畜牧兽医学报 2023,54(10):4154-4163A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.10.014开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因陈雪娇2,刘会杰1,臧 蕾1,冯 静1,鹏 达1*,张 浩2*(1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所,拉萨850009;2.中国农业大学动物科学技术学院,高原畜禽遗传资源研究中心,北京100193))摘 要:旨在通过分析白来航(W h i t e L e g h o r n ,W L )和雪域白鸡(X u e yu W h i t e c h i c k e n ,X YW )在低氧条件下孵化时胚胎心脏组织的基因表达差异,挖掘鸡胚低氧适应候选基因㊂本研究在高海拔环境孵化雪域白鸡和白来航鸡种蛋,采集孵化第16天胚胎心脏组织,提取R N A ,进行转录组测序(R N A -s e q),筛选差异表达基因(D E G s ),并对其进行荧光定量P C R (q R T -P C R )验证㊁功能富集分析和构建转录因子-靶基因调控网络,鉴定与雪域白鸡低氧适应相关的候选基因㊂在雪域白鸡和白来航鸡的心脏组织之间筛选到253个D E G s ,随机选择5个D E G s 进行q R T -P C R 验证,表达趋势与测序结果一致㊂功能富集分析表明,D E G s 主要涉及心血管发育和心脏功能相关的生物学过程和信号通路㊂将D E G s 和已知的鸡转录因子对比,筛选到F O X P 2和HO X A 2,参与调控血管生成㊁心肌收缩等,对雪域白鸡胚胎低氧适应起关键作用㊂本研究通过鸡胚心脏组织转录组数据分析,鉴定到T E NM 2㊁N O G ㊁S M O C 1㊁C C B E 1等鸡胚高原低氧适应候选基因,为解析雪域白鸡高原低氧适应分子机制提供理论依据㊂关键词:雪域白鸡;白来航鸡;低氧适应;心脏;转录组中图分类号:S 831.2 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)10-4154-10收稿日期:2023-05-18基金项目:西藏自然科学基金项目(X Z 202101Z R 0061G );国家现代农业产业技术体系(C A R S -40)作者简介:陈雪娇(1998-),女,河北保定人,硕士生,主要从事家禽遗传育种研究,E -m a i l :c h e n x u e ji a o 0805@126.c o m *通信作者:鹏 达,主要从事鸡遗传育种研究,E -m a i l :2845545151@q q.c o m ;张 浩,主要从事动物遗传资源与功能基因组学研究,E -m a i l :z h a n gh a o 827@163.c o m T r a n s c r i p t o m e D a t a f r o m C h i c k e n E m b r y o H e a r t T i s s u e I d e n t i f i e d K e y Ge n e sf o r A l t i t u d e H y p o x i a A d a p t a t i o n i n X u e yu W h i t e C h i c k e n s C H E N X u e j i a o 2,L I U H u i j i e 1,Z A N G L e i 1,F E N G J i n g 1,P E N G D a 1*,Z H A N G H a o 2*(1.I n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e ,T i b e t A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l a n d A n i m a l H u s b a n d r y S c i e n c e s ,L h a s a 850009,C h i n a ;2.P l a t e a u A n i m a l a n d P o u l t r y G e n e t i c R e s o u r c e s R e s e a r c h C e n t e r ,C o l l e g e o fA n i m a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,B e i j i n g 100193,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o i d e n t i f y c a n d i d a t e g e n e s f o r h y p o x i a a d a pt a t i o n i n c h i c k e n e m b r y o s b y a n a l y z i n g t h e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n e m b r y o n i c h e a r t t i s s u e s o f W h i t e L e g h o r n (W L )a n d X u e y u W h i t e (X YW )c h i c k e n s i n c u b a t e d u n d e r h y p o x i c c o n d i t i o n s .T h e e g gs w e r e i n -c u b a t e d a t h i g h a l t i t u d e .T h e h e a r t t i s s u e s w e r e c o l l e c t e d f r o m e m b r y o s a t d a y 16o f i n c u b a t i o n ,a n d t h e R N A s w e r e e x t r a c t e d f o r R N A s e q u e n c i n g (R N A -s e q ).D i f f e r e n t l y e x p r e s s e d g e n e s (D E G s )w e r e s c r e e n e d ,w h i c h w e r e v a l i d a t e d u s i n g f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C R (qR T -P C R ).T h e f u n c t i o n a l e n r i c h m e n t a n a l y s i s a n d a t r a n s c r i p t i o n f a c t o r -t a r g e t g e n e r e g u l a t o r y ne t w o r k w a s c o n s t r u c t e d t of u r t h e r s c r e e n c a n d i d a t eg e n e s r e l a t e d t oh y p o xi a a d a pt a t i o n i n X YW.T h e 25310期陈雪娇等:鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因D E G s w e r e s c r e e n e d i n h e a r t t i s s u e s b e t w e e n X YW a n d W L,a n d5D E G s w e r e r a n d o m l y s e l e c t e d f o r q R T-P C R v a l i d a t i o n.T h e i r e x p r e s s i o n t r e n d w a s c o n s i s t e n t w i t h t h e s e q u e n c i n g r e s u l t s.E n r i c h m e n t a n a l y s i s s h o w e d t h a t D E G s w e r e m a i n l y e n r i c h e d i n b i o l o g i c a l p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s r e l a t e d t o c a r d i o v a s c u l a r d e v e l o p m e n t a n d c a r d i a c f u n c t