叶绿素a的测定

叶绿素-a的测定方法原理（荧光分光光度法）用丙酮溶液提取浮游植物色素进行荧光测定，根据提取液酸化前后的荧光值，可分别计算叶绿素-a及脱镁色素的含量。

试剂及其配置1、丙酮溶液（9+1）：量取900ml丙酮与100ml水混合，保存在棕色试剂瓶中。

2、碳酸镁悬浮液（10g/L）:称取1g碳酸镁，加水至100ml，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需要再摇匀。

3、盐酸：=1.18g/ml4、盐酸溶液（5+95）：在搅拌下，将5ml盐酸缓慢的加到95ml水中，混匀，保存于滴定瓶中。

5、硅胶仪器及设备1、荧光计2、冰箱3、离心机4、电动吸引器5、过滤装置6、玻璃纤维滤膜：直径为25mm的WhatmanGF/C或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜7、具塞离心管：容量10ml8、干燥器9、棕色试剂瓶：容量100ml，1000ml10、量筒：容量100ml、200ml、1000ml11、定量加液器：容量10ml12、镊子一般实验室常用设备分析步骤1、样品制备量取一定体积海水（通常大洋水250ml-500ml，近岸或港湾水50-100ml），加2ml 碳酸镁悬浮液，混匀，用玻璃纤维滤膜或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜过滤，过滤负压不得2超过50KPa.2、样品提取将过滤了的样品的滤膜放入具塞离心管，加入10ml丙酮溶液，摇荡，放置冰箱冷藏室14-24h，提取叶绿素-a。

若虑得的样品不能及时提取，应该将滤膜抽干、对折，再套上一张滤纸置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1摄氏度的冰箱中。

3、样品离心离心速度：（3000-4000）r/min离心时间:10min4、样品测定荧光计激发波长为436nm,发射波长670nm零点调节：用丙酮溶液调节，使荧光计指针指零。

将提取的上层提取液注入测定池。

选择相应量程，测定样品的荧光值R b。

加2滴盐酸溶液至测定池，摇匀，经30s后再测其荧光值Ra。

5、仪器校正用标准叶绿素-a校正。

用分光光度计校正：取一定体积正处于指数增长期的单细胞藻类培养液，依上述方法提取其叶绿素-a，用分光光度法测定，计算该提取液的叶绿素-a浓度。

叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。

（二）水样的采集与保存1.确定具体采样点的位置2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL5.将采样瓶拧上并编号6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器：1.分光光度计2.比色池：10mm3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm）4.研钵5.常用实验设备试剂：1.碳酸镁悬浮液：1%。

称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。

每次使用时要充分摇匀2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。

将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。

（五）实验步骤1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。

2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。

3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。

将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。

此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。

4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。

水体叶绿素a测定方法文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-叶绿素a的测定方法——乙醇+分光光度法1、水样的保存水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。

若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h），则应置于0℃~4℃低温下保存。

水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L。

2、抽滤在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。

抽滤时负压应不大于50kPa。

抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。

如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。

在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20℃低温冰箱中可保存30天。

3、提取研磨可用玻璃研钵。

将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7~8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。

将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。

用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml。

盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h。

4、离心将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500~4000rpm，离心10~15min。

将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。

最后将提取液定容到10ml。

如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h，取其清液即可。

5、测定用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度计零点）。

测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A1；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A2.则提取液中叶绿素a的浓度为：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脱镁叶绿素浓度为：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L；V提取液为提取液的最终定容体积,单位为mL；V为抽滤水样的体积，单位为L。

