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生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
《基因工程》实验教学教案一、实验教学目标1. 让学生了解基因工程的基本概念、原理和操作步骤。
2. 培养学生运用基因工程技术解决实际问题的能力。
3. 帮助学生掌握基因克隆、基因编辑等实验技能。
二、实验教学内容1. 基因克隆实验：让学生通过PCR扩增目的基因，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. 基因编辑实验：让学生利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行编辑，并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证编辑效果。
3. 基因表达实验：让学生将目的基因插入到表达载体中，转化大肠杆菌，并通过IPTG诱导表达。
4. 抗原-抗体反应实验：让学生利用基因工程方法制备重组抗原，并进行抗原-抗体特异性反应检测。
5. 基因工程应用实例：让学生了解基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
三、实验教学方法1. 讲授法：讲解基因工程的基本原理、操作步骤和实验技巧。
2. 演示法：演示基因克隆、基因编辑等实验操作，让学生直观地了解实验过程。
3. 实践操作：让学生动手进行实验，培养实验操作能力和团队协作精神。
4. 讨论法：引导学生针对实验结果进行分析和讨论，提高解决问题的能力。
四、实验教学准备1. 教材和参考资料：准备《基因工程》等相关教材和参考资料，为学生提供理论支持。
2. 实验器材：准备PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳设备、表达载体、大肠杆菌等实验所需的器材和试剂。
3. 实验指导：制定详细的实验步骤和操作指南，方便学生查阅。
五、实验教学评价1. 过程评价：评价学生在实验操作过程中的规范性和团队协作精神。
3. 应用评价：评价学生运用基因工程知识解决实际问题的能力。
4. 学生互评：鼓励学生互相评价，提高自我认知和沟通能力。
六、实验教学流程1. 实验前准备：讲解实验原理、目的和操作步骤，检查实验器材和试剂。
2. 实验操作：按照实验指导进行基因克隆、基因编辑等实验操作。
3. 实验结果分析：对实验结果进行分析和讨论，解释实验现象。
5. 实验总结：总结实验收获和不足，提出改进措施。
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
《现代生物技术导论》实验指导书实验学时：32学时实验目录实验一ß-半乳糖苷酶基因（lac Z）的定点突变 (1)实验二外源目的基因片段回收与载体的体外连接 (6)实验三重组DNA分子的转化、筛选与鉴定 (9)实验四外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE检测 (12)实验一ß-半乳糖苷酶基因（lac Z）的定点突变实验项目类型：基础性所属课程名称：《现代生物技术导论》实验计划学时：6学时一、实验目的1. 学习并掌握利用PCR进行基因缺失和插入定点突变的基本原理和实验方法。
2. 复习碱法小量制备质粒DNA的原理和方法。
二、PCR介导的基因定点突变的基本原理pSV-β-半乳糖甘酶质粒pSV-β-半乳糖甘酶质粒基因分布SV40 Early promoter and enhancer segment 1-419Transcription start sites 354, 360, 365Possible start codons (ATG) 500, 530, 569gpt promoter (-10 region) 428-433lacZ start site 710lacZ stop site (TAA) 3755lac operon sequences 709-4020lacY 3809-4011SV40 small T antigen 4021-4156beta-lactomase (Ampr) coding region 4784-5644载体pSV-β-半乳糖甘酶大小是6820bp（图实验1-1），其上带有完整的lacZ 基因，其中lacZ基因的起始位点是710bp，终止位点是3755bp.通过改变5‘端引物或（和）3’引物中的核苷酸序列或数目，可利用多聚酶链式反应（PCR ）进行基因的定点突变。
本实验的定点突变均设计在5‘端引物上，而3’端引物上（4279-4302bp ）无突变。
基因工程实验技术操作手册一、实验前准备在进行基因工程实验前，需要做好以下准备工作：1. 实验室环境准备：确保实验室设备完好，工作台面干净整洁，通风良好。
2. 实验材料准备：准备所需的试剂、培养基、细胞培养物等实验材料，并按照要求进行储存和标识。
3. 实验仪器准备：检查并确保实验所需的仪器设备正常运作，如PCR仪、电泳仪等。
4. 个人防护准备：佩戴实验室必备的个人防护用品，如实验手套、实验服、护目镜等。
二、实验步骤1. DNA提取a. 准备待提取的生物样本，如细菌、植物组织等。
b. 使用DNA提取试剂盒按照说明书进行提取步骤，如细胞破碎、蛋白质沉淀等。
c. 最后得到纯净的DNA样品，可用于后续的实验操作。
2. PCR扩增a. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
b. 将反应体系加入PCR仪中，设置好扩增程序和参数。
c. 进行PCR扩增反应，得到所需的目标DNA片段。
3. DNA连接a. 准备连接试剂盒，包括连接酶、连接缓冲液等。
b. 将目标DNA片段和连接载体按照比例混合，加入连接试剂中。
c. 进行连接反应，使目标DNA片段与载体DNA连接成一个完整的质粒。
4. 转化a. 准备感受态细胞，如大肠杆菌等。
b. 将连接后的质粒DNA加入感受态细胞中，进行热激转化或电转化。
c. 将转化后的细胞涂布在含有适当抗生素的培养基上，培养过夜。
5. 筛选与鉴定a. 从培养基中挑取菌落，进行PCR扩增或酶切检测，筛选含有目标基因的菌落。
b. 对筛选出的菌落进行测序，验证目标基因的正确性。
