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高通量法筛选产果胶酶真菌及其酶学性质研究

高通量法筛选产果胶酶真菌及其酶学性质研究

高通量法筛选产果胶酶真菌及其酶学性质研究齐飞杜茜张悦文关怡*（福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）摘要：为拓展产果胶酶微生物资源，提高产酶微生物的筛选效率，开发具有创新酶学性质的果胶酶产品，本研究从橘皮中分离并鉴定6株真菌，并采用24深孔板高通量测定真菌产果胶酶的活力；并对高产酶菌株Fun1所产果胶酶的基本酶学性质进行测定。

[1]结果显示，6株真菌具有产酶活力，其中Fun1产酶活力最高，达到330U·L－1。

经鉴定，Fun1菌株为黑曲霉（A.niger），其余5株分别与毛栓菌（T.hirsuta）、裂褶菌（mune）、长毛囊孔菌（T.byssogenum）、隔孢伏革属（Peniophora sp.）及漏斗多孔菌（P.arcularius）具有最高序列一致性。

Fun1菌株所产果胶酶的最适pH及温度分别为pH4.0和60℃，且在pH2.2～7.0范围内具有较好pH稳定性，在40～80℃具有较好热稳定性。

本研究证明Fun1菌株所产果胶酶具备较好的应用潜能，具有进一步开发利用的价值。

关键词：果胶酶；真菌；黑曲霉；酶学性质中图分类号：ST2文献标识码：A文章编号：2095-5774（2019）03-0011-008 Screening of Pectinase-producing Fungi by High Throughput Method and Its Enzymatic PropertiesQI Fei DU Xi ZHANG Yue-wen GUAN Yi*（Fruit Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou350013,Fujian China）Abstract:In order to expand the pectinase-pro ducing microbial resources,improve the efficiency for screening enzyme-producing microbe and develop the pectinase products with innovative enzymatic properties,six fungus strains named Fun1-6were isolated and identified from orange peel.Pectinase activity was determined by high throughput method with24-microwell plate.Furthermore,the enzymatic properties of strain Fun1producing a great quantity of pectinase were assayed.The results showed that the six fungi strains could produce pectinase.Among the six strains,Fun1produced pectinase with the highest activity of330U·L-1.After sequences analysis and morphological observation,Fun1was identified as Aspergillus niger.The other5strains had highest sequence identity with Trametes hirsute,Schizophyllum commune,Trichaptum byssogenum,Peniophora sp.or Polyporus arcularius,respectively.The optimum pH and temperature for pectinase produced by Fun1was pH4.0and60℃,respectively.Pectinase produced by Fun1had good pH stability when pH was2.2to7and had good thermo stability when temperature was40℃to80℃.This study revealed that pectinase produced by Fun1strain has good potential for further development and application.Key words：Pectinase;Fungi;Aspergillus nige;Enzymatic properties天然果胶类物质以原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，与纤维素、半纤维素共同构成细胞壁[1]。

酶的高通量筛选

酶的高通量筛选
显色或荧光底物的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
随机插入/去除技术 半理性外显子重组技术 合成重组技术 计算机辅助设计技术
酶分子的定向进化（小结）
定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和 研究酶蛋白构效关系的良好工具。 随着各种基因技术的应用和发展，究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突 变体库的技术。 突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续 发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术， 还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技 术和蛋白展示库技术。尤其是一些无明显表型的突变体的 筛选还需给与更多的研究与重视 。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的置换而F, Tiss A, Rivière C, Verger R: Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Technol 2000, 133-153. A comprehensive and detailed review about all lipase assays involving carboxylic ester hydrolysis 11Beisson F, Ferté N, Nari J, Noat G, Arondel V, Verger R: Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J Lipids Res 1999, 40:2313-2321. 12Klein G, Reymond J-L: Enantioselective fluorogenic assay of acetate hydrolysis for detecting lipase catalytic antibodies. Helv Chim Acta 1999, 82:400-407. 13Pérez Carlón R, Jourdain N, Reymond J-L: Fluorogenic polypropionate fragments for detecting stereoselective aldolases. Chem Eur J 2000, 6:41544162. 14List B, Barbas CF III, Lerner RA: Aldol sensors for the rapid generation of tunable fluorescence by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:15351-15355. 15Copeland GT, Miller SJ: A chemosensor-based approach to catalyst discovery in solution and on solid support. J Am Chem Soc 1999, 121:43064307. 16. Morís-Varas F, Shah A, Aikens J, Nadkarni NP, Rozzell JD, Demirjian DC: Visualization of enzyme-catalyzed reactions using pH indicators: rapid screening of hydrolase libraries and estimation of the enantioselectivity. Bioorg Med Chem 1999,7:2183-2188. 17. Janes LE, Löwendahl AC, Kazlauskas RJ: Quantitative screening of hydrolase libraries using pH indicators: identifying active and enantioselective hydrolases. Chem Eur J 1998, 4:2325-2331. 18 Bornscheuer UT: Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases. Curr Opin Biotechnol 2002,13:543-547. 19Jenne A, Gmelin W, Raffler N, Famulok M: Real-time characterization of ribozymes by fluorescence resonance energy transfer (FRET). Angew Chem Int Ed Engl 1999, 38:1300-1303. 20Jandeleit B, Schaefer DJ, Powers TS, Turner HW, Weinberg WH (1999) Combinatorial materials science and catalysis. Angew Chem Int Ed 38:2494–2532 21Reetz MT, Becker MH, Liebl M, Fürstner A (2000a) IR-thermographic screening of thermoneutral or endothermic transformations: the ring-closing olefin metathesis reaction. Angew Chem Int Ed 39:1236–1239 22Holzwarth A, Schmidt H-W, Maier WF (1998) Detection of catalytic activity in combinatorial libraries of heterogeneous catalysts by IR thermography. Angew Chem Int Ed 37:2644–2647 23Hirose A, Esaka Y, Ohta M, Haraguchi H: On-line HPLC determination of enzymatic activity of alkaline phosphatase in natural water using spectrofluorometric detection. Chem Lett 1993:307-310.