叶绿素a测定仪使用方法简介叶绿素是一种广泛存在于光合生物中的生物色素，其结构主要由两个部分组成：色素分子和中央离子镁离子（Mg2+）。

其中，叶绿素a是光合作用中最重要的光合色素之一。

叶绿素a的含量检测是研究光合作用强度和生产力的重要手段。

而叶绿素a测定仪可以通过测量植物样品中叶绿素a的吸光度来确定其含量。

本文将介绍叶绿素a测定仪的使用方法。

准备工作所需材料•叶绿素a测定仪•磷酸缓冲液•丙酮•高纯度乙醇•点滴管•显微量移液管•水浴•紫外-可见分光光度计设置光度计首先，需要设置光度计的检测波长。

由于叶绿素a的最大吸收波长为665 nm，因此需要将光度计的检测波长设置为665 nm。

1.打开光度计，在主界面中找到“波长”或“WL”一栏；2.按下调节键（通常是▲/▼）将波长设置为665 nm；3.关闭显示器保护功能（通常按“mode”键）。

注意：在设置波长后，需要进行零点校正。

具体方法请参考光度计的使用说明书。

实验步骤制备样本1.取出所需数量的植物样品，并洗净水分；2.将样品粉碎，并加入适量的磷酸缓冲液；3.混合均匀后，放入80℃水浴中加热10-15分钟，使叶绿素a脱离蛋白质和叶片结构；4.将样品离心分离出上清液，即可进行下一步操作。

取样与添加试剂1.取出约2 mL的上清液，并加入适量的丙酮，使样品溶解；2.用高纯度乙醇将测量池清洗干净，加入约2 mL的丙酮；3.加入1-2滴磷酸缓冲液，搅拌均匀；4.将样品溶液加入测量池中，搅拌均匀。

测量吸光度1.将测量池放入光度计中心；2.关闭图像显示器保护功能；3.按下“测量”键，记录测量值。

注意：每次测量前都需要进行零点校准。

具体方法请参考光度计的使用说明书。

计算结果计算叶绿素a浓度将所记录的吸光度值（A665）代入下列公式：叶绿素a浓度（mg/L）=8.02 × A665计算叶绿素a含量将样品体积（mL）乘以叶绿素a浓度（mg/L），即可得到样品中叶绿素a的含量（mg）。

标题：水质中叶绿素a的测定——荧光分光光度法一、概述水是生命之源，保持水质清洁对人类健康和生态环境至关重要。

叶绿素a是植物和浮游生物体内的主要叶绿素成分，它对于水体中的生物和化学过程具有重要影响。

对水体中叶绿素a的测定具有重要意义。

在众多叶绿素测定方法中，荧光分光光度法以其快速、灵敏、准确的特点而受到广泛关注。

二、荧光分光光度法原理及优势1. 荧光分光光度法原理荧光分光光度法是通过叶绿素a在特定激发光波长下产生荧光信号，并测定荧光光谱的强度来间接测定叶绿素a的浓度的一种方法。

其原理是叶绿素a在特定波长范围内吸收光线后发生激发态转变为基态过程中发射荧光。

通过检测叶绿素a的荧光强度，可以推断水体中叶绿素a的浓度。

2. 荧光分光光度法优势a. 灵敏度高：荧光分光光度法对叶绿素a含量的检测具有高灵敏度，能够在较低浓度范围内进行准确测定。

b. 非破坏性：该方法无需对样品进行破坏性处理，不影响样品原有特性，适用于连续监测和长期调查。

c. 快速准确：荧光分光光度法测定简单快速，结果准确可靠。

三、荧光分光光度法测定叶绿素a的步骤1. 样品采集样品来源于自然水体或实验室模拟水体。

应在样品收集后尽快进行实验分析，或进行样品的冷冻保存。

2. 仪器调试根据仪器操作手册调试荧光分光光度仪，确定最佳激发波长和检测波长。

3. 样品处理将样品进行预处理，如滤过滤膜去除颗粒物，或使用溶解剂提取叶绿素a。

4. 校准仪器利用标准叶绿素a溶液校准荧光分光光度仪，确定荧光强度和叶绿素a浓度的线性关系。

5. 测定样品放置校准后的仪器测定样品荧光强度，根据标准曲线计算叶绿素a 的浓度。

四、荧光分光光度法在水质监测中的应用荧光分光光度法在水质监测中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 监测水体富营养化程度：叶绿素a是水体富营养化的重要指标之一，荧光分光光度法可以快速准确地测定水体中叶绿素a的含量，从而评估水体富营养化程度。