i o n.C o m p a r i n g D E G s w i t h k n o w n c h i c k e n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s,F O X P2a n d HO X A2w e r e s c r e e n e d,w h i c h r e g u l a t e d a n g i o-g e n e s i s,m y o c a r d i a l c o n t r a c t i o n a n d o t h e r f u n c t i o n s,a n d p l a y e d a k e y r o l e i n h y p o x i a a d a p t a t i o n i n X YW e m b r y o s.T h r o u g h t h e a n a l y s i s o f t r a n s c r i p t o m i c d a t a,T E NM2,N O G,S M O C1, C C B E1a n d o t h e r c a n d i d a t e g e n e s w e r e i d e n t i f i e d f o r p l a t e a u h y p o x i a a d a p t a t i o n i n c h i c k e n e m b r y o s,w h i c h p r o v i d e a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r a n a l y z i n g t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f p l a t e a u h y p o x i a a d a p t a t i o n i n X YW.K e y w o r d s:X u e y u W h i t e c h i c k e n;W h i t e L e g h o r n c h i c k e n;h y p o x i a a d a p t a t i o n;h e a r t;t r a n s c r i p-t o m e*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:P E N G D a,E-m a i l:2845545151@q q.c o m;Z H A N G H a o,E-m a i l: z h a n g h a o827@163.c o m雪域白鸡,原名拉萨白鸡,于2020年通过国家畜禽遗传资源委员会新品种审定,并正式命名为 雪域白鸡 ㊂雪域白鸡是由白来航鸡和藏鸡杂交选育而来,兼具藏鸡的高原适应性和白来航的高产蛋性能,属于高海拔地区轻型良种蛋鸡品种[1],为西藏养鸡业带来了较高的经济效益㊂低氧适应研究一直深受人们的关注㊂有关低氧感应过程的研究成果获得了2019年的诺贝尔医学或生理学奖㊂低氧与人类的一些疾病紧密相关,例如心脑血管疾病㊁缺血性损伤㊁高原反应等[2-3],还是肿瘤微环境的重要指标[4]㊂世居青藏高原等高海拔地区的人类和动物,经过多年的自然选择和遗传变异,形成了独特的生理特征,能够耐受高寒㊁低氧㊁低压的环境[5-6]㊂鸟类的生殖方式是卵生,胚胎体外发育,对氧气含量的变化非常敏感[7]㊂已有研究证明,胚胎期是低氧适应的关键时期[8]㊂雪域白鸡经过多年的选育,已经适应了高原低氧的环境,在海拔3780m的环境条件下受精蛋孵化率高达81.33%,而北京油鸡仅为1.00%[9]㊂心脏是鸡胚适应低氧环境的关键器官,低海拔鸡种在受到低氧刺激时,心脏发育异常,心室壁变薄,心室容积增大,不利于泵血,而青藏高原本土鸡种藏鸡的心脏发育正常[10-11]㊂本研究选取低海拔鸡种白来航鸡作为对照,将种蛋在高海拔地区(西藏拉萨)进行孵化,采集孵化第16天的鸡胚心脏组织进行转录组测序,鉴定雪域白鸡适应高原低氧环境的关键基因及其调控途径㊂1材料与方法1.1试验材料白来航和雪域白鸡的种蛋均在西藏拉萨(平均海拔高度3650m)进行孵化,温度37.8ħ,相对湿度55%,每天翻蛋12次㊂选取孵化第16天的白来航鸡胚10个(W L-D16,n=10)和雪域白鸡胚10个(X YW-D16,n=10),采集心脏组织,迅速放置于液氮速冻,然后置于-80ħ冰箱进行保存㊂1.2总R N A提取及质控取适量心脏组织,研磨棒研磨后,使用T r i z o l 法提取鸡胚心脏总R N A,微量分光光度计N a n o-D r o p2000(T h e r m o,美国)检测其O D260n m/O D280n m 值鉴定R N A样品浓度㊂使用A g i e n t2100/L a b C h i pG X检测R N A的完整性㊂1.3文库构建及测序样品检测合格后,进行文库构建,每组测序文库设3个生物学重复㊂用带有O l i g o(d T)的磁珠富集m R N A;加入F r a g m e n t a t i o n B u f f e r将m R N A进行随机打断;以m R N A为模板,合成第一条c D N A链及二链,并进行c D N A纯化;对纯化的双链c D N A进行末端修复㊁加A尾,并连接测序接头;然后用A M P u r e X P b e a d s选择380b p左右的片段;最后通过P C R得到c D N A测序文库㊂使用Q u b i t3.0荧光定量仪库对文库进行初步定量,浓度需达到1n g㊃μL-1以上,随后用Q s e p400高通量分析系统对文库的插入片段进行检测㊂文库质检合格后,使用I l l u m i n a N o v a S e q6000测序平台进行P E150模式测序㊂5514畜 牧 兽 医 学 报54卷1.4 测序数据处理及差异表达基因筛选对原始数据进行质控,去除含有接头和低质量的r e a d s 得到c l e a n r e a d s ㊂使用H I S A T 2软件将c l e a n r e ad s 与参考基因组进行快速精确的比对㊂利用S t r i n g t i e 对m a p pe d r e a d s 进行组装和定量,采用F P KM (f r ag m e n t s p e r k i l o b a s e o f t r a n s c r i pt p e r M i l l i o n f r a g m e n t s m a p pe d )进行标准化[12],斯皮尔曼相关系数r (S pe a r m a n 's c o r r e l a t i o n c o ef f i c i e n t )作为评估样本间基因表达重复性的指标㊂以白来航为对照组,采用D E S e q2进行基因表达量差异分析[13],将F o l d C h a n ge ȡ2且F D R <0.05作为筛选标准㊂1.5 差异表达基因的功能分析对筛选到的D E G s 进行功能富集分析,G e n eO n t o l o g y (G O )在百迈克在线网站(h t t ps :ʊi n t e r n a -t i o n a l .b i o c l o u d .n e t /)完成,K E G G (K y o t o E n c yc l o -pe d i a of G e n e s a n d G e n o m e s )通路分析使用K O -B A S 在线网站(h t t p :ʊb i o i n f o .o r g/k o b a s /)完成㊂使用R 包g g p l o t 2进行G O 和K E G G 富集分析可视化㊂1.6 转录因子筛选和靶基因预测在线网站A n i m a l T F D B (h t t p:ʊb i o i n f o .l i f e .h u s t .e d u .c n /A n i m a l T F D B 4/#/)可下载鸡的转录因子(T F )列表,与筛选的D E G s 进行对比,找到测序数据中差异表达的转录因子㊂在线网站J A S -P A R (h t t p s :ʊj a s p a r .g e n e r e g.n e t /)下载转录因子的基序(m o t i f ),选定D E G s 转录起始位点(t r a n -s c r i p t i o n s t a r t s i t e ,T S S )上游5000b p 为启动子序列,最后在M E M E (h t t p s :ʊm e m e -s u i t e .o r g/m e m e /d o c /m e m e .h t m l)网站对基序和启动子序列进行靶向预测,建立T F -t a r ge t s 网络㊂1.7 实时荧光定量P C R (qR T -P C R )验证选取5个D E G s ,肌动蛋白γ2(a c t i n γ2,A