jdst.2019.05.005中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2019）05-0021-04引文格式：魏敏, 李兴佳, 柴艳兵, 等. 高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽[J]. 乳业科学与技术, 2019, 42(5): 21-24. DOI:10.15922/ki.jdst.2019.05.005. WEI Min, LI Xingjia, CHAI Yanbing, et al. Determination of casein phosphopeptides in powdered formulae for infants and young children by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2019, 42(5): 21-24. DOI:10.15922/ki.jdst.2019.05.005. 收稿日期：2019-06-12基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFC1604302）第一作者简介：魏敏（1983—）（ORCID: 0000-0002-8753-8633），女，中级工程师，本科，研究方向为乳品质量与安全。

乳制品中乳铁蛋白的测定作者：章寅高磊郑隽等来源：《现代农业科技》2013年第16期摘要采用高效液相色谱法建立了乳制品中乳铁蛋白测定的分析方法。

试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，提取液经肝素亲和柱净化后，采用反相高效液相色谱柱分离，以二极管阵列检测器于280 nm处检测，采用外标法定量。

结果表明：乳铁蛋白在10.0～1 000.0 ug/mL 范围内线性良好，添加回收率为75 %～110 %，相对标准偏差（RSD）小于20%。

该方法具有灵敏度高、准确度高、重现性好的特点，适合检测机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测。

关键词乳铁蛋白；高效液相色谱法；肝素亲和柱中图分类号 TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）16-0291-02乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度最快的一种营养添加剂，由于其具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁平衡、调解骨髓细胞的生成、抑制人体肿瘤细胞、同多种抗生素及抗真菌制剂协同有效治疗疾病等功效，使其产品在国内外乳制品加工中的应用范围日益广泛[1-3]。

我国《食品营养强化剂使用标准（GB14880-2012）》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0 g/kg，而目前国内外未建立与乳制品中乳铁蛋白测定相关的国家标准。

为保证乳铁蛋白的安全生产和使用，该文建立了乳制品中乳铁蛋白的检测方法，最大限度地保证市场中乳铁蛋白添加型产品的安全和质量水平，以保证乳制品安全，促进行业健康发展[4]。

1 材料与方法1.1 供试材料、试剂与仪器1.1.1 供试材料。

供试材料为婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉。

1.1.2 试剂与仪器。

Agilent 1200 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。

肝素亲和柱（美国通用医药有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Sigma公司产品），无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（分析级，国药集团化学试剂有限公司产品）。

