盐酸青藤碱单晶的制备方法及其在抗肿瘤药物方面的应用
张虹，向俊锋，沈刚，杨凤敏，唐亚林*（中国科学院化学研究所，分子动态稳
态实验室，北京，100190）
摘要：目的确定了盐酸青藤碱单晶的制备工艺，并探讨其在抗肿瘤药物方面的
应用。
方法采用酸碱滴定的方法制备出盐酸青藤碱单晶，利用X射线衍射分析（XRD）进行晶体结构分析。
采用四甲基偶氮唑蓝实验（MTT）观察化合物对
胶质瘤细胞生长的抑制作用，并利用酶联免疫吸附方法评价了化合物对酪氨酸激
酶活性的抑制作用。
结果采用酸碱滴定方法制备出纯白色的盐酸青藤碱单晶，
晶体属于正交晶系，空间群为：P2(1)2(1)2(1)，晶胞参数为：a=7.2160；b=14.3237；
c=19.2357；α=90.000；β=90.000；γ=90.000。
通过MTT及酶联免疫吸附方法测
定该化合物对肿瘤细胞的增殖及酪氨酸激酶的活性具有较好的抑制作用。
结论
通过酸碱法滴定方法可以得到纯白色的盐酸青藤碱单晶。
上述盐酸青藤碱单晶具
有很好的抗肿瘤效果，并对酪氨酸激酶的活性具有抑制作用。
关键词：盐酸青藤碱，单晶，抗肿瘤，酪氨酸激酶
The preparation method of sinomenine single crystal and its application in
antitumor drug
ZHANG Hong, XIANG Jun-feng, SHEN Gang, YANG Feng-min, TANG Ya-lin* (National Laboratory for Molecular Sciences, Center for Molecular Sciences, State
Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species, Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190)
ABSTRACT: OBJECTIVE The processes for preparing of sinomenine hydrochloride crystal was studied. And the application in the anti-tumor drug was discussed. METHODS The sinomenine hydrochloride crystal was analyzed by X-ray diffraction (XRD). The inhibitory effects of sinomenine on C6 cells proliferation was analyzed by MTT assay in vitro. And the Elisa method was used to evaluate
the inhibitory effects of compounds on the activity of protein tyrosine kinase. RESULTS By using the acid-base titration method, the sinomenine crystal was prepared and the crystal
belongs hydrochloride
unit cell parameters: a
(1),
toorthorhombic, space group P2(1)2 (1)2
=7.2160; b=14.3237; c=19.2357; =90.000; =90.000; gamma =90.000. Moreover, sinomenine inhibited the activity of protein tyrosine kinase, and it has shown obvious
anti-tumor effect on C6 tumor cells. CONCLUSION The acid-base titration method
can be used to prepare the sinomenine hydrochloride crystal. And the sinomenine hydrochloride crystal has good anti-tumor effect, and the protein tyrosine kinase activity has an inhibitory effect.
KEY WORDS: sinomenine, single crystal, antitumor, protein tyrosine kinase
青藤碱，异名青风藤碱、防己碱、毛防己碱，其为从防已科植物青风藤及毛青藤的根茎中提取的盐酸盐。
盐酸青藤碱的分子式为：C19H23NO4•HCl•2H2O（结构式，如图1所示）。
3
HCl 2H2O
图1盐酸青藤碱结构式
Figure1 the structural formula of sinomenine 盐酸青藤碱具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心率失常等药理作用[1]。
目前已有正清风疼宁片、盐酸青藤碱肠溶片等制剂应用于临床，治疗风湿性及类风湿性关节炎等，并取得了较好的疗效。