C T G 2)㊁钾钙激活通道亚家族M α1(po t a s s i u m c a l c i u m -a c t i v a t e d c h a n n e l s u b f a m i l y M α1,K C -NMA 1)㊁叉头框P 2(f o r k h e a d b o x P 2,F O X P 2)㊁同源框A 2(h o m e o b o x A 2,H O X A 2)㊁肌动蛋白α2(a c t i n α2,A C T A 2),在N C B I 网站设计引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂选取G A P DH 为内参基因,对白来航鸡和雪域白鸡样本进行q R T -P C R 验证,以检测测序结果及数据分析的准确性㊂采用2-ΔΔC T 法计算基因相对表达量㊂采用G r a ph P a d P r i s m 9.5.1软件作图㊂表1 q R T -P C R 引物T a b l e 1 q R T -P C R p r i m e r s基因G e n e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 扩增长度/b pA m pl i c o n s i z e A C T A 2F :A C T C T G C T G A C T G A A G C A C C145R :T C C C T G T A G T A C G C C C A G A AA C T G 2F :G T G C G A C A T C G A C A T C C G T A A241R :C T C G T C G T A C T C G G G T T T G C K C NM A 1F :A A G C A C T G A T T G C C G A G G A A 244R :C G T T T A G T G C A T T G G C T G G G H O X A 2F :C C C T C G A G G T C C C C T C T T T A 166R :A A G T C A A T C G T G G T G A G C G TF O X P 2F :TG C A G A G G A T G A A G A C T G T C C 173R :G T G G A G T G G T T C T G A A G G T C A2 结 果2.1 转录组数据白来航和雪域白鸡共6个样品的转录组测序数据经过质量控制,共得到38.53G b c l e a n d a t a,每个样品的c l e a n d a t a 均达到了5.97G b 及以上,Q 30碱基百分比在92.85%及以上㊂将c l e a n r e a d s 与鸡参考基因组C R C g7b 进行比对,比对率在92.01%到93.64%之间(表2)㊂在白来航和雪域白鸡胚胎心脏组织中共鉴定20291个阳性表达基因,其中共同表达的基因18258个㊂2.2 差异表达基因及功能分析白来航与雪域白鸡胚胎心肌组织中筛选到253个D E G s ,其中在雪域白鸡中122个基因显著上调,131个基因显著下调(图1)㊂差异表达的253个基因主要富集于心肌组织发育调节㊁心肌细胞增殖㊁651410期陈雪娇等:鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因表2 测序样品与参考基因组的序列比对T a b l e 2 S e q u e n c e a l i g n m e n t b e t w e e n t h e s e q u e n c e d s a m pl e s a n d t h e r e f e r e n c e g e n o m e 样本名称S a m pl e I D 碱基总数B a s e s u mG C 含量/%G C c o n t e n tQ 30/%总读数T o t a l R e a d s映射读数M a p pe d R e a d s W L -D 16-1658066736449.5593.594401928840877665(92.86%)W L -D 16-2698055905249.4893.834669339243722541(93.64%)W L -D 16-3613569012249.2693.424105360038086058(92.77%)X YW -D 16-159********49.2493.113995901836764412(92.01%)X YW -D 16-2627240084850.5592.854195505238831281(92.55%)X YW -D 16-3658771667649.0194.554405787440890429(92.81%)W L -D 16-1~3.白来航鸡孵化16天样本;X YW -D 16-1~3.雪域白鸡孵化16天样本;Q 30.原始数据中P h r e d 数值大于30的碱基数量占总碱基数量的百分比(P h r e d .用来预测碱基测序错误率)W L -D 16-1-3.W h i t e L e g h o r n c h i c k e n h a t c h i n g s a m p l e s f o r 16d a y s ;X YW -D 16-1-3.X u e y u W h i t e c h i c k e n h a t c h i n g s a m pl e s f o r 16d a y s ;Q 30.T h e p e r c e n t a ge of t h e n u m b e r o f b a s e s w i t h P h r e d v a l u e sg r e a t e r th a n 30i n t h e t o t a l n u m b e r o f b a s e s i n t h e o r i g i n a l d a t a (P h r e d .U s e d t o p r e d i c t b a s e s e q u e n c i n g er r o r r a t e)灰色是表达差异不显著的基因;红色是表达上调的基因;蓝色是表达下调的基因N o n -d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s a r e s h o w e d i n g r e y c o l o r ;r e d s h o w u p r e g u l a t e d g e n e s ;b l u e s h o w d o w n r e gu l a t e d g e n e s 图1 差异表达基因的火山图F i g .1 V o l c a n i c m a p o f d i f f e r e n t i a l l y e x pr e s s e d g e n e s 心肌组织生长㊁肌原纤维㊁细胞外基质㊁苹果酸脱氢酶(脱羧)(N A D P+)活性㊁MA P 激酶磷酸酶活性㊁钙释放通道活性和钙离子结合等G O 条目(图2)㊂利用K O B A S 数据库分析D E G s 功能,发现它们(T E NM 2㊁N O G ㊁S M O C 1㊁C C B E 1㊁E N D 2㊁A C T G 2㊁和MMP 2等)主要参与血管平滑肌收缩㊁MA P K 信号通路㊁血管内皮生长因子信号通路和心肌收缩等途径,这些途径可能参与心脏形态发生和功能㊂此外D U S P 5㊁U P B 1㊁L P I N 2㊁P L A 2G 4A和P D G F C 等差异表达基因还参与多种代谢途径,包括淀粉和蔗糖代谢㊁泛酸和辅酶A 的生物合成以及甘油磷脂代谢等(图3),这些能量代谢途径可能为机体生存和心脏起搏提供能量㊂2.3 转录因子筛选和靶基因网络构建经过筛选,差异表达基因中含有2个转录因子,分别是F O X P 2和HO X A 2㊂由于m o t i f 的每个位点碱基分布频率不同,转录因子和靶基因可能存在一个或多个结合位点(表3)㊂通过将m o t i f 与启动子序列比对,构建了转录因子与靶基因网络(图4),值得注意的是,其中一些靶基因(MMP 2㊁A C T A 2㊁A C T G 2和K C NMA 1等)的功能富集在血管内皮生长因子信号通路㊁应对低氧和血管生成等途径,提7514畜 牧 兽 医 学 报54卷图2 差异表达基因的G O 功能注释F i g .2 G O f u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f d i f f e r e n t i a l l y e x pr e s s e d g e n es 图3 差异表达基因的K E G G 通路富集分析F i g .3 K E G G p a t h w a y e n r i c h m e n t a n a