高效液相色谱法检测婴幼儿奶粉中的乳糖摘要:本文介绍了高效液相色谱法在婴幼儿奶粉中检测乳糖的重要性和应用。

首先介绍了乳糖的重要性，包括其在婴幼儿奶粉中的作用和营养意义。

然后介绍了高效液相色谱法作为一种有效的分析方法，并介绍了使用的工具和仪器设备。

接下来详细描述了高效液相色谱法的步骤和原理，包括样品制备、色谱柱选择、流动相组成和检测方法。

最后，阐述了高效液相色谱法在婴幼儿奶粉中检测乳糖的应用，包括定量分析和质量控制等方面。

关键词：乳糖；婴幼儿奶粉；高效液相色谱法；定量分析；质量控制引言：婴幼儿奶粉是婴幼儿成长发育过程中重要的营养补充品。

其中的乳糖作为主要成分之一，在婴幼儿的能量供应、肠道健康和骨骼发育中起着重要作用。

为了确保婴幼儿奶粉的质量和安全性，乳糖的定量分析以及相关的质量控制措施显得尤为重要。

在这方面，高效液相色谱法作为一种可靠的分析方法被广泛应用。

本文将介绍乳糖的重要性，高效液相色谱法的仪器设备，乳糖的定量分析步骤以及婴幼儿奶粉质量控制的关键措施。

一、乳糖的重要性乳糖在婴幼儿奶粉中扮演着关键的角色，对于婴幼儿的健康和发育具有重要的影响。

作为婴幼儿奶粉的主要成分之一，乳糖提供了宝宝所需的能量和营养。

乳糖是一种碳水化合物，能够为婴幼儿提供能量。

在婴幼儿期，他们的能量需求相对较高，用于维持正常的生长、发育和活动。

乳糖作为能量的来源，为婴幼儿提供了必要的热量和碳水化合物供应，支持他们健康成长。

乳糖对于调节肠道菌群起着重要作用。

婴幼儿的肠道菌群在早期发育阶段尤为重要，它们对于消化和吸收营养、防止有害菌滋生、维护免疫系统等起着关键的作用。

乳糖的消化过程中会产生有益的短链脂肪酸，这些物质能够促进益生菌的生长，维持肠道菌群的平衡，有利于婴幼儿的肠道健康和免疫系统的发育。

乳糖也对钙的吸收和骨骼发育起着重要的促进作用。

钙是婴幼儿骨骼发育所必需的关键营养素，对于形成健康的骨骼和牙齿至关重要。

乳糖在消化过程中能够促进钙的吸收和利用，有助于维持钙的平衡，并支持婴幼儿骨骼的正常生长和发育[1]。

乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究陈柔含，韩奕奕，马颖清，刘 洋，丰东升*上海市农产品质量安全中心曁农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708摘 要：[目的]探讨两种不同检测方法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的含量及应用研究。

[方法]对比高效液相色谱（HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（UPLC- MS/MS）法测定生鲜乳、调制乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和奶粉样品等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量，并对测定结果进一步比较和分析原因。

[结果]两种测定方法均具有较高回收率和较优的重现性，但两者方法对实际样品的测定结果具有一定差异性。

[结论]HPLC法测定牛乳铁蛋白是通过肝素亲和柱纯化富集乳铁蛋白，测定的是非热变性牛乳铁蛋白的含量；而UPLC-MS/MS法测定的是热变性和非热变性牛乳铁蛋白的含量，不受热处理加工工艺的影响。

实验室可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。

关键词：牛乳铁蛋白；液相色谱；质谱；乳及乳制品文章编号：1671-4393（2022）09-0095-07 DOI:10.12377/1671-4393.22.09.190 引言牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的铁结合型大分子糖蛋白，其分子量为78~80 kDa。

由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸与赖氨酸，故其等电点在7.8~8.2，是一种呈碱性的蛋白质[1]，主要由动物的乳腺上皮细胞分泌及表达。

乳铁蛋白（LF）与铁转运和储存密切相关，且对免疫功能系统的调节具有正向作用，同时拥有广谱抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等强大的生物功能，因此被媒体报道为“奶黄金”。

在自然界中，人的母乳中LF的含量较高，在1.0~3.0 mg/mL的范围内[2]，而牛初乳中的含量相对较低。

因此商业上很多基金项目：上海市科委项目“乳及乳制品中乳铁蛋白等活性物质检测技术研究及其应用”（19391902700）作者简介：陈柔含（1996-），女，浙江台州人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；韩奕奕（1972-），女，上海人，硕士，正高级畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；马颖清（1984-），女，上海人，硕士，畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；刘 洋（1994-），女，河北承德人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究。

高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽含量李则均【摘要】采用高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPPs)含量.样品前处理采用超声提取,盐酸调节pH值4.4~4.6沉淀酪蛋白.流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脱.试验结果表明,在波长254 nm条件下,目标物CPPs保留时间为24.408 min.试验使用检出范围为30~300μg/mL,在此范围内CPPs呈良好的线性,线性回归方程y=375.82x+7385.4,R2>0.9997.加标回收率在96.8%~107.3%.试验的计算标准偏差为3.3,相对偏差为0.49%.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2017(000)002【总页数】5页(P66-70)【关键词】酪蛋白磷酸肽(CPPs);紫外高效液相色谱法;婴幼儿配方羊奶粉【作者】李则均【作者单位】黑龙江完达山乳品有限公司【正文语种】中文酪蛋白磷酸肽简称CPPs，是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，其核心结构为丝氨酸、谷氨酸、磷酸基。

CPPs在中性和弱碱性环境下能与钙结合，避免钙的流失，促进钙的吸收。

CPPs对钙促吸收的作用主要表现在促进小肠对钙的吸收利用，促进牙齿、骨骼发育。

CPPs还对铁、锌有很好的吸收利用效果。

CPPs是从天然蛋白质中提取的多肽，具有不良反应小、安全可靠、致敏率低等特点。

婴幼儿配方羊奶粉营养成分更接近人乳，更易被人体吸收，因此近年来婴幼儿配方羊奶粉拥有广阔市场。

综上所述，在婴幼儿配方羊奶粉中添加CPPs有很广泛的前景。

CPPs的测定方法一般采用LC-MS或者毛细管区带电泳法。

前者检测成本高，不适用于企业批量生产的婴幼儿配方羊奶粉中CPPs的测定。

后者操作复杂，婴幼儿配方羊奶粉含有强化钙、铁、锌等金属盐类成分，CPPs与这些盐类成分相干扰，很难测定。

本文采用高效液相色谱法，尝试建立一种高效更适用于婴幼儿配方羊奶粉中CPPs的含量测定方法。

奶制品一直是人们饮食中重要的营养来源，其中的乳铁蛋白更是备受关注。

乳铁蛋白是一种在乳制品中富含的蛋白质，具有丰富的营养成分和重要的药理作用。

然而，乳铁蛋白的测定一直是个难题，而液相色谱法是一种常用的测定方法。

在接下来的文章中，我将通过深度和广度兼具的方式来探讨奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，并共享我对这个主题的个人观点和理解。

