葡聚糖凝胶 LH-20使用说明(恒辉)

葡聚糖凝胶LH-20使用说明
适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。

结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。

因此使用中要考略几种色谱的作用机制。

最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。

上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，可大；差异小，应小。

凝胶过滤的上样量一般为6－8％的床体积，我们建议初次上样量控制在3％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。

（见附表“溶剂混溶性”）
流动相的常用溶剂为：
水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加）。

使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态装柱，动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用的流动相体系平衡、上样
LH-20在不同溶剂中的溶胀性能：
溶剂混溶性表。

【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

葡聚糖凝胶LH-20使用说明书货号：S8111规格：25g/50g/100g保存：室温存储产品简介：适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。

可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。

结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子，因此使用中要考略几种色谱的作用机制。

最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，重复使用分离效果可保持不变。

上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。

凝胶过滤的上样量一般为5-7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关——难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。

流动相的常用溶剂为：水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷。

这些溶剂的极性依次降低，对极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。

溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常在被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。

甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离适用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。

LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。

使用说明：1葡聚糖凝胶LH-20的原理葡聚糖凝胶LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，主要靠凝胶过滤作用来分离。

葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。

柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。

然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。

同时大开下口慢速流出蒸馏水。

装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。

否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。

(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。

然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。

本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。

洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。

据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。

但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。

(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。

若使用数次，就需要再生处理。

用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。

若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

葡聚糖凝胶柱的使用方法一、准备工作：1.准备好葡聚糖凝胶柱和所需的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷缓冲液）等。

2.将葡聚糖凝胶柱放入柱层析设备中，并根据设备的要求进行调整和固定。

3.预冲柱层析设备和葡聚糖凝胶柱，以去除可能的污染和杂质。

二、样品处理：1.将待纯化的生物大分子样品先进行预处理，如去除悬浮物、离心沉淀等。

2.将样品溶液以适当的缓冲液进行稀释，以达到最佳的样品浓度和适合葡聚糖凝胶柱操作的样品体积。

三、样品加载：1.将处理好的样品溶液缓慢地倒入柱顶，让样品从柱顶进入柱内。

避免产生气泡。

2.分子在葡聚糖凝胶柱中会根据分子大小和亲疏水性质的不同而发生分离和吸附。

较大分子会在柱上层析，而较小分子会透过凝胶层均匀流出。

因此，样品会在柱内逐渐被分离和纯化。

四、缓冲液流动：1.样品完成加载后，使用适当的缓冲液进行柱洗涤，以洗掉非特异结合的杂质。

2.缓冲液的选择应根据样品的性质而定，具体的选择和流动条件可以参考相关的文献或经验。

五、洗脱纯化：1.在用于洗脱纯化的缓冲液中，调整适当的条件以实现目标分子的洗脱。

如调整pH值、离子浓度、添加洗脱剂等。

2.根据分子的亲疏水性质，选择适当的缓冲液浓度梯度进行洗脱。

一般来说，较强亲疏水性的分子需要更高浓度的洗脱缓冲液。

六、收集洗脱液：1.将洗脱液通过柱底收集，收集不同时间点或不同分析目的的洗脱液。

2.根据实验需要，将洗脱液分为不同部分进行后续的分析或纯化处理。

七、重复使用：1.柱层析后，葡聚糖凝胶柱可以进行再生，以重复使用。

具体的再生方法可以参考柱层析设备和葡聚糖凝胶柱的说明书。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常用的生物大分子纯化方法，通过分子在柱内的分离和纯化来实现样品纯化的目的。

使用葡聚糖凝胶柱时，需要根据样品的特性和需求进行适当的样品处理、缓冲液选择、洗脱纯化条件的优化等。

如操作规范且配合适当的实验条件，葡聚糖凝胶柱可以快速、高效地纯化和富集生物大分子。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20堵啦，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1)选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。

页眉内容1. Sephadex LH-20简介羟丙基葡聚糖凝胶LH-20是一种Sephadex G-25的羟丙基衍生物，字母LH的含义是这种凝胶骨架在亲脂溶剂中或在水溶剂中都能溶胀。

在G-25分子中引入羟丙基以代替分子中羟基上的氢，葡聚糖凝胶分子的葡萄糖部分将与羟丙基形成醚键连接：R—OH――→R—O—CH2CH2CH2OH与Sephadex G相比，Sephadex LH-20分子中-OH总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加了，从而使葡聚糖的亲脂性增大。

这种凝胶既有亲水性，又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用，如丁醇、氯仿、四氢呋喃、二氧六环等，应用范围增大，对黄酮、蒽醌、香豆素等成分也能分离。

SephadexLH-20除保留有Sephadex G-25原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在有极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。

使用注意事项：羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20虽然是一种两性凝胶，但由于在不同溶剂中的溶胀因子各不相同（见表1），因此在柱中直接更换溶剂是不允许的，床体积在2.5mL ／g干胶以下的不能用于GPC分析。

这种凝胶在有机溶剂中分离较小分子量的脂溶性化合物是十分有效的。

但在使用时不允许有氧化剂存在。

再生与保存：Sephadex LH-20价格比较昂贵。

用过的Sephadex LH-20可以反复再生使用，而且柱子的洗脱过程往往就是柱子的再生过程。

短期不用时可以水洗→含水醇洗(醇的浓度逐步递增)→醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。

如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80℃干燥后保存。

Sephadex LH-20不仅具有亲水性能，可以吸水膨胀，而且也有一定的亲脂性，可以吸收有机溶剂而膨胀。

Sephadex LH-20使用说明Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。

例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。

制备凝胶悬浮液Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。

在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

1．在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。

2．使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。

3．将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

平衡上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。

洗脱液为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。

样品样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um 的膜过滤。

洗脱洗脱流速应根据情况而定，最大张性流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/h。

总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率。

再生凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡。

体积流速与线性流速的关系线性流速=体积流速/横截面积溶胀体积由于Pharmadex LH-20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。