c. 进一步进行功能鉴定，如蛋白表达、酶活性等实验。
三、实验注意事项1. 操作时要严格遵守实验室安全操作规程，注意个人防护和废弃物处理。
2. 实验材料的储存和标识要清晰明确，防止混淆和污染。
3. 仪器设备的操作要正确，遵循使用说明书，避免操作失误和设备损坏。
4. 实验步骤中的温度、时间等参数要按照要求进行调整和控制，确保实验结果的准确性。
《基因工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1026课程名称：基因工程制药英文名称：Gene Engineering Pharmaceutical Science实验室名称：生物制药实验室（二）课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程是生物制药专业的专业实验课程，是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法的经典性、实用性。
实验内容涉及了基因工程制备药物的主要过程，通过本课程的学习使学生掌握基因工程的一些基本原理和实验操作方法，并使其对基因工程制药的上、下游技术有一个完整的概况，力求全面、系统地培养学生基因工程制备药物的实验操作能力，并提高解决问题及分析研究问题的能力，为本科生进入科研实验室打下良好的基础。
二、主要仪器设备及现有台套数恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、电子天平、微量移液器、凝胶成像系统、超净工作台、台式离心机、旋涡混合器、磁力搅拌器、琼脂糖凝胶电泳槽、电泳仪、PCR仪、水浴锅、垂直电泳槽、发酵罐、电转仪。
微波炉、脱色摇床、制冰机三、实验课程内容和学时分配四、考核方式1、实验报告：本门课程要求实验报告应具有“实验目的与要求、原理、实验基本过程、实验结果与讨论”等几个方面的内容。
2、考核方式（1）实验课的考核方式：本课程按等级制评定与考核，评分标准分为：A、B、C、D、E五个等级。
考核主要包括两部分：实验操作技能、实验报告（包括实验预习报告）。
（2）实验课考核成绩确定，实验课成绩占课程总成绩的比例等：在该课程的评定分数中，实验课内容占30%，其中实验课考核又分为两部分，即实验操作技能占实验课总分数的60%、实验报告（包括实验预习报告）占实验课总分数的40%。
五、实验教材、参考书1、教材：自编参考楼士林主编《基因工程》，科学出版社20072、参考书目：（1）基因工程技术实验指导，钟卫鸿主编，化学工业出版社 2007（2）基因工程实验指导，朱旭芬主编，高等教育出版社，2006（3）基因工程实验技术，彭秀玲编著，湖南科学技术出版社 1997《酶工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1027课程名称：酶工程制药英文名称：Enzyme Engineering Pharmaceutical science实验室名称：药学院实验中心生物制药实验室课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程实验教学的目的是让学生掌握酶制剂的发酵生产方法、酶的固定化原理与操作方法、酶分子的修饰原理和实验方法等，加深学生对抽象的理论内容的理解；通过实验训练，培养学生的动手操作能力和观察能力，正确掌握实验仪器的使用方法和实验操作技能，培养学生独立解决问题的能力和严谨的科学态度。
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
《基因工程》实验教学教案一、实验背景基因工程是一种现代生物技术，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
本实验旨在让学生了解基因工程的基本原理和操作步骤，掌握PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术，并应用于实际问题的解决。
二、实验目标1. 理解基因工程的基本原理及操作步骤。
2. 掌握PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术。
3. 学会分析实验结果，并能够对实验问题进行解决。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶、DNA连接酶、感受态细胞等。
2. 仪器设备：PCR仪器、凝胶成像系统、电泳仪、离心机、DNA提取仪、显微镜等。
四、实验内容与步骤1. PCR扩增目的基因：a. 设计引物，并进行合成。
b. 配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶等。
c. 进行PCR扩增，观察扩增曲线。
d. 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. DNA连接：a. 准备连接反应体系，包括目的基因、载体、DNA连接酶等。
b. 将目的基因与载体连接，并进行转化。
c. 转化感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 转化与筛选：a. 配置转化反应体系，包括连接产物、感受态细胞等。
b. 进行转化，观察转化效率。
c. 筛选阳性克隆，并进行鉴定。
4. 实验结果分析：a. 分析PCR扩增产物，判断扩增效果。
b. 分析转化子，判断连接效果。
五、实验注意事项1. 实验操作过程中要严格遵循无菌操作原则。
2. 实验材料要进行质控，确保实验的准确性。
3. 实验过程中要记录详细的数据和观察结果，便于分析。
4. 实验结果要进行多次重复，以验证实验结果的可靠性。
六、实验拓展与思考1. 讨论基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
2. 分析基因工程所面临的伦理、法律和社会问题。
3. 探索基因工程技术在未来的发展趋势。
七、实验报告要求1. 报告内容：实验目的、实验原理、实验材料与仪器、实验步骤、实验结果及分析、实验拓展与思考等。
实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。
再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