近年来，随着对青风藤及其有效成分研究的深入，其作用和应用愈来愈受到重视。
目前，现有工业生产盐酸青藤碱多采用碱化水提法工艺，其为在青藤根中加入水及一定量熟石灰，碱化一段时间，然后加入一定量工业苯，于水浴中回流提取，最后酸化、静置、析晶。
使用这种方法得到的盐酸青藤碱产品中含有杂质，所以为浅灰色、灰白色或者黄色的粉末[2]。
这种方法使用毒性很大的苯作为提取溶剂，在溶剂的回收处理方面需通过很繁琐的工艺才能符合环保要求。
因而，如何采用简单、可靠、收率高的方法对盐酸青藤碱晶体再次提取，制得纯度很高的单晶体，以达到最佳的药物疗效是迫切需要解决的问题。
本文我们通过酸碱滴定的方法，
制备出纯白色的盐酸青藤碱单晶。
利
用X射线衍射分析（XRD）进行晶体结构分析。
采用四甲基偶氮唑蓝实验（MTT）观察化合物对胶质瘤细胞生
长的抑制作用，并利用酶联免疫吸附方法评价了化合物对酪氨酸激酶活性的抑制作用，为其进一步应用研究提供实验理论基础。
1 材料
1.1药品和试剂
盐酸青藤碱粉末（宝鸡浩翔生物技术有限公司）；高糖DMEM培养基，胎牛血清（美国Gibco公司产品）；四甲基二氮唑蓝（MTT，北京索来宝科技有限公司）；二甲基亚砜（北京北化精细化学品有限责任公司，分析纯）；阳性对照品：顺铂注射液（DDP，科鼎医疗有限公司，批号M071881）；阴性对照品：0.9% 氯化钠注射液（山东华鲁制药有限公司，批号D0*******）；poly-Glu-Tyr（PGT）底物，辣根过氧化物酶标记的小鼠抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体购自Sigma公司；TMB显色剂购自北京四正柏生物科技有限公司；Bradford蛋白定量试剂购自北京普利
莱生物技术有限公司。
1.2细胞株
鼠源性胶质瘤C6细胞株（上海细胞库提供）。
1.3实验动物
SD大鼠，雄性，250g。
2 方法
2.1酸碱滴定方法培养盐酸青藤碱单
晶
称取10g市售的盐酸青藤碱粉体，滴加pH值为11.10的NaOH溶液120ml溶解盐酸青藤碱样品。
搅拌均匀后过滤，除去不溶物。
在该溶液中滴加pH值为4.00的HCl溶液，使得溶液的pH值降为5.30。
在4℃下静置，48h后析出无色透明盐酸青藤碱晶体。
过滤溶液，并用pH值为5.30的盐酸溶液及蒸馏水先后分别冲洗晶体。
清洗完毕后，放入培养皿中，真空干燥24h，得到盐酸清藤碱单晶1.52g。
将析出晶体的滤液继续冷却，不断有晶体析出，静置20天后，再次将得到的盐酸青藤碱晶体过滤，冲洗，干燥，
还可得到盐酸青藤碱晶体3.55g 。
2.2 MTT 法检测细胞抑制率 2.2.1细胞培养：
将由上海细胞库提供的鼠源胶质瘤C6细胞用胰酶消化后，悬浮于含5wt ％小牛血清的培养液650μl 中，利用玻璃滴管轻轻吹打成细胞悬液，显微镜下用细胞计数板计数活细胞。
将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养平板，每孔加肿瘤细胞悬液200μl 。
将细胞置于37℃、体积百分比为5％的CO 2培养箱中预贴壁8~10小时后，弃去上清液，然后加入不同浓度的盐酸青藤碱溶液。
在37℃、体积百分比5％的CO 2培养箱中孵化20小时，转移上清液，在每孔中加入0.5mg/ml 四唑盐（MTT ）的无血清培养液100μl ，37℃、5％CO 2培养箱继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入100μl 二甲亚砜（DMSO ）终止反应，振荡5~10min ，振荡均匀，在酶标以上以波长为570nm ，测定各孔吸光度。
2.2.2 计算公式：按下式计算平均抑制率。
计算公式：
100OD OD OD ×−值
对照组值）
实验组值（对照组
2.3酪氨酸激酶抑制实验
2.3.1大鼠脑组织中PTK 的提取：将大鼠大脑取出，剔除脑膜、称重，加入冷匀浆液。
冰浴中用玻璃匀浆器高速间断匀浆，经梯度离心获得胞浆型酪氨酸激酶。
2.3.2酶标板包被：底物稀释液加入96孔酶标板中，37℃孵育过夜。
移除板中过量底物液，洗涤，于37℃干燥2小时。
4℃保存备用。
2.3.3PTK 抑制剂筛选：先将化合物和PTK 粗提物加入酶标板，37℃孵育；加入激酶缓冲液稀释的ATP ，37℃孵育；移除板中反应液，洗涤；加入抗体复合物，37℃孵育；移除板中抗体复合物，洗涤；加入TMB 显色液室温避光反应；加入终止液，于450nm 测
OD 值。
抑制率%= (OD 正常-OD 样品)/(OD 正常-OD 空白)*100%
3 结果
3.1 酸碱滴定方法制备盐酸青藤碱单晶
利用2.1所示方法，制得盐酸清藤碱单晶1.52g ，对其进行X 射线衍射分析，如图2所示。
该晶体属于正交晶系，空间群为：P2(1)2(1)2(1)，晶胞参数为：a=7.2160；b=14.3237；c=19.2357；
Figure2 The crystal of sinomenine
3.2盐酸青藤碱对肿瘤细胞的增殖抑制作用
MTT 法检测结果发现，盐酸青藤碱对人脑胶质瘤细胞具有一定程度的抑制作用。
为明确其量效关系，开展了系列浓度的盐酸青藤碱对胶质瘤质细胞的增值抑制实验（表1）。
结果显示，盐酸青藤碱对胶质瘤细胞的生长具有抑制作用，IC 50值为98 μg/ml 。
表1盐酸青藤碱对胶质瘤细胞的抑制实验 Table 1 The inhibition rates of sinomenine on