让我们来了解一下乳铁蛋白。

乳铁蛋白是奶制品中的一种重要蛋白质，它不仅具有良好的营养价值，还具有抗菌、抗病毒和抗氧化等多种药理作用。

对乳铁蛋白的测定具有重要的意义。

液相色谱法作为一种高效、灵敏度高、选择性好的分析方法，已经成为乳铁蛋白测定的首选方法之一。

接下来，我将从液相色谱法的基本原理和操作流程开始介绍。

液相色谱法是一种利用溶液在固定相与移动相作用下分离、纯化混合物的物理化学方法。

在乳铁蛋白的测定中，可以使用反相液相色谱法和离子交换液相色谱法。

在操作流程上，首先需要提取样品中的乳铁蛋白，然后采用适当的色谱柱和色谱条件进行分离和检测，最后利用标准曲线法计算样品中乳铁蛋白的含量。

这种方法的优点在于准确性高、重复性好、操作简便、对样品的前处理要求低等。

让我们来谈谈乳制品中乳铁蛋白测定液相色谱法的应用和发展现状。

液相色谱法在乳铁蛋白的测定中已经得到了广泛的应用，尤其在乳制品加工和质量控制中具有重要的实际意义。

随着科学技术的不断发展，液相色谱法在乳铁蛋白测定中也在不断完善和提高，例如采用高效液相色谱法、超高效液相色谱法等新技术，可以更加快速、准确地测定乳铁蛋白的含量。

我还想强调乳铁蛋白的测定对于保障乳制品的质量和安全至关重要。

乳铁蛋白不仅是乳制品中的重要营养成分，更是对乳制品质量的重要指标之一。

利用液相色谱法对乳铁蛋白进行准确、快速地测定，有助于提高乳制品的品质和竞争力，有效保障消费者的健康。

对于奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，我的个人观点是，这是一项非常重要的研究课题，对于乳制品行业的发展和消费者健康都具有重要意义。

高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量羊　银，张瑞华，刘　莹*（天津市食品安全检测技术研究院，天津 300308）摘 要：建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。

乳粉经尿素溶液溶解稀释，胰蛋白酶酶解，过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱，高效液相色谱-串联质谱仪测定。

结果表明，A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL-1线性范围内，相关系数（R2）均≤0.99，检出限为0.05～0.10 g·kg-1；定量限为0.2～0.5 g·kg-1；平均回收率在92.08%～105.29%；平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。

随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定，得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg-1。

关键词：婴幼儿配方乳粉；A2 β-酪蛋白；A1 β-酪蛋白；高效液相色谱-串联质谱法Determination of A1 and A2 β-Casein in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryYANG Yin, ZHANG Ruihua, LIU Ying*(Tianjin Institute for Food Safety Inspection Technology, Tianjin 300308, China) Abstract: To establish a method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）to detect A1 and A2 β-casein in infant formula milk powder. The milk powder was dissolved and diluted in urea solution, hydrolyzed with trypsin, and filtered to be determined. The samples were separated on ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column by water containing 0.1%(by volume) formic acid and methanol containing 0.1%(by volume) formic acid, and determined by HPLC-MS/MS. The results showed that the correlation coefficients (R2) of A1 and A2 β- casein were all greater than 0.99 in the corresponding linear range of 0.02～2.00 mg·mL-1. The limits of detection ranged from 0.05 to 0.10 g·kg-1. The limits of quantitation ranged from 0.2 to 0.5 g·kg-1. Average recovery rate were 92.08%～105.29%, relative standard deviation was 1.5%～7.9%. The contents of A1 β- casein and A2 β- casein ranged from 0 to 30.3 g·kg-1 in 10 brands of infant formula milk powder.Keywords: infant formula milk powder; A2 β-casein; A1 β-casein; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry酪蛋白是广泛存在于牛乳、羊乳及人乳等乳及其制品中的一类蛋白质，是由多种不同的氨基酸组成的多肽链，具有抗菌、免疫调节、营养供给等多种生物活性。

w w w .c h i n a d a i r y .n e t z g r p g y @163.c o m中国乳品工业收稿日期：2019-02-26作者简介：李莉（1981-）女，副研究员，研究方向为食品、化妆品质量与安全性评价。