酶的高通量筛选

酶的高通量筛选

红外检测技术是一种新颖的 有发展前途的高通量筛选技术， 它不需要生色基团或荧光基团 的加入，避免了比色和荧光检 测方法的局限性，但是这种技 术目前还无法进行定量，只能 检测催化活性较高的酶，对酶 活的进一步研究还需借助传统 方法，方法本身还需要进一步 的发展和完善。
借助复杂的仪器设备的高通量筛选
高效液相色谱, 质谱和毛细管电泳也被用来 检测反应速度，但是作为一种高通量筛选 技术，这些方法测试成本较高，而且每天 每台仪器最高只能检测几百个样品，方法 的使用受到一定的限制。 采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛 选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏 而且准确，但由于放射性其使用会受到限 制无法推广使用。
酶的高通量筛选与定向进化
高通量筛选技术 目的基因 基因突变技选技术 有益正向突变 高效生物催化剂
生物催化剂 定向进化
展望
高效的筛选技术使我们可以筛选到更多的新酶， 定向进化技术使酶的性质得到了极大的改善使酶 更加适合工业应用，这些技术的发展和完善使生 物催化的应用成为可能，并继续推动着生物催化 向各个领域不断渗透。 人们对经济的生产方式的追求，对能源与环境的 重视，尤其是对医药和精细化工产品日益增长的 巨大需求，进一步推动了生物催化在各个领域的 广泛应用和飞速发展。
Quick E 示意图
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
荧光共振能量转移底物的高通量筛选
荧光共振能量传递底物，不仅有非常好 的静态定位能力，也能提供分子内或分子 间两个荧光基团在距离和方向上的动态变 化。 将这种方法扩展，可用于研究生物多聚 体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切 反应，以及DNA发夹结构的去折叠等。这 种技术最近被用来检测核糖核酸酶反应活 性。
显色或荧光底物的高通量筛选

高通量药物筛选技术

高通量药物筛选技术

高通量药物筛选技术是20 世纪80 年代后期形成的寻找新药的高新技术。

经过十余年的实践,该技术体系不断发展和完善,成为目前寻找新药的重要手段。

高通量药物筛选采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型,根据样品与靶点结合的表现,判断化合物的生物活性。

由于这些筛选方法是在微量条件下进行,同时采用自动化操作系统,可以实现大规模的筛选,因而称为高通量药物筛选。

同一化合物不同模型筛选的活性数据以及由同一模型不同化合物的活性数据归纳出的结构活性关系可以为药物的发现提供极有价值的信息。

在高通量药物筛选中,通过活性数据处理过程确定化合物的药物活性,并为基于信息的药物发现过程准备准确、丰富的资料。

1 高通量药物筛选的基本条件1.1 化合物样品库高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选，因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leading compounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。

化合物样品的数量是指不同样品的数量，化合物样品的质量主要由化合物结构的多样性决定。

许多活性反应基团(ractive groups)使初筛的假阳性大量增加,剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。

化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。

人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。

1.2 高通量药物筛选的自动操作系统自动化操作系统就是实验室自动化站, 其基本功能就是自动连续地完成实验的基本操作, 即①加样；②稀释；③转移；④混合, 其方式包括震荡, 也可以用加样器反复吹洗混合；⑤洗板, 就是用适当的溶剂清洗微板；⑥温孵；⑦检测, 反应体系与一种或多种检测仪器相连, 在反应完成后进行自动检测并自动采集储存数据, 完成整个实验过程。