2. 生态环境评估：荧光分光光度法可对水体中微生物的活性和生态环境进行评估，对水体生物多样性和生态平衡的研究具有重要意义。

叶绿素a的测定原理叶绿素a是一种存在于植物和藻类细胞叶绿体中的绿色色素，它起到了光合作用中接受和传递光能的关键作用。

测定叶绿素a的浓度对于研究光合作用的机制以及评估植物和藻类的生长状态具有重要意义。

在实验室中，存在多种方法来测定叶绿素a的浓度，其中包括光度法、荧光法和高效液相色谱法。

下面将重点介绍常用的光度法测定叶绿素a的原理和步骤。

光度法是一种通过测量溶液对特定波长的光的吸收来确定溶液中某种组分浓度的方法。

对于叶绿素a的测定，通常使用的波长为650nm或663nm。

叶绿素a在这两个波长的光下有很强的吸收能力，而溶液中的其他组分对该波长的光吸收较小。

因此，测定叶绿素a的浓度可以通过测量溶液对650nm或663nm光的吸光度来间接确定。

下面是光度法测定叶绿素a浓度的一般步骤：1. 样品制备：将待测样品中的叶绿素a提取到有机溶剂中，一般使用甲醇、乙醇或二氯甲烷等极性较强的有机溶剂作为提取剂。

提取的方法可以根据需求选择，包括搅拌法、超声波法或研磨法等。

提取过程需要避光，以防叶绿素a被光降解。

2. 溶液制备：将提取出的叶绿素a溶解在适当的溶剂中，一般使用甲醇或乙醇等有机溶剂。

溶液中的叶绿素a浓度可以通过分光光度计测定吸光度来确定。

3. 吸光度测定：使用分光光度计，在650nm或663nm的波长下测量样品吸光度。

为了获得准确的测量结果，一般需要对比测量待测样品和纯溶剂的吸光度，以消除对溶剂的吸光干扰。

4. 计算叶绿素a浓度：根据比色法或校正曲线法，将测得的吸光度转换为叶绿素a的浓度。

比色法是通过比较待测样品吸光度与已知浓度叶绿素a标准溶液吸光度的关系，进行定量测定。

校正曲线法是首先制备不同浓度的叶绿素a标准溶液，然后测定它们的吸光度并绘制出吸光度与浓度的标准曲线，通过待测样品的吸光度在标准曲线上插值得到其浓度。

需要强调的是，在测定叶绿素a浓度时，有几个实验注意事项需要注意。

首先，提取过程需要避光，以免叶绿素a被光降解，影响测量结果。

叶绿素a测定复习试题一、填空题1.叶绿素a的测定方法有和，环境监测(生物)技术规范中规定用。

答：分光光度法；荧光光度法；分光光度法；2.地表水环境质量标准(GHZB1-1999)中，对控制湖泊水库富营养化的特定项目之一叶绿素a作了明确规定：Ⅰ类水质的标准值为，Ⅱ类水质的标准值为，Ⅲ类水质的标准值为，Ⅳ类水质的标准值为，Ⅴ类水质的标准值为。

答：≤0.001mg/L；≤0.004mg/L；≤0.01mg/L；≤0.03mg/L；≤0.065mg/L。

3.进行生物样品污染物测定的样品处理可概括为二个过程：第一步是将样品、、；第二步是将前一步处理过的样品以消除干扰，提高被测组分的浓度。

答：分离；纯化；浓缩；分解消化或提取。

4.经丙酮浸取含有叶绿素a的溶液，以溶液为参比，在波长、、、下测定吸光度。

在波长测定丙酮溶液的空白值。

丙酮溶液空白值应不大于。

答：丙酮；663nm；645nm；630nm；750nm；0.05。

5.经离心后的样品上清液，在750nm处测定吸光度，用以校正提取液的，当测定用1cm比色皿，吸光度超过时，提取液应。

答：浊度；0.005；重新离心。

二、问答题1. 控制叶绿素a指标值的意义是什么？答：叶绿素a是反映水体富营养化的一个重要指标。

控制叶绿素a就在于控制富营养化和藻类生物量，从而揭示湖库富营养化发生的内在实质。

2. 叶绿素a的涵义是什么？答：指水中藻类具有光合色素的叶绿素。

3.什么叫富营养化？答：营养物质特别是含氮和磷的化合物，在淡水或盐水中的富集。

富营养化加速了藻类和较高等植物的生长。

4.评定水质富营养化的几种类型标准是什么？答：参照国际经济合作与发展组织(OECD)规定和关于评定湖泊富营养化状态的叶绿素a划分标准：以≥78μg/L为重富营养型；11—78μg/L为富营养型；3.0—11μg/L为中营养型；＜3.0μg/L为贫营养型。