l y s i s o f d i f f e r e n t i a l l y e x pr e s s e d g e n e s 示与心脏发育和功能有关(图5)㊂2.4 差异表达基因验证选取5个差异表达基因,取白来航和雪域白鸡样品进行q R T -P C R 分析,通过l o g 2(f o l d c h a ng e )对差异倍数进行转换㊂结果如图6所示,q R T -P C R 结果与R N A -s e q 测序结果表达趋势一致,表明转录85149514 10期陈雪娇等:鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因表3转录因子与部分靶基因结合位点预测T a b l e3P r e d i c t e d b i n d i n g s i t e s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t o s o m e t a r g e t g e n e sF O X P2m o t i f HO X A2m o t i fK C NM A1(C h r6)-4187T A G T A A A C A A T-4177;-2853G C T C A T T A C G-2844-2169G T G T A A A C A C G-2159;-2647A T G T A A A C A G A-2637;-2252C G G T A A A C A C A-2242;-1771C A A T A A A C A A A-1761A C T A2(C h r6)-4300G A G A A A A C A C A-4290;-1764A G G A A A A C A A A-1754;-677T A A T A A A C A A C-667A C T G2(C h r22)-2095A A G A A A A C A A G-2085;-4729C G A T A A A C A G G-4719+1表示转录起始位点;符号"-"指转录起始位点的上游;C h r6表示基因位于6号染色体t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e(T S S)i s d e f i n e d a s+1;t h e s y m b o l - m e a n s t h e u p s t r e a m o f T S S;C h r6i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e i s l o c a t e d o n c h r o m o s o m e 6红色三角形代表转录因子;蓝色方形代表靶基因(差异表达基因)T h e r e d t r i a n g l e s r e p r e s e n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s;T h e b l u e s q u a r e s r e p r e s e n t t a r g e t g e n e s(D E G s)图4转录因子-靶基因预测网络F i g.4T r a n s c r i p t i o n f a c t o r-t a r g e t g e n e p r e d i c t i o n n e t w o r k畜 牧 兽 医 学 报54卷蓝色圆形代表转录因子;绿色三角形代表靶基因(差异表达基因);橙色方形代表通路B l u e c i r c l e s r e p r e s e n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ;G r e e n t r i a n g l e s r e p r e s e n t t a r g e t g e n e s (D E G s );T h e o r a n g e s q u a r e s r e pr e s e n t t h e p a t h w a ys 图5 转录因子与部分靶基因及通路预测网络F i g .5 T r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a n d p a r t i a l t a r g e t g e n e s a n d p a t h w a ys p r e d i c t i o n n e t w o rk 图6 q R T -P C R 基因表达量结果F i g .6 q R T -P C R g e n e e x pr e s s i o n r e s u l t s 组测序结果的真实性和准确性㊂3 讨 论氧气是决定胚胎正常发育的关键因素之一,包括心脏发生[14]㊂心脏发生是一个复杂而精妙的过程,很容易受到自身基因表达变化和外界环境因素的影响而发育异常[15-16]㊂有研究指出,胎儿在母体子宫内的异常缺氧会对心脏发育产生不利影响,改变心肌结构,导致心功能下降[17]㊂长期暴露于高海拔地区提高了牦牛对低氧的生理反应,较大的心脏有利于它们适应低氧环境[18]㊂低氧孵化第16天的藏鸡胚胎心脏组织表达谱显示,藏鸡与低地鸡种差异表达基因主要为F G F R 1㊁C T G F ㊁A D AM 9㊁J PH 2㊁S A T B 1㊁B MP 4和H Y A L 1等,这些基因可能参与心肺系统发育[19]㊂本研究对高海拔孵化第16天的白来航鸡和雪域白鸡胚胎心脏组织进行基因表达谱分析,鉴定出的差异表达基因主要为T E NM 2㊁N O G ㊁S M O C 1㊁C C B E 1㊁E N D 2㊁A C T G 2㊁和MMP 2等,这些基因富集在心脏发育和血管发育等通路㊂这些结果表明,鉴定到的差异基因可能参与61410期陈雪娇等:鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因鸡胚心血管发育和功能,是研究雪域白鸡适应低氧环境的候选基因㊂氧气与能量代谢有紧密的关系,机体生存和运动都离不开A T P供能,而A T P的产生依赖于氧气参与的氧化磷酸化[20]㊂因此当机体处于低氧环境时,能量代谢也会受到影响㊂先前的研究将高海拔地区的代谢适应归因于肌肉氧化能力的降低,其中乳酸脱氢酶(L D H)是厌氧糖酵解的关键酶,催化丙酮酸和乳酸之间的转化,在能量代谢过程中起关键作用[21]㊂高原牦牛背最长肌中的L D H活性较高,能利用有限的氧气促进碳水化合物的利用从而释放能量[18]㊂还原性辅酶N A D H在生化代谢反应中发挥重要作用,例如糖酵解和三羧酸循环等[22]㊂本研究鉴定的差异表达基因(D U S P5㊁U P B1㊁L P I N2㊁P L A2G4A和P D G F C等)也在能量代谢途径有富集,包括苹果酸脱氢酶(N A D+)活性和丙酮酸代谢等㊂表明能量代谢方面的差异可能是雪域白鸡适应低氧环境的原因㊂转录因子指能够以序列特异性方式结合D N A 并且调节转录的蛋白质[23]㊂转录因子与特异性D N A结合通常概括为 基序 (m o t i f),可用于扫描较长序列(例如启动子)以鉴定潜在的结合位点,转录因子在基因的启动子区有一个或多个结合位点[24]㊂转录因子与启动子结合,招募R N A聚合酶或其他因子,促进或者抑制基因的转录,从而调控生物功能[25]㊂低氧研究的明星基因H I F-1α,作为转录因子激活调控的靶基因表达[26-28]㊂血管内皮生长因子(v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r,V E G F)是H I F的靶基因,具有促进血管通透性增加㊁细胞外基质变性㊁血管内皮细胞迁移㊁增殖和血管形成等作用,缺氧条件下H I F-1可以调节V E G F的表达[29-30]㊂本研究鉴定了2个重要的转录因子F O X P2和H O X A2,可以靶向调控K C NM A1㊁C A C N G4㊁S C N4B㊁WN T2B㊁MM P2㊁C C B E1㊁A C T G2㊁A C T A2㊁P L A2G4A和T E NM2等基因表达㊂其中MMP2属于基质金属蛋白酶家族,低氧可以刺激MMP2的表达上调[31],参与多种生物学功能过程,包括血管平滑肌生长㊁增殖㊁迁移㊁松弛㊁血管生成和细胞凋亡等,与心血管发育密切相关[32-34]㊂A C T A2基因编码α-平滑肌肌动蛋白,通常在促进血管运动和收缩的血管平滑肌细胞中表达,参与血管收缩和血压稳态[35-36]㊂这些基因的功能均与心血管发育相关,参与心脏发育和功能相关通路㊂因此,本研究认为在低氧适应过程中,这些转录因子可能通过调控靶基因的转录表达而发挥作用,保证雪域白鸡胚胎期心脏正常发育,泵血功能正常,从而适应低氧环境㊂4结论雪域白鸡是西藏自主培育的品种,本研究通过高海拔孵化的鸡胚心脏转录组测序,发现了差异表达基因富集在心脏发育㊁血管发育和能量代谢途径,鉴定了转录因子F O X P2和HO X A2,它们可能通过调控靶基因的表达参与血管生成和心肌收缩等途径,为进一步研究鸡高原低氧适应分子机制提供了基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]单增群佩.