C6 cells. （X ±s ，n=3）
组别
浓度 μg.ml -1
抑制率 %
sinomenine
500 74.15
100 52.78 50 26.28
30 9.69 5 8.11 0.5 5.45
3.3 盐酸青藤碱对酪氨酸激酶的活性抑制作用
蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinase ，PTKs)家族是细胞信号传递通路的一个重要组成部分，参与对细胞的迁移、粘附、存活、生长、增生和分化等重要功能的调节，与机体的生
理和病理过程具有密切联系[3]。
不同浓度的盐酸青藤碱对于酪氨酸激酶活性的测定结果见表2。
从表2的数据可以看出，不同浓度的盐酸青藤碱对于酪氨酸激酶的活性均有不同程度的抑制效果，且抑制作用随着浓度的增高而增大，其IC 50值为 0.38nmol/ml 。
表2盐酸青藤碱对酪氨酸激酶活性的抑制 Table 2 The inhibition effect of sinomenine on the activity of protein tyrosine phosphotase
4 讨论
盐酸青藤碱是从青风藤中提取出的一个单体生物碱，经药理学证实，有治疗类风湿性关节炎的作用。
我们利用酸碱滴定的方法制备出盐酸青藤碱单晶，并通过X 射线衍射分析，确定了盐酸青藤碱单晶属于正交晶系，空间群为：P2(1)2(1)2(1)，晶胞参数为：a=7.2160；b=14.3237；c=19.2357；α=90.000；β=90.000；γ=90.000。
利用制备出的盐酸青藤碱单晶，进而开展了该化合物对肿瘤细胞增殖以及对酪氨酸激酶活性的抑制实验。
目前，颅内肿瘤中以胶质瘤最常见，约占45%~50%。
此类肿瘤以恶性
者多见，而且由于肿瘤的浸润性生长，利用传统的手术治疗难以彻底切除[4-6]。
本研究表明，盐酸青藤碱对于脑胶质瘤细胞株的增殖具有抑制作用，且呈现一定的量效关系，其IC 50值为98 μg/ml 。
本发明以鼠源性胶质瘤C6细胞株为靶细胞，研究了盐酸青藤碱对于胶质瘤细胞株的抑制作用。
首次发现盐酸青藤碱对胶质瘤细胞株C6具有抑制作用。
此结果表明，盐酸青藤碱是一种很有潜力的新型、有效的抗胶质瘤新药，可用于制备治疗脑部肿瘤药物，为脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径，也拓宽了盐酸青藤碱的医药应用。
通过对盐酸青藤碱对酪氨酸激酶活性抑制的实验研究，证明盐酸青藤碱对酪氨酸激酶的活性具有抑制作用，其IC 50值为0.38nmol/ml 。
综上所述，利用酸碱滴定的方法可以制备出盐酸青藤碱单晶，抗肿瘤药效及药理实验结果表明，盐酸青藤碱能有效抑制胶质瘤细胞株的生长，并对酪氨酸激酶的活性具有一定的抑制作用。
REFERENCES
[1] Cai Y, Qiu S H, Sun B Q, Study Overview on the Treatment of Rheumatism with Kukoline Hydrochloride [J], Guiding JournaI of TCM (中医药导报),2006,12 (12): 84 - 86.
[2] Robert Roskoski Jr., The ErbB/HER family of protein-tyrosine kinases and cancer [J]. . Pharmacological Research, 2014, 79: 34-74.
[3]Ma T S, Li Ga, Liu Z H, et al., Study on Purity of Sinomenine Hydrochloride Crystal [J], China Pharmaceuticals (中国药业), 2005, 14(12): 26 -28.
[4] Liu L, Zhang X Y , Lou Y , et al., Cerebral microdialysis in glioma studies, from theory to application [J], Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 96 (5): 77-89.
[5] Timothy Fountaine, Christopher R.P. Lind, Andrew J.J. Law, Primary
浓度 μg/ml
抑制率 %
IC 50 nmol/ml
10 113.71 0.38
1 83.69 0.1 34.37 0.01 18.22
glioblastomas and anaplastic astrocytoma in a glioma family [J] , Journal of Clinical Neuroscience, 2006,
13 (4): 497-501.
[6] J. Tuettenberg, C. Friedel, P. Vajkoczy, Angiogenesis in malignant glioma-A target for antitumor therapy?[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2006, 59(3):
181-193.。