三、实验材料与仪器1、仪器超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
2、试剂pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
EcoR I，Xba I，Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121︒C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20︒C 保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A （RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121︒C 30min）。
广东省高教厅重点实验室－现代生物技术实验室实验教材基因工程实验指导(本科生教材)华南农业大学现代生物技术实验室基因工程实验分室二零零九年四月编者的话本实验指导是为广东省高教厅重点实验室之一的“现代生物技术实验室”开设的“基因工程原理和方法”而编写的。
本课程主要面向广州石牌地区六所高校的研究生，也包括部分高年级本科生。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有修课学生预修“分子生物学”或“分子遗传学”。
本课程实验采用了一个内容连贯的实验系统(用质粒载体克隆植物DNA片段)，作为同学们掌握DNA体外重组基本技术的训练(实验一至实验七)。
另外，根据本研究室多年教学、研究工作的经验，我们还把反映近年基因工程技术发展的PCR、Southern杂交技术等纳入实验内容，以保证学生修完本课程后能较快地开展相应研究工作，更好地适应未来研究工作的需要。
本实验指导由庄楚雄、穆虹、易继财、姚涓、吴豪、张群宇、刘耀光、梅曼彤等老师参加编写，易继财老师负责指导书的编辑等工作。
本实验指导为试用第三版，试用后我们将根据各校修课的情况和要求作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
编者2005年2月目录基因工程实验室学生守则⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅3实验一碱裂解法抽提质粒DNA ⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅4实验二琼脂糖凝胶电泳⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ 7实验三DNA的酶切⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅9实验四目的片段的回收⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅11实验五DNA的体外连接⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅12实验六重组DNA的转化⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅15实验七重组转化子的快速鉴定⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅18实验八多聚酶链式反应( PCR ) ⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅19附录I. 各种试剂的母液配方⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅28附录II. 常用实验器具的清洗方法⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅31主要参考书⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅32基因工程实验室学生守则1. 实验课前必须预习实验指导，了解实验原理和基本操作过程。
2. 实验课不得无故缺席、迟到或早退。
非课表规定的实验时间，应按任课老师的安排，准时来进行操作。
3. 实验课时，应自觉遵守课堂纪律，保持实验室的安静与清洁卫生，不得大声谈笑，不得抽烟、随地乱丢纸屑、吐痰等。
4. 实验前清点好仪器、用具与试剂，实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品洒在实验台面和地面上。
5. 实验中应严格遵守操作规程进行实验，细心观察实验现象，并如实记录实验结果。
每个实验完成后，要写实验报告。
6. 实验完毕，应清洗好当天所用的器皿和用具，整理好仪器与实验台面，经任课教师同意方可离开。
7. 使用仪器、药品、试剂和各种其它物品需注意节约。
洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。
8. 废液可倒入水槽内，同时放水冲走，强酸、强碱等腐蚀性液体，应先用水稀释后，方可倒入水槽内，并放水冲走。
废纸等其它固体废物，不得倒入水槽，应倒入废物桶内。
9. 严禁随意动用非当天实验所需使用的仪器和物品，使用仪器应严格按仪器使用的程序进行，贵重仪器需在任课老师的指导下进行操作。
实验过程中如仪器出现故障，应及时向任课老师汇报情况，如违反使用规定造成的损坏，使用者将负责修理与赔偿。
10. 每次实验课由任课教师安排学生轮流值日，值日生负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作，最后关好水电、门窗，经任课教师检查同意后方可离开。
实验一碱裂解法抽提质粒DNA一、目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
二、原理质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。
本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。
其原理为: 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。
