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基因工程
绪论
1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础
三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现
3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶
1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数
3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割
4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单
链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
11、DNA聚合酶：
(1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用途：除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA第二链。切口移位探针的制备。
(2)、Klenow大片段：没有5’→3’外切酶活性，而保留了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用途:用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端。补平5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA第二链。
(3)、Taq酶：75度为最适反应温度，95度仍具有稳定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。
12、主要修饰酶：
(1)碱性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。
(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基转移5’-OH上
(3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3’端高效添加脱氧核苷酸。
分子克隆载体
1、分子克隆载体：是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。
2、分子克隆载体的功能：
（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力
（2）为外源基因提供在受体细胞中复制或整合的能力
（3）为外源基因提供在受体细胞中扩增和表达的能力
3、载体的分类：
(1)按用途分：克隆载体、表达载体、整合载体
(2)按来源分：原核生物载体：质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid 载体、phagemid载体；真核病毒载体
4、载体的特点：
（1）至少有一个复制起点，因而至少可在一个生物体中自主复制
（2）至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入
（3）至少有一个标记基因，以知识载体或重组DNA分子是否进入受体细胞
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数
5、标记基因的作用：外源基因是否插入载体分子形成重组子；外源载体是否进入宿主细胞
6、标记基因的种类：抗性标记基因；营养标记基因；生化标记基因；噬菌斑
7、常用的遗传标记基因：四环素抗性基因（Tc）；氨苄青霉素抗性基因（Ap）；氯霉素抗性基因（Cm）；卡那霉素（Kan）；新霉素（Neo）；β—半乳糖甘酶基因（LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因（Gus）；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。
8、按复制起点划分克隆载体：
1）质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体（有低拷贝和高拷贝）2）ARS复制型—染色体复制型（一般拷贝数比较高）
3）病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA必须反转录为cDNA（高拷贝）4）混合复制型：不同种生物复制起点混合（穿梭载体）
9、根据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体
10、根据载体功能分类：
1）普通型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体
2）表达型载体：3类：Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子；Ⅱ型：转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子；Ⅲ型: 转录起始区+ 翻译起始区+ 信号肽链编码区+ 终止子（常称之为表达分泌型载体）
3）失控型质粒载体(Run-away plasmid vector)：是一些低拷贝质粒，其复制控制是温度敏感型或药物敏感型，在不同温度或不同药物浓度下，质粒拷贝数会显著变化。
4）探针型载体：该类载体主要特点是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的研究目的，如分离基因启动子、终止子、DNA复制起点等。
5)定序型载体：主要用于核苷酸的序列测定
6)整合型载体：主要用于基因治疗，稳定表达外源基因。
9、标记基因与拷贝的关系：若标记基因的表达效率较高，宿主细胞可能不大量表达标记基因以满足选择压力的要求，因而载体的拷贝数会降低，可采取相应方法提高拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物的浓度。对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率。
大肠杆菌分子克隆载体
1、E.coli克隆载体的种类
1）质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。
2）噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。
3）COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装
4）噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
2、质粒的特点：
1）质粒DNA的复制与染色体复制无关
2）质粒DNA以超螺旋形式存在
3）质粒DNA可以结合转移
4）质粒的不相容性和不相容群
5）质粒DNA的消除
6）质粒的整合
3、大肠杆菌质粒的复制：以RNAⅡ为引物合成，RNAⅠ与RNAⅡ结合可减少质粒的拷贝数，使RNAⅠ复制起点上游一个核苷酸处G突变为T，使得拷贝数增多。
4、质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一宿主细胞中稳定共存的现象。主要是由于他们在复制功能之间的相互干扰造成。
5、λ噬菌体的结构特点：线性双链DNA病毒，具有末端互补的12个核苷酸，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48.5kb。
6、热诱导表达：λcl ts857 ，可作为组件插入质粒DNA 内。目的基因插在λcl ts857 下游，重组体的目的基因在42 ℃表达，30 ℃不表达。
7、λ噬菌体载体的缺点：基因组太大；酶切点太多；野生型只能接纳一定长度
