IL-8生物活性的检测

趋化因子生物活性的测定1.基本原理：趋化因子的趋化作用没有种属特异性，趋化因子的靶细胞主要有中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞和成纤维细胞等。

（以IL-8为例）IL-8是典型的CXC家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化作用。

由于它的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。

趋化因子诱导的细胞移动方式有两类：化学增活现象，指增强细胞的随机运动，琼脂糖小滴化学动力实验是检测这种活性的比较简易，快速，重复性好的方法。

趋化性，指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。

琼脂糖中的趋化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性的方法。

微孔小室中的趋化实验：微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。

滤膜将小室分隔成上下两部分。

靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，染色并计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。

趋化材料和趋化时间的选择：趋化滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择；中性粒细胞用3μm孔径的PVPF聚碳酸膜（Polycarbonate membranes）, 趋化时间为30分钟；单核细胞用8µm孔径的PVPF 聚碳酸膜，趋化时间为90分钟；粘附力弱的淋巴细胞则用下表面复以明胶或纤粘素的5μm 或8μmPVPF聚碳酸膜，以免淋巴细胞穿过膜后落入下室，趋化时间为180分钟。

趋化因子浓度的确定：由于趋化因子的特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续稀释（5倍或10倍系列稀释）以获得最适剂量的趋化结果。

每次实验都需设好对照，因为不同来源或不同活力靶细胞的趋化能力差异很大。

趋化因子活性的表达方式有三种，其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数（chemotactic index,CI）是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值。

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IL8的异常分泌与多种炎症性疾病的发生和发展密切相关。

鼠单抗是一种常用的生物制剂，用于治疗和研究相关疾病。

本文将探讨抗人IL8鼠单抗乳膏的质量标准，以确保其在临床应用和科研中的安全性和有效性。

一、命名和标识。

1. 产品名称。

抗人IL8鼠单抗乳膏。

淋巴细胞转化试验（MTT）⼀、淋巴细胞转化试验（MTT）（⼀）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄⾊的MTT 还原成紫兰⾊的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从⽽推知待测样品的⽔平。

（⼆）材料：MTT、电⼦天平、PBS液、⼆甲基亚砜、⽆菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、⽆菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

⽤称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，⽆菌EP管分装，－20℃避光保存。

丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）⽅法：1、脾细胞制备：（1）⼩⿏颈椎脱⾅处死，75%⼄醇浸泡3分钟，取出⼩⿏置于⽆菌纸上，左腹侧朝上；（2）在⼩⿏左腹侧中部剪开⼩⼝，撕开⽪肤，暴露腹壁，可见红⾊长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，⽤镊⼦提起脾脏，眼科剪分离脾脏下⾯的结缔组织，取出脾脏。

放⼊盛有5ml Hanks液的培养⽫中；（4）制备脾细胞悬液①钢⽹研磨法：⽆菌取脾，将脾脏放置不锈钢⽹（100或200⽬）上，置于盛有适量⽆菌Hanks液的⼩平⽫中，⽤镊⼦轻轻将脾撕碎，⽤注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200⽬筛⽹过滤，⽤Hanks液洗3次，每次离⼼1000r/min 5-10min，(或1500rpm，4-7min)。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进⾏细胞计数，并⽤台盼兰染⾊(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。

调整细胞浓度为5 105/ml。

②梳刮法：脾脏可⽤镊⼦轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎⽚，将细胞悬液吸⼊离⼼管中，⾃然沉降5分钟，将悬液移⾄另⼀离⼼管中，弃去较⼤的组织块，离⼼沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏⽤镊⼦夹碎，加⼊400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，⽤尼龙⽹过滤，得到单细胞悬液。

人IL-8定量分析酶联免疫检测试剂盒IL-8简介：IL-8是由巨噬细胞产生的单核因子，是趋化因子家族C-X-C亚族（α亚族）中的一员，对中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作用，能够吸附中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和T细胞，但是单核细胞除外。

人的IL-8 cDNA 序列表明有99个氨基酸残基。

经过剪节掉22个个残基后，形成成熟的具有77个氨基酸的蛋白。

IL-8还能够调节T 淋巴细胞、B淋巴细胞成熟分化，在炎症反应、免疫调节中起重要作用，并且研究表明IL-8还具有促进血管生成的作用。

IL-8在人体内存在两种主要形式，一种是来源于单核细胞含72个氨基酸的多肽，另一种是来源于内皮细胞含77个氨基酸的多肽。

72aa比77aa的IL-8具有更高的趋化活性，而77aa的IL-8具有诱导白血病细胞凋亡的功能，其位于N端的五肽序列已被确定是IL-8具有诱导凋亡功能的活性部位。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-8 的浓度。

IL-8 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-8 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

当加入生物素化的抗人IL-8 抗体后，抗人IL-8 抗体与IL-8 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。

生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

最后加入显色剂，若样本中存在IL-8 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。

通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-8 浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-8 浓度。

人定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:组分规格预包被板12条或 6条样本分析缓冲液1瓶5ml/3 ml标准品稀释液10ml/5ml标准品2/1（冻干)生物素化抗体1瓶10ml/5mlHRP连接的酶结合物1瓶10ml/5ml浓缩洗涤液 20×30ml/瓶TMB底物1瓶10ml/5 ml终止液1瓶5ml/3 ml封板胶纸3/2张说明书1份标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；D. 若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。