5.用于叶绿素a测定的水样应如何保存？答：每升水样加1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。

方法验证报告项目名称：水质叶绿素ａ的测定方法名称：《水质叶绿素ａ的测定分光光度法》HJ897-2017报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1 人员情况实验室检测人员已通过标准《水质叶绿素ａ的测定分光光度法》HJ897-2017的培训，熟知标准内容、检测方法及样品数据采集和处理等，考核合格，得到公司技术负责人授权上岗。

表1参加验证人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2主要仪器基本情况1.3 检测用试剂情况表3主要试剂及溶剂基本情况1.4 环境设施和条件情况实验室具有校准合格的温湿度计，环境可以控制在标准要求范围内，满足检测环境条件。

另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。

2 实验室检测技术能力2.1方法原理将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm、630nm波长处测定提取液的吸光度，根据公式计算水中叶绿素ａ的浓度。

2.2.样品的采集按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相关规定进行样品的采集。

样品的采集用有机玻璃采水器采集水面下0.5m样品，采样体积为1L，在样品中加入1ml碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。

2.2.样品的保存样品采集后应在0℃-4℃避光保存、运输，24h内运送至检测实验室过滤（若样品24h 不能送达检测实验室，应现场过滤，滤膜避光冷冻运输）。

2.3试样的制备2.3.1过滤在过滤装置上装好玻璃纤维滤膜。

确定取样200ml（根据水体的营养状态确定取样体积富营养和中营养过滤体积为100-200ml，贫营养过滤体积为500-1000ml），用量筒量取200ml混匀的样品，进行过滤，最后用少量的蒸馏水冲洗滤器壁。

过滤时负压不超过50kpa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。

浅析地表水叶绿素a的测定地表水中叶绿素a的测定是评价水质的重要方法之一。

叶绿素a是植物及浮游生物中广泛存在的一种光合色素，它在光合作用中具有重要的作用，同时叶绿素a在水中主要来源于植物和藻类的生长。

测定地表水叶绿素a的方法有很多，常用的方法包括光谱法、高效液相色谱法（HPLC）、荧光法和叶绿素-a水柱吸收光谱法等。

光谱法是一种比较简单的方法，它通过测定地表水样品在特定波长下的吸光度来计算叶绿素a的浓度。

具体操作步骤为：将水样过滤，去除颗粒物质；然后，用乙醇溶解过滤后的样品，使叶绿素a溶解在乙醇中；接下来，利用分光光度计测定溶液在665nm和750nm 波长下的吸光度，根据比例关系计算叶绿素a的浓度。

HPLC方法是一种精确度较高的测定方法，它利用液相色谱仪分离地表水中的叶绿素a，并通过检测峰面积或峰高来计算叶绿素a的浓度。

这种方法需要较为复杂的仪器设备和技术操作，适用于高精度测定和研究。

荧光法是另一种常用的测定方法，它利用地表水样品中叶绿素a的荧光特性来计算其浓度。

荧光法具有操作简单、快速等优点，适用于大规模水质监测。

叶绿素-a水柱吸收光谱法是一种用来测定地表水中叶绿素a浓度的新方法。

该方法通过利用叶绿素a与纳米粒子共吸附在水柱上的原理，实现对地表水样品中叶绿素a浓度的测定。

这种方法具有简单、快速、灵敏度高等特点，是一种有潜力的测定方法。

测定地表水叶绿素a的方法有很多种，每种方法都有其优点和不足。

在实际应用中，可以根据具体需要选择合适的方法进行分析，以评价水体中叶绿素a的浓度，从而了解水体的富营养化程度和藻类生长状况，更好地保护和管理水资源。