1.3 高通量药物筛选的数据库管理系统高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。

高通量药物筛选

高通量药物筛选

放射性分析技术，主要应用于检测RNA
转录，测定P56激酶活性，对氨基乙酰化 tRNAd进行测定以及肝炎C病毒NS3蛋白 酶抑制剂的药物筛选等方面。
比色技术，用于检测具有吸收性质的物
质浓度，根据光线经过被检物质后被吸收 的多少，来评价吸收物质的含量。是目前 应用最广泛的一向检测法。
发光检测技术，有些生物和化学物质可以在
高通量药物筛选的出现，使药物筛选逐步实现 规模化、自动化和集成化，具有筛选速度快，所 需样品用量少的特点。
传统药物筛选
高通量药物筛选
人类疾病相关动物模型
药物作用分子靶点
↓
药物筛选发现有效药物
↓
药物筛选
↓
活性化合物
↓
活性化合物
↓
药效学研究
↓
作用机制研究
↓
组织器官水平研究
↓
组织、器官水平研究
↓
作用机制研究
↓
带筛样品的准备
↓
筛选的实施
↓
数据分析
药物发现的基本过程
初筛和复筛（分子、细胞水平） 深入筛选（综合分析获得先导化合物） 确证筛选（确定开发前景并进行临床研究）
高通量药物筛选的前景
• 高通量药物筛选只经过十余年的实践检验， 在药理发现理论研究、技术方法的研究及 筛选结果评价的研究方面，任需要完善。 而如何提高高通量药物筛选的效率和准确 性，是目前亟需解决的重要问题。
➢ 荧光强度分析法
原理：许多分子带有天然荧光基团，当待测 大分子本身的荧光团不够强烈而无法检测 时，可结合一些荧光染料以加强其光谱特 征，然后根据其荧光强度的变化进行检测。
➢时间分辨荧光分析
原理：利用激发波长、发射波长和荧光寿 命的变化，对物质进行检测。 该方法具有灵敏度高、无放射性危害、标 记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操 作简便等优点，受到广大药物筛选工作者 的关注。

建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法_孙艳

建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法_孙艳

CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2011年第30卷第3期·612·化工进展建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法孙艳，杨海麟，王武（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122）摘 要：建立了一种以滤膜为基础的高通量筛选耐高温胆固醇氧化酶产生菌的方法。

利用酶偶联及胆固醇不溶于水的特性产生显色透明圈。

酶的热处理过程和酶与底物的反应过程分开，有效地防止酶在热处理前与底物反应。

高温处理是在滤膜上进行，从而克服了高温琼脂平板变软或熔化的缺点。

用该方法筛选时，产生的红褐色透明圈较明显，易于挑出性能改善的突变菌株。

转印所用NC膜的价格便宜，操作比较简便。

关键词：胆固醇氧化酶；高通量筛选；定向进化中图分类号：Q 185 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2011）03–0612–04High-throughput screening methods for selecting cholesterol oxidase with improvedthermal stabilitySUN Yan，YANG Hailin，WANG Wu（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）Abstract：A high-throughput screening method based on membrane for selecting cholesterol oxidase mutants with improved thermal activity was proposed. This method takes advantage of the fact that the process of enzyme treatment and the reaction between enzyme and substrate was separated effectively，thus preventing the enzyme from reaction with substrate before heat treatment. High temperature treatment only involved the membrane not the agar plate，thereby the problem of softening or melting of the agar plate was resolved. This method is applicable to the screening of mutant colonies with high activity which produce obvious reddish brown transparent circle on the agar plate. The nitrocellulose filter membrane used for transfer printing is cheap and the major advantages of this method are reliability and simple，rapid screening.Key words：cholesterol oxidase；high-throughput screening；directed-evolution胆固醇氧化酶（COD，EC1.1.3.6）是一类黄素蛋白酶，能特异性催化氧化异构化含3β羟基的类固醇，使其类固醇环上的Δ5-6双键转移到Δ4-5位置[1]。

第十章 新酶的发现与筛选


3
微生物作为酶源的优点
（ 2 ）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 （ 3 ）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
2018/8/5
第10章 新酶的发现与筛选
4
二、 微生物新酶的获取途径
购买商品化的酶
购买产酶微生物
获取途径 从自然界筛选产酶微生物
第10章 新酶的发现与筛选
41
示例1 基因组序列搜索
查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase
2018/8/5
第10章 新酶的发现与筛选
42
2、 基因挖掘法
基因组狩猎原理
以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比 对，获得中等相似度（ 50%~70% ）的酶进行克 隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。
2018/8/5
第10章 新酶的发现与筛选
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示例2 数据库比对寻找相似酶序列
酶探针的氨基酸序列
NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus]
GenBank: BAP73216.1
1 61 121 181 241 301 MTNQKFFTLS AETYKTYPEL IHSPFFDKDL FSPFLQNQTP QVLLLWVYKR YTKYNSEAQK NGNKIPAVAV GAALKETKKP NIDLETAWKQ GIVEFSQKND GILPVTTSAK VGTGTKWYKA REEIFITDKF LEELYKSGKA ILLEAYSPLG IERIKQAQDI EETDATFSQE SSLHKISEDP KNIGVSNFTV PLQKKPADAD FSFDLTEEEV LTDIVKLSLD KSALETALKK EDLKKVLAIA QQPFYQYLKE KKITDLGLQH TVPGIVHIDA LGVDYVDLYL EIKPQVNQIE LSEKYNKTEA EPVRLYWVDF