通讯作者：李硕0引言乳铁蛋白(L a c t o f e r r i n ，简称L F )是一种非血红素铁结合糖蛋白，是从乳汁中提取的一种天然物质。

人初乳中乳铁蛋白质量浓度为5~7g /L ，常乳中为1~3g /L 。

牛乳中乳铁蛋白质量浓度较母乳低，牛初乳为0.8g /L左右，牛常乳中为0.1~0.4g /L [1]。

乳铁蛋白具有广谱抗菌性，调节体内铁平衡，抑制肿瘤细胞生长等生物活性[2]，是母乳中对婴幼儿免疫功能非常重要的一种营养物质。

我国食品安全国家标准《食品营养强化剂使用标准》G B 14880-2012中将其列为营养强化剂，允许在婴幼儿配方食品中使用[3]。

国外婴儿配方奶粉中乳铁蛋白的添加量基本在0.5g /k g 左右[4]，按照G B 14880-2012规定，婴幼儿配方食品中乳铁蛋白允许添加量≤1.0g /k g。

目前市场上的婴幼儿配方食品质量参差不齐，由于乳铁蛋白价格昂贵，不乏有不良生产者生产的食品中乳铁蛋白实际添加量低于标签标示水平的情形[5]。

但由于我国尚未发布食品中乳铁蛋白含量测定的食品安全国家标准，对于市售声称添加乳铁蛋白的婴幼儿配方食品中是否含有乳铁蛋白，以及含量是否符合标签标示范围，不仅是消费者关心的问题，更是食品安全监管人员为形成有力监管亟待解决的技术瓶颈。

目前，国内外文献中乳铁蛋白的主要检测方法有高效液相色谱法[6-11]、高效液相色谱串联质谱法[12]、毛细管电泳法[12]、分光光度法[13-14]、酶联免疫吸附法[15-19]等，我国目前尚未出台婴幼儿配方食品中乳铁蛋白检测食品安全国家标准，检测方法的空白依然是限制乳铁蛋白应用及深入研究的主要技术瓶颈。

高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白苏米亚;刘翠平;陈文亮【摘要】目的:建立高效液相色谱(HPLC)方法检测婴幼儿配方乳粉中变性和非变性的α-乳白蛋白.方法:使用盐酸胍缓冲液作为样品溶解液和HPLC流动相,用巯基乙醇作为还原试剂对样品进行前处理,以母乳样品为内标,使用TSK-GEL G3000SWXL 柱,用紫外检测法在280nm波长处对洗脱物进行分析.结果:此方法可以准确测定喷雾干燥工艺加工后婴幼儿配方乳粉中的α-乳白蛋白含量,且分离效果好,分析所用的时间约为20min.结论:该方法快速、准确,适用于婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白的检测.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2012(035)005【总页数】3页(P15-17)【关键词】α-乳白蛋白;高效液相色谱(HPLC);婴幼儿配方乳粉【作者】苏米亚;刘翠平;陈文亮【作者单位】光明乳业股份有限公司乳业研究院,乳业生物技术国家重点实验室,上海 200436【正文语种】中文【中图分类】TS252.7母乳是婴幼儿最理想的食品，能够提供婴儿生长发育所需的各种营养物质 [1]。

对婴幼儿来说，母乳不足时，最重要的营养来源是婴幼儿配方乳粉，婴幼儿配方乳粉的营养成分标准也是以母乳作参考的。

对于婴幼儿配方乳粉，提高其α-乳白蛋白含量接近母乳水平，成为许多婴幼儿配方乳粉配方设计的重要内容。

与此同时，婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的检测也成为研究的重点。

目前检测婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量尚无国标方法，对α-乳白蛋白含量较高的乳清蛋白原料中α-乳白蛋白的检测方法有HPLC法[2-4]、酶联免疫法、SDS-聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法和毛细管电泳法[5-7]。

但以上各种方法在测定α-乳白蛋白时都有一定的局限性，如ELISA方法对试剂的选择性高，婴幼儿配方乳粉中配方复杂，蛋白质种类很多，很难有效的准确检测；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法属于半定量法，能够检测出变性的α-乳白蛋白，但不能精确定量；技术上的局限性限制了这些方法在实践中推广应用。