拉萨白鸡选育历程的回顾[J].西藏农业科技,2001,23(3):57-58.D A N Z Q P.A r e v i e w o f t h e s e l e c t i o n a n d b r e e d i n gp r o c e s s o f L h a s a w h i t e c h i c k e n[J].T i b e t J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,2001,23(3):57-58.(i n C h i n e s e)[2] N E C HA E V A M V.P h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o a c u t ec h a n g e s i n t e m p e r a t u r e a nd o x y ge n a t i o n i n b i r d a n dr e p t i l e e m b r y o s[J].R e s p i r P h y s i o l N e u r o b i o l,2011,178(1):108-117.[3]张浩,吴常信,强巴央宗,等.氧气对低地鸡蛋胚胎死亡和孵化率的影响[J].畜牧兽医学报,2006,37(2):112-116.Z H A N G H,WU C X,Q I A N G B A Y Z,e t a l.I n f l u e n c e so f o x y g e n o n e m b r y o n i c m o r t a l i t y a n d h a t c h a b i l i t y o fc h i c k e n e g g s[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2006,37(2):112-116.(i n C h i n e s e)[4]冯静,袁经纬,臧蕾,等.高海拔环境下不同品种鸡种蛋孵化效果研究[J].畜牧与饲料科学,2018,39(8):13-15.F E NG J,Y U A N J W,Z A N G L,e t a l.S t u d y o n t h eh a t c h i n g e f f e c t o f d i f f e r e n t s p e c i e s o f c h i c k e n e g g s i nh i g h a l t i t u d e a r e a[J].A n i m a l H u s b a n d r y a n d F e e dS c i e n c e,2018,39(8):13-15.(i n C h i n e s e)[5] Z HA N G H,B U R G G R E N W W.H y p o x i c l e v e l a n dd u r a t i o n d i f fe r e n t i a l l y af f e c t e m b r y o n i c o rg a n s y s t e md e v e l o p m e n t o f t h e c h i c k e n(G a l l u s g a l l u s)[J].P o u l t S c i,2012,91(12):3191-3201.[6]苟文钰.鸡胚胎低氧适应表型及心脏组织差异表达基因鉴定[D].北京:中国农业大学,2015.G O U W Y.I d e n t i f i c a t i o n o f h y p o x i c a d a p t a t i o n1614畜牧兽医学报54卷p h e n o t y p e s a n d t h e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n g e n e s o fm y o c a r d i a l t i s s u e i n c h i c k e n[D].B e i j i n g:C h i n aA g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2015.(i n C h i n e s e)[7] P E R T E A M,P E R T E A G M,A N T O N E S C U C M,e ta l.S t r i n g T i e e n ab l e s i m p r o v e d r ec o n s t r u c t i o n o f at r a n s c r i p t o m e f r o m R N A-s e q r e a d s[J].N a tB i o t e c h n o l,2015,33(3):290-295.[8] L O V E M I,H U B E R W,A N D E R S S.M o d e r a t e de s t i m a t i o n of f o l d c h a ng e a n d d i s p e r s i o n f o r R N A-s e qd a t a w i t h D E Se q2[J].G e n o m e B i o l,2014,15(12):550.[9] Y U B Q,WA N G X,S O N G Y T,e t a l.T h e r o l e o fh y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r s i n c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s[J].P h a r m a c o l T h e r,2022,238:108186. [10] P E N A E,E L A L A M S,S I Q U E S P,e t a l.O x i d a t i v es t r e s s a n d d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h h i g h-a l t i t u d e e x p o s u r e[J].A n t i o x i d a n t s(B a s e l),2022,11(2):267. [11] L I Y,Z HA O L,L I X F.H y p o x i a a n d t h e t u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t[J].T e c h n o l C a n c e r R e s T r e a t,2021,20,d o i:10.1177/15330338211036304.[12] S I MO N S O N T S,Y A N G Y Z,HU F F C D,e t a l.G e n e t i c e v i d e n c e f o r h i g h-a l t i t u d e a d a p t a t i o n i n t i b e t[J].S c i e n c e,2010,329(5987):72-75. [13] Q I X B,Z HA N G Q,H E Y X,e t a l.T h et r a n s c r i p t o m i c l a n d s c a p e o f y a k s r e v e a l s m o l e c u l a rp a t h w a y s f o r h i g h a l t i t u d e a d a p t a t i o n[J].G e n o m eB i o l E v o l,2019,11(1):72-85.[14] G I U S S A N I D A.B r e a t h o f l i f e:h e a r t d i s e a s e l i n k t od e v e l o p m e n t a l h y p o x i a[J].C i r c u l a t i o n,2021,144(17):1429-1443.