高通量筛选技术

高通量筛选技术高通量筛选(high—throughout screening)是近年来迅速发展起来的药物筛选技术。

高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药物活性评价方法（模型），通过自动化手段，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，发现新药的过程。

高通量药物筛选的规模至少为每日筛选数千个样品。

同时它通过运用基因科学、蛋白质科学、分子药理学、细胞药理学、微电子技术等多学科理论和技术，以及与疾病相关的酶和受体为作用靶点。

对天然或合成化合物进行活性测试，并在此基础上进行筛选。

高通量筛选具有快速、高效、经济、高特异性等优点，其中所用的样品量甚少的特点尤其适用于天然化合物的活性筛选。

高通量筛选可以根据待测样品的种类分为非细胞相筛选、细胞相筛选、生物表型筛选。

其中非细胞相筛选常用的方法有Microbead—FCM 联合筛选、放射免疫性检测、荧光检测(FA)、闪烁接近检测、酶连接的免疫吸附检测(ELISA)等；细胞相筛选常用的方法有选择性杀死策略、离子通道检测、报告基因检测等；生物表型筛选可以有目的敲除或屏蔽掉某些未知功能的基因等等。

高通量筛选在抗病毒药物筛选中有很大的应用，介绍一些抗病毒药物筛选方法：利用亲合闪烁分析对HIV逆转录酶活性测定、HCV NS5B 活性测定、HCV NS3(nonstructural protein 3，NS3)解旋酶活性的测定；利用荧光共振能量转移对SARS—CoV病毒3CL 蛋白酶活性测定；抗病毒药物的其它高通量筛选模型如病毒与宿丰细胞结合的细胞模型、HCV NS3／4A蛋白酶活性测定、HIV整合酶(integrase，IN)活性的测定等等。

高通量筛选体内药动学模型中传统的药动学研究以测定药物在体内的浓度及分布为主要手段。

高通量筛选体外药动学模型中常用的筛选模型建立在组织、器官水平和细胞及亚细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接体现药物的基本作用机制。

高通量筛选的体内和体外筛选模型是互为补充、相辅相成的。

酶的高通量筛选与定向筛选


无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个
别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
基于比色
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反
应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体


生物催化研究过程
酶的筛选

酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基筛选法 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生 长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。
– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势 而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑 制，从而得到所需的目的菌株。 – 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌 株。
得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛 选的主要研究和发展方向。 随着生物催化在精细化工和医药行业的广 泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手 性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产 品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器 设备的高成本的检测方法成为可能并将逐 渐得到更多的应用。

第十章 新酶的发现与筛选课件


淀粉→淀粉酶 酪素→蛋白酶 纤维素粉→纤维素酶
2020/3/20
几丁质→几丁质酶 吐温→脂肪酶 α-葡聚糖酶→1,3- α-葡聚糖
26
2、薄层层析法（TLC）
薄层层析
混合样品由于样本被点在薄片后，展开剂会因 为毛细现象而向上移动。不同的分析物因为极性 差异会以不同的速度向TLC片上端爬升，因而达 到分离目的。
2020/3/20
19
富集培养方法
（3）抑制不需要的菌类
通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非
目的微生物的数量
高温处理（80℃）筛选芽孢菌 抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、
孟加拉红等
抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等 抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等
（1）种类繁多、分布广
微生物“无孔不入，随遇而安” 微生物具有多样性
① 物种多样性：据估计总类别在50万至600万之间 ② 生理代谢类型多样性：有机物和有毒物质分解、转化 ③ 遗传基因多样性：已完成测序细菌1214种、古细菌93种、
真菌17种（2010年数据）
2020/3/20
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微生物作为酶源的优点
四、 从自然界筛选产酶微生物
1、样品采集
方法：根据所要实现的化学反应确定需要的酶 及产酶微生物的类型，选择采样环境
土样采集方法：除去表层土，取离地面5~15 cm处的土样，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中， 扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等信 息。
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四、 从自然界筛选产酶微生物
2、富集培养
目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株 原理：根据微生物的特点，“投其所好”或
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