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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE及ppt课件

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
THANKS FOR WATCHING
白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。

SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理(共20张)

SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理(共20张)
过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下 储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不 利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分 解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和 轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。 过硫酸铵的应用：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须 新鲜配制。 过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯等产品的引发剂， 同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的引发剂。
第10页，共20页。
浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩 胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。在上下电泳槽内 充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连 续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依 次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为 慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋 白质和慢离子在快离子后面加速(jiā sù)移动。在快离子和慢离子之间形成—个稳 定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间， 因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成—条狭窄带。这种浓缩效应可使 蛋白质浓缩数百倍。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

图.1 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
图.2 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框
四、学生观看实验录像
下面请同学们先观看录像，注意SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离蛋白的基本原理和基本操作， 仔细观察预备液及电泳缓冲液的配制、制胶、 灌胶、加样、电泳及染色料、
材料：细菌培养物 试剂：30%丙烯酰胺1mL；1.5mol/L Tris(PH8.8)； 1.0mol/L Tris(PH6.8)；10%SDS；10%过硫酸铵； TEMED；2×SDS凝胶加样缓冲液； pH8.3 TrisGly电极缓冲液；1%琼脂糖溶液； 0.05％考马斯亮兰R250 仪器：超净工作台；离心机；移液器；大培养皿； 垂直电泳槽；稳压稳流电泳仪 ；脱色摇床
五、该实验的一些重点问题和难点
2、不连续体系SDS- PAGE电泳中的样品浓缩效应： 、不连续体系 电泳中的样品浓缩效应： 电泳中的样品浓缩效应 凝胶孔径不连续性：在2层凝胶中样品/浓缩胶为大孔 径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物 在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小 孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢， 因而在两种胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使 样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
五、该实验的一些重点问题和难点
2、不连续体系SDS- PAGE电泳中的样品浓缩效应： 、不连续体系 电泳中的样品浓缩效应： 电泳中的样品浓缩效应 电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是 自动形成的。电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，就 会很快超过被分离物，因此在快离子后面，形成一个离子浓 度低的区域，这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度 使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前 导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时，建立一种 稳定状态，这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而 又不断向正极移动的界面，这就是样品被浓缩的中间层。压 着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
4、点样
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色

聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全

聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。

SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件

SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件

精选2021版课件
2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系

聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE

聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE

过氧化物酶染色原理

过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置

本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶

同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度



电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度

pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。

3.电渗现象

液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率

4、温度的影响

温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)

１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。

SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件

SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
.
10
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
.
11
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
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不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
.
20
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
.
1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在

SDS-PAGE原理及结果分析技巧ppt课件

SDS-PAGE原理及结果分析技巧ppt课件

电泳的应用
测定分子量
蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值 线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可 在标准曲线上求得其分子量。
注意：①SDS单体的浓度，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为 1:4或1:3； ②样品缓冲液的离子强度；③二硫键是否完全被还原，许多蛋白质是由 亚基或两条以上肽链组成的，这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的 分子量；④使用软件分析需要图片调正；⑤上样量少，条带越宽分析偏差（偏小） 越大。
不连续系统具有对样品的浓缩效应
• • • • pH值的不连续 缓冲液离子成分的不连续 电位梯度的不连续 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.
加样
—
浓缩胶
加电场， 样品浓缩 在界面上 (5%, pH6.8)
分离胶
(8-15%, pH8.8)Fra bibliotek电泳结束
+
电泳的应用
测定蛋白质分子量（亚基）；结合凝胶过滤层析 可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态 分析纯度 测定蛋白质的含量 蛋白质水解分析 鉴定修饰（糖基化） 分离纯化 结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别 蛋白质相互作用
PAGE 电泳原理
分子筛效应: 分子大小和形状 电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下
带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢
（强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷， 导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依 赖分子大小，而非电荷或形状）
SDS-PAGE原 理及结果分析 技巧

《sdspage凝胶电泳》课件

《sdspage凝胶电泳》课件
生物标志物发现
通过SDS-PAGE凝胶电泳结合质谱分析等技术，可以发现新的生物 标志物，用于疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域。
药物筛选
SDS-PAGE凝胶电泳可用于药物筛选过程中的目标蛋白分离和纯化， 提高筛选效率和成功率。
在蛋白质组学研究中的应用前景
蛋白质表达分析
SDS-PAGE凝胶电泳可以用于分析不同细胞或组织中蛋白 质的表达情况，有助于研究疾病发生发展过程中蛋白质表 达的改变。
对样品处理要求高
为了获得理想的分离效果，需要对蛋白质样品进行充分处理，如加入 变性剂、还原剂等，这可能会影响样品的天然构象和功能。
05
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳的发展前景
在生物科学研究中的应用前景
蛋白质组学研究
SDS-PAGE凝胶电泳是蛋白质组学研究中常用的分离技术之一，可 用于分离和鉴定蛋白质，为研究蛋白质结构和功能提供基础数据。
缺点
样品损失
在SDS-PAGE凝胶电泳过程中，样品中的蛋白质可能会吸附到凝胶或 电极上，导致一定程度的损失。
无法分离大分子量蛋白质
对于分子量大于凝胶孔径的蛋白质，SDS-PAGE凝胶电泳无法进行有 效分离。
无法分离带电荷差异小的蛋白质
SDS-PAGE凝胶电泳主要依据蛋白质的分子量和电荷差异进行分离， 对于带电荷差异较小的蛋白质，分离效果可能不佳。
03
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳结果分析
蛋白质条带的观察与识别
蛋白质条带观察
通过染色或荧光染色，观察凝胶 电泳后的蛋白质条带，判断蛋白 质是否成功分离。
蛋白质识别
根据蛋白质条带的颜色、亮度、 形状等特征，识别并标记不同的 蛋白质条带。
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*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的 气泡全部排出
15
6.上样： （1）marker 5µl （2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共 20µl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过 高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
50µl
100µl
TEMED
10µl
10µl
13
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或 直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后 加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶 凝
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要 在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶 过程最好一次性完成,避免产生气泡
14
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
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？
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完 后,需在其上加一层水,为什么?
• 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分
钟?
20
浓缩胶的作用
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实验操作大致流程图
SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤 维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二 抗反应 洗涤 显色或化学发光显影
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操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净 的小烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封 条和隔离板)
*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀， 防止夹坏玻璃板
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SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液 的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连 续系统和不连续系统两大类
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径 较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝 胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品 液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨 酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离 出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一 起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最 慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超 过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与 低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋 白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面， 使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层
* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓 缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插 入梳子,静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平
5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液
3
SDS的作用
• SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。 因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与 SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合 物。这种复合物由于结合大量带负电荷的 SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而 起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差 异的作用
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配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
6.8ml
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µl
10%Ap
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五.分析计算
按下式计算相对Biblioteka 移率：蛋白样品距加样端迁移距离 cm 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分于量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性
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注意的问题
蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
• 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则 主要取决于蛋白质分子大小
4
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
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Gel
5%
10%
200
200
97
97
66
66 45
29 45
29
15%
200 97 66
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将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝 酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检 蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异 性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种 属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非 特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测 试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条 带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异 性蛋白的半定量
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8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流 恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA （180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析
实验八
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
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一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法 • 3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法
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二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯 酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种 因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量 的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电 泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？