[15] S M I T H K L M,S W I D E R S K A A,L O C K M C,e t a l.C h r o n i c d e v e l o p m e n t a l h y p o x i a a l t e r s m i t o c h o n d r i a lo x i d a t i v e c a p a c i t y a n d r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e sp r o d u c t i o n i n t h e f e t a l r a t h e a r t i n a s e x-d e p e n d e n tm a n n e r[J].J P i n e a l R e s,2022,73(3):e12821. [16] M E N E N D E Z-MO N T E S I,E S C O B A R B,G OM E Z MJ,e t a l.A c t i v a t i o n o f a m i n o a c i d m e t a b o l i c p r o g r a m i nc a rd i a c H I F1-a l p h a-def i c i e n t m i c e[J].i S c i e n c e,2021,24(2):102124.[17] P A T T E R S O N A J,Z HA N G L.H y p o x i a a n d f e t a lh e a r t d e v e l o p m e n t[J].C u r r M o l M e d,2010,10(7):653-666.[18] A Y A L E W W,C HU M,L I A N G C N,e t a l.A d a p t a t i o n m e c h a n i s m s o f y a k(B o s g r u n n i e n s)t oh i g h-a l t i t u d e e n v i r o n m e n t a l s t r e s s[J].A n i m a l s(B a s e l),2021,11(8):2344.[19] Z HA N G Q,G O U W Y,WA N G X T,e t a l.G e n o m er e s e q u e n c i n g i d e n t i f i e s u n i q u e a d a p t a t i o n s o f T i b e t a nc h i c k e n s t o h y p o x i a a nd h i g h-d o se u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n i n h i g h-a l t i t u d e e n v i r o n m e n t s[J].G e n o m eB i o l E v o l,2016,8(3):765-776.[20] R A D H A K R I S H N A N K,L A M A N N A J C,C A B R E R A ME.A q u a n t i t a t i v e s t u d y o f o x y g e n a s a m e t a b o l i cr e g u l a t o r[M]ʊD U N N J F,S WA R T Z H M.O x y g e nT r a n s p o r t t o T i s s u e X X I V.B o s t o n:S p r i n g e r,2003:547-554.[21] M A R K E R T C L.L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e.B i o c h e m i s t r ya n d f u n c t i o n o f l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e[J].C e l l B i o c h e mF u n c t,1984,2(3):131-134.[22] W I L S O N D F,MA T S C H I N S K Y F M.M e t a b o l i ch o m e o s t a s i s:o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a n d t h em e t a b o l i c r e q u i r e m e n t s o f h i g h e r p l a n t s a n d a n i m a l s[J].J A p p l P h y s i o l,2018,125(4):1183-1192.[23] L AM B E R T S A,J O L MA A,C AM P I T E L L I L F,e ta l.T h e h u m a n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s[J].C e l l,2018,172(4):650-665.[24] T O G N O N M,G I U G N O R,P I N E L L O L.A s u r v e y o na l g o r i t h m s t o c h a r a c t e r i z e t r a n s c r i p t i o n f a c t o rb i n d i n gs i t e s[J].B r i e f B i o i n f o r m,2023,24(3):b b a d156.[25] D E MA T T O S K,V I G E R R S,T R E M B L A Y J J.T r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n t h e r e g u l a t i o n o f l e y d i g c e l lg e n e e x p r e s s i o n a n d f u n c t i o n[J].F r o n t E n d o c r i n o l(L a u s a n n e),2022,13:881309.[26] X U R F,WA N G F,Y A N G H Q,e t a l.A c t i o n s i t e sa n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n o f H I F-1αi n h ib i t o r s[J].M o l e c u l e s,2022,27(11):3426.[27] P E N G X F,G A O H,X U R,e t a l.T h e i n t e r p l a yb e t w e e n H I F-1αa n d n o nc od i n g R N A s i n c a n ce r[J].JE x p C l i n C a n c e r R e s,2020,39(1):27.[28] WU F,T O N G D D,N I L,e t a l.H I F-1αs u p p r e s s e sm y e l o m a p r o g r e s s i o n b y t a r g e t i n g M c l-1[J].I n t JC l i n E x p P a t h o l,2020,13(7):1483-1491.[29] T A N G K C,B R E E N E C,WA G N E R H,e t a l.H I Fa n d V E G F r e l a t i o n s h i p s i n r e s p o n s e t o h y p o x i a a n ds c i a t i c n e r v e s t i m u l a t i o n i n r a t g a s t r o c n e m i u s[J].R e s p i r P h y s i o l N e u r o b i o l,2004,144(1):71-80. [30] S A D E G H I F,K A R D A R G A,B O L O U R I M R,e t a l.O v e r e x p r e s s i o n o f b H L H d o m a i n o f H I F-1f a i l e d t oi n h i b i t t h e H I F-1t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i n h y p o x i a[J].B i o l R e s,2020,53(1):25.