菌种传代的操作方法

菌种传代记录

菌种名称 菌种代数 传代日期

编号 购入日期 保管人

传代次数 传代数量 传代人

传代结束日期 保存温度 培养时间（小时）

传代步骤：

1、在无菌条件下，将经复活后的菌种置于洁净工作台面。

2、点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作。

3、灼烧接种环，环进入试管的部分，在通过火焰灼烧。灼烧时，把环置于酒精灯的外焰上，灼烧完毕将环稍冷片刻再进行操作。

4、菌种管与接种管持在左手，菌种管在前，接种管在后。应斜持试管呈45°角，使试管斜面向上。

5、以右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种易于拔取。再以右手持接种环的柄端，把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。

6、使用右手在火焰旁分别拔出两试管的棉塞，持住。再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。

7、先将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接种环未冷却，能烫死细菌。一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许。取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔沾至管壁或管口。

8、当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。最后将接种环灼烧灭菌放置原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可进行培养。

9、每支菌种需标明菌株编号、传代次数、菌种名称、接种日期、有效期、接种人。

10、将接种好的培养基放置培养箱中（按照菌种说明书所规定的时间和温度要求培养），观察菌种生长情况。

传代管编号：________________________________

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GMP管理文件

题 目 菌种传代操作规程 编码：

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制 定 审 核 批 准

制订日期 审核日期 同意日期

颁发部门 质量部 生效日期

分发部门 化验室

一、 目标：为使菌种传代操作规范化、制度化，故建立此规程

二、 适用范围：菌种传代须按本规程实施。

三、 责任者：微生物程度检验化验员，质量检测中心主任。

四、 正文：

1、培养基制备

按微生物程度检验用稀释剂、培养基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好对应培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、用胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，制备好培养基预培养48小时后，确定无菌落生长方可使用。

2.菌种传代

2.1菌种传代前应准备好适于该菌种生长培养基和培养设备，全部操作均应在符合生物安全保护生物安全柜内进行。

2.2点燃酒精灯，在火焰上部操作，将原有菌种斜面（简称菌种管）和待接种新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后，使试管内斜面向上，两支试管口平齐，应斜持试管呈45°角，以免管底凝集水浸湿培养基表面。用右手在火焰旁转动两支试管胶塞，方便接种时易于拨取。再用右手持接种环柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧。将接种环烧红约30s，随立即接种棒金属部分在火焰上烧灼，以根本灭菌。用右手小指和手掌之间和无名指和小指之间，在火焰旁分别拔除两支试管胶塞，持住。在将试管口在火焰上经过以杀灭管口细菌，但勿烧过热，将烧灼接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长培养

GMP管理文件

题

目 菌种传代操作规程 编码： 页序/总页：2/2

基上，如有溶印则表明接种环未冷却，待冷后，再从斜面上挑取少许菌苔。取出时接种环不能经过火焰，应在火焰旁快速插入接种管，在斜面上由下而上划 “Z”字型曲线，当接种完成，立即将管口经过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手胶塞。最终将接种环烧灼灭菌放置备用。

菌种传代

第一、实验室菌种的传代和复壮方法

1、简述

菌种的传代系装菌种在使用一段时间后，菌种数量减少，将菌种进行传代培

养，增加数量经多次传代后，菌种有衰退、变异现象，对菌种进行复壮，得到纯化

菌种。 2、菌种传代

2.1 仪器及培养基

酒精灯、接种环、营养琼脂培养基。

2.2 操作步骤

2.2.1 将新鲜的无菌斜面琼脂养基、酒精灯、接种环和将要传代的菌种管均放

置于洁净工作台上，备用。

2.2.2 点燃酒精灯，以左手持菌种管，右手持接种环，将接种环通过火焰消毒

俟冷后，从菌种管中挑取菌落。

2.2.3 左手立即换取斜面培养基管，以右手无名指和小指拔取棉塞(先转动棉

塞后拔去)，夹持于手指间。

2.2.4 立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内，先从斜面底部到顶

端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒涂布。

2.2.5 轻轻取出接种环，用棉塞塞住管口，立即将接种环通过火焰消毒。

2.2.6 将接种好的管口用牛皮纸包位，置于35?2?恒温箱中培养18-24小时，取出

置4-6?冰箱中保存。

3、菌种复壮

3.1 仪器及培养基

酒精灯、接种环、曙红亚甲蓝琼脂培养。 3.2.1 菌种在经过几次传代之后，对其进行革兰氏染色、镜检。

3.2.2 染色、镜检后若发现菌种有退化、变异现象，则将其划线接种在相应的

培养基平板上，于35?2?培养18-24小时后，观察生长菌的形态特征。

3.2.3 挑取具有典型特征的菌落再次进行划线接种培养后进行革兰氏染色、镜

检。 3.2.4 选择特征明显，生长良好的菌种，将其接种于营养琼脂培养基斜面，

培养后置冰箱中保存。

第二、工作菌种冰箱校验方案

1.概述

1.1工艺要求

该冰箱用于工作菌种贮藏，要求其质量可靠，冷冻温度符合贮藏要求。箱内温

度均一性良好，负载各点间温差<2?，温度波动范围小，运行期间，波动温度?5?，

具备停电及高温报警功能。使用区环境18温度~26?，相对温度45~65%，具备外部

205菌种复苏、传代、保存、使⽤、销毁标准操作规程

1 ⽬的

规范微⽣物学检定⽤菌的管理，最⼤限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从⽽确保微⽣物学检验结果的准确可靠。2 适⽤范围

本规程适⽤于检定⽤菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使⽤及销毁等。3 术语

3.1 标准菌种是指由中国药品⽣物制品检定所医学微⽣物菌种保藏管理中⼼提供的冷冻⼲燥菌。

3.2 传代⽤菌种是指⽤标准菌种制备的采⽤特定保存⽅法长期固定保存的菌种，⽤于传代及制备⼯作⽤菌种。

3.3 ⼯作⽤菌种是指⽤标准菌种或传代⽤菌种接种⾄普通琼脂斜⾯培养后，作为⽇常⼯作使⽤的菌种。

3.4 菌种的传代是指将其接种⾄⼀新鲜培养基上或培养基内，每萌发⼀次即称为⼀代，从菌种保藏中⼼获得的冷冻⼲燥菌种为第0代。4 职责

4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。

4.2 微⽣物检验员负责菌种的确认、传代、使⽤及销毁。

5内容

5.1冻⼲菌种的复苏

菌种复苏、接种在超净⼯作台内按⽆菌操作要求进⾏。准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后⾸先置室温30分钟）、灭菌的⽑细滴管、培养⽫、镊⼦、1ml注射器（配有长针头）、营养⾁汤培养基、灭菌⽔及琼脂斜⾯，将以上物品移⼊菌

种室，⽤75%⼄醇棉球擦净安瓿管外壁放在⽆菌培养⽫内晾⼲，点燃酒精灯，将安瓿管的封⼝⼀端在⽕焰烧灼红热，⽤⽑细管吸取灭菌⽔少许滴在灼热处，使其骤冷⽽炸裂。在不离开⽕焰圈内，迅速⽤1ml注射器抽取0.3ml⾁汤培养基加⼊安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。⽤注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种⾄1⽀⾁汤培养基、2⽀琼脂斜⾯培养基。将接种后的⾁汤及培养基斜⾯根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，⽤⽆菌接种环蘸取少许⾁汤培养物，然后在平⽫接种处进⾏划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24⼩时，进⾏⾰兰染⾊镜检及相应的⽣化试验或采⽤细菌鉴定条对其进⾏确认。如不符合要求，应及时与⽣产商联系。5.2菌种传代