再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。
三、实验材料含质粒pBluescript II的大肠杆菌BH10B。
四、仪器设备高压灭菌锅超净工作台恒温摇床台式离心机（冷冻式或非冷冻式）旋涡振荡器五、实验用具培养用试管量筒冰盒微量离心管微量取液器吸管头若干六、试剂(配制方法见附录)LB培养基氨苄青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS溶液I；溶液II(最好现配现用)；溶液III(-20℃预冷)4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2) 无水乙醇TE缓冲液(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，注：在本实验指导的其它章节省略为“酚/氯仿”，而“氯仿”均指已加入了1/24体积的异戊醇)七、实验步骤1. 细菌的培养(1) 配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌。
(2) 在含Amp 100 μg/ml的琼脂培养基平板上(划线或涂抹)培养出单菌落(37℃，18~20小时)。
(3) 在培养管中加入含Amp 100 μg/ml的LB液体培养基(4~5 ml/管)，挑取单菌落至培养基中。
将培养管倾斜插在摇床中，37℃摇过夜(约200 rpm，14~16小时，一般不超过18小时)。
如需大量提取，挑取单菌落至接入含50 ml LB培养基的三角瓶中，37℃摇18小时。
2. 质粒DNA的抽提（如使用冷冻离心机，设为4℃预冷）吸取1.5 ml菌液至1.5 ml离心管中。
离心(5000 rpm, 2分钟)，弃上清液。
如想提取多一点DNA，再吸取1.5 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液。
用移液器尽可能除去上清液。
加入150 μl溶液I ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
加入250 μl溶液II ，缓慢地上下翻转离心管10多下，温和混匀。
室温下放置5分钟。
加入180 μl预冷的溶液III ，上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰浴10分钟，或放入－20℃冰箱5分钟（避免过长时间产生冻结）。
离心(12000 rpm，5分钟，4℃)。
（离心完后把离心机温度设为20℃）。
移取上清液。
加2/3倍体积的酚/氯仿抽提，离心(12000 rpm，5分钟)。
移取上清液（约500~550μl），加2倍体积无水乙醇（大量提取时上清液的容量大，可用0.6倍体积异丙醇代替乙醇），混匀。
离心（12000 rpm，5分钟，室温)，倒掉酒精。
离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。
用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。
离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干10分钟。
加50~100 μl TE(含20 μg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。
37℃放置数小时，-20℃保存备用。
高拷贝质粒DNA的产量一般为3~5 μg/ml菌液。
此DNA可直接用于限制性内切酶切割等反应。
如需要更高纯度的DNA，可进一步纯化。
3. 质粒DNA的进一步纯化加入TE使DNA溶液为100 μl，加入100 μl酚/氯仿，充分振荡。
离心(12000 rpm, 5分钟)，吸取上清液。
加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀。
置于-70o C冰箱约10分钟以上或-20o C冰箱30分钟至数小时。
离心（12000 rpm，15分钟，4o C)，倒掉酒精，离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。
用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。
离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干。
加50~100 l TE溶解DNA沉淀。
(如大量提取质粒DNA，溶液I，II，III的用量可相应增加，如培养液为50 ml时，溶液I，II，III的用量可分别为2.0 ml，4.0 ml，3.0 ml）。
本实验方法提取及纯化的质粒DNA的纯度只能满足一般目的的要求。
对于纯度要求很高的情况，如作为克隆载体和测序的模板，最好使用厂商提供的质粒纯化试剂盒提取。
八、实验注意事项1. 高压消毒需专人看管，压力至0.5磅时拔下电源插头放气，继续加热至1.0磅保持20分钟(通、断开关控制)。
2. 无菌操作台使用前，开紫外灯灭菌，开紫外灯时勿开鼓风装置。
3. 对抗菌素不能用高温灭菌，需待培养基灭菌后冷却到不烫手的时候再加入。
4. 为避免细菌污染环境，多余的菌液经煮沸杀灭后方可倒入洗涤槽。
5. 加入溶液II、溶液III摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动。
6. 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液时，应注意勿将下层酚/氯仿吸入以免带入杂质；但也不要留下太多上清液，使DNA损失较多。
九、实验时间安排1. 第一天下午配制液体和琼脂培养基。
（5:30）左右在琼脂培养基平板上划线接菌，培养过夜长出单菌落。
2. 第二天下午（5:30）挑取单菌落植菌培养过夜。
3. 上午9:00左右停止培养，于室温或4℃存放。
下午抽提质粒（纯化在实验二电泳期间进行）。
实验二琼脂糖凝胶电泳一、目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。
二、原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