[31] Z E N G W,S U J,WU L,e t a l.C D147p r o m o t e s m e l a n o m ap r o g r e s s i o n t h r o u g h h y p o x i a-i n d u c e d MM P2a c t i v a t i o n[J].C u r r M o l M e d,2014,14(1):163-173.[32] R A F F E T T O J D,K H A L I L R A.M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e sa n d t h e i r i n h ib i t o r s i n v a sc u l a r r e m ode l i n g a n d261410期陈雪娇等:鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因v a s c u l a r d i s e a s e[J].B i o c h e m P h a r m a c o l,2008,75(2):346-359.[33] S I E F E R T S A,S A R K A R R.M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s i nv a s c u l a r p h y s i o l o g y a n d d i s e a s e[J].V a s c u l a r,2012,20(4):210-216.[34] WA N G X,K HA L I L R A.M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s,v a s c u l a r r e m o d e l i n g,a n d v a s c u l a r d i s e a s e[J].A d vP h a r m a c o l,2018,81:241-330.[35] Y U A N S M.α-s m o o t h m u s c l e a c t i n a n d A C T A2g e n ee x p r e s s i o n s i n v a s c u l o p a t h i e s[J].B r a z J C a r d i o v a s cS u r g,2015,30(6):644-649.[36] K AW A,K AW K,HO S T E T L E R E M,e t a l.E x p a n d i n g A C T A2g e n o t y p e s w i t h c o r r e s p o n d i n gp h e n o t y p e s o v e r l a p p i n g w i t h s m o o t h m u s c l ed y s f u n c t i o n s y n d r o m e[J].A m J Me d G e n e t P a r t A,2022,188(8):2389-2396.(编辑郭云雁)3614。
武 薇1 徐梓轩1. 承德医学院，2. 河北省药品医疗器械检验研究院，3. 河北省神经损伤与修复重点实验室，【摘要】目的：物过程和通路，选出小儿清热止咳口服液的活性成分，关靶点取交集，软件中构建“小儿清热止咳口服液成分蛋白相互作用网并得到关键靶点。
通过Cytoscape 3.7.2小儿清热止咳口服液是由麻黄、炒苦杏仁、石膏、甘草、黄芩、板蓝根、北豆根七味中药制成的复方制剂，原方来自我国汉代名医张仲景的《伤寒杂病论》的麻杏石甘汤［1］。
具有清热宣肺，平喘，利咽的功效。
用于小儿外感风热所致的感冒，症见发热恶寒、咳嗽痰黄、气促喘息、口干音哑、咽喉肿痛［2］。
小儿清热止咳口服液在治疗小儿发热方面具有优势，可充分利用药物的不同性能、功用，而进行动态的、个性化的、切中病证之本源的综合治疗［3］。
但其确切机制尚不清晰，因此本文基于网络药理学及分子对接技术，筛选出小儿清热止咳口服液有效活性成分和作用靶点，构建“中药-活性成分-靶点”、靶蛋白相互作用、靶点功能通路等多层次生物信息网络，为小儿清热止咳口服液用于治疗小儿发热提供理论依据［4］。
本研究的思路如Fig.1所示。
1 方法1.1 药物活性成分的获取及筛选中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP （Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）（http：/// tcmsp.php）搜寻小儿清热止咳口服液的7味中药（麻黄、炒苦杏仁、板蓝根、北豆根、甘草、黄芩、石膏）的化学成分。
根据药动学性质参数，包括口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）、血脑屏障（blood-brainbarrie，BBB）分别对每个药物进行筛选以得到活性成分，因小儿清热口服液是口服方剂，因此OB≥30%；由于药物在体内需要依靠靶器官和靶细胞的生理功能特性，通过复杂的生物学过程，最终与相应靶点结合，才能发挥其理想的生物学效应，活性成分必须具有较高的类药性，因此设置DL≥0.18为筛【ABSTRACT】Objective：By constructing the interaction networks between the compositions of Xiao’er Qingre Zhike Koufuye and target networks and proteins，we conducted the enrichment analysis to determine the biological processes and involved pathways，we also studied the potential action mechanism of fever in children. Methods：The active components of Xiao’er Qingre Zhike Koufuye were selected and the target points were predicted by searching TCMSP database，and the potential action targets were obtained by crossing Genecards database with Drug Bank database of the fever-related targets. After processing the comparison results，the targets were input into Cytoscape3.7.2 software to build the “Xiao’er Qingre Zhike Koufuye ingredients-compounds-fever targets” network，and the String database and Cytoscape3.7.2 database were used to construct the protein interaction network and to obtain the key targets. The GO bio-function and KEGG pathway enrichment analysis were later performed through the DAVID v6.8 database and the enrichment results were visualized with Cytoscape3.7.2. Finally，the molecular docking of the key compounds and the targets were performed. Results：160 active components，584 active component targets，and 4 137 known fever in children-related target genes were obtained. The interaction of disease genes and drug targets yielded 346 intersection targets，and 18 core targets were obtained by the protein interaction network and topological analysis. Enrichment analysis showed that the main pathways focused on neuroactive ligand-receptor-related pathways，immune inflammation pathways，and other pathways such as neurotoxin addiction and viral infection. Further screening of core targets and compounds for molecular docking showed that Casp3，CREB1，Fos，IL-1B，IL-6，INS，Jun，and MYC as core target proteins could stably bind to small molecules such as D-norpseudoephedrine，beta-sitosterol，matrine and ephedrine. Conclusion：Through network pharmacology and molecular docking，our study found the possible active ingredients of Xiao’er Qingre Zhike Koufuye and the potential targets of fever in children and predicted the key ways to treat fever in children. It provided a theoretical basis for explaining the action mechanism of Xiao’er Qingre Zhike Koufuye in children and new methods for further studying the molecular action mechanism. Besides，it supplied a new idea for drug development of children fever.【KEY WORDS】 Xiao’er Qingre Zhike Koufuye；fever in children；network pharmacology；molecular docking technology；由于治疗发热的药物成分需要通过血脑屏障才能对机体发挥作用，因此设定BBB≥0.30。
蛹虫草转录组分析及类胡萝卜素生物合成相关基因的挖掘娄海伟1,2，赵 玉1，赵 逸2，林俊芳2,3,*，赵仁勇1，叶志伟2,3，郭丽琼2,3,*（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州450001；2.华南农业大学食品学院，广东 广州510642；3.广东省微生态制剂工程技术研究中心，广东 广州510642）摘 要：基于培养基显著影响蛹虫草类胡萝卜素的生成，采用高通量测序技术探究不同培养基培养的蛹虫草菌丝（CM10_RL和CM10_WL）的转录组差异，经生物信息学分析挖掘蛹虫草类胡萝卜素的生物合成相关基因。
结果表明，样品CM10_WL的类胡萝卜素含量显著高于样品CM10_RL的类胡萝卜素含量；相对于样品CM10_RL，在样品CM10_WL中检测到318 个上调表达基因和618 个下调表达基因。
基因本体论功能富集结果表明差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）主要富集在代谢过程、细胞膜、催化活性条目中。
京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集结果表明DEG主要富集在代谢途径。
蛹虫草转录本与KEGG数据库中的类胡萝卜素生物合成途径比对结果表明基因CCM_06728和CCM_09155参与类胡萝卜素的生物合成。
本研究为进一步阐明蛹虫草类胡萝卜素的生物合成途径奠定基础。
关键词：蛹虫草；高通量测序；转录组；色素；类胡萝卜素；差异表达基因Transcriptomic Analysis of Cordyceps militaris and Mining of Genes Involved in Carotenoid Biosynthesis LOU Haiwei1,2, ZHAO Yu1, ZHAO Yi2, LIN Junfang2,3,*, ZHAO Renyong1, YE Zhiwei2,3, GUO Liqiong2,3,*(1. College of Food Science and Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China;2.College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;3. Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510642, China)Abstract: Culture medium composition significantly affects carotenoid biosynthesis in Cordyceps militaris. In this study, high-throughput sequencing technology was used to investigate the transcriptomic differences of C. militaris mycelia (CM10_RL and CM10_WL) cultured with different media. The genes related to the biosynthesis of carotenoids in C. militaris were identified by bioinformatics analysis. The results showed that the carotenoid content of CM10_WL was significantly higher than that of CM10_RL. A total of 318 up-regulated genes and 618 down-regulated genes were found in CM10_WL compared with CM10_RL. Gene Ontology (GO) analysis indicated that the differentially expressed genes (DEGs) were mainly classified into the “metabolic process”, “membrane” or “catalytic activity” terms. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis suggested that these DEGs were mainly enriched in “metabolic pathways”.Therefore, all the transcripts derived from RNA-seq data were searched against the carotenoid biosynthetic pathway in the KEGG database, and the results showed that the CCM_06728 and CCM_09155 genes were involved in the biosynthesis of carotenoids. This study lay a foundation for further elucidating the biosynthetic pathway of carotenoids in C. militaris.Keywords: Cordyceps militaris; high-throughput sequencing; transcriptome; pigment; carotenoid; differentially expressed geneDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200125-269中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）06-0150-07收稿日期：2020-01-25基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2018B020205001；2018B020205003）；广东省现代农业食用菌产业技术体系项目（2019KJ103）；国家自然科学基金面上项目（31772373；31572178）；河南工业大学高层次人才科研基金项目（2020BS001）；国家自然科学基金-河南省联合基金重点项目（U1604234）第一作者简介：娄海伟（1983—）（ORCID: 0000-0003-0987-0400），男，博士，研究方向为天然产物活性成分。
