高效液相色谱仪原理及应用实验指导书
贵州大学精细化工研究开发中心（绿色农药与生物工程重点实验室）
1. 实验类型：设计型实验（研究性实验）
2. 课时安排：6课时
3. 实验目的和意义：
通过学习高效液相色谱仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。
4. 实验原理
高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次（103-106）的分配（吸附－脱附－放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。
5. 实验设备
高效液相色谱仪、色谱柱、容量瓶、分析实验室常用玻璃仪器、甲醇等色谱纯试剂，超纯水，滤膜。农药标准品。
6. 实验内容：
了解并初步掌握高效液相色谱仪的基本原理与构造；了解高效液相色谱仪常用的几种检测器工作原理和使用范围；学习高效液相色谱法分离化合物和检测化合物的含量的方法；通过测定对样品的定性、定量测定，初步掌握获得高效液相色谱谱图和数据的一般操作程序与技术；学习样品制备的方法；了解影响分析测定的重要因素，学会优化分析条件；学习谱图和数据的处理方法。
1) 样品制备
样品制备过程中，要同时考虑将被分析的样品中，可能干扰欲测组分定量的物质尽可能的分离出去。当欲测组分含量很低时，还要考虑通过样品制备使欲测组分在试验样品中的含量得以提高，便于进行色谱分析。 2) 定性、定量方法
四、高效液相色谱仪的结构
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成（图3-1-2）。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
图
3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图
1.高压输液系统
高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。
(1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
(2) 高压输液泵。高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
图3-1-3 恒流柱塞泵
(3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
HP1100高效液相色谱使用说明书
注意事项:
1使用前，应申明样品名称和特性以及使用的流动相。
2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。
3溶剂必须经微孔滤膜过滤，所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。
4不得在计算机上进行与实验无关的操作。
5注意适时更换废液收集瓶，防止废液溢出。
6认真登记实验记录。
7相关论文发表后，应送一份复印件给中级仪器实验室。
北京大学化学学院中级仪器实验室
HPLC操作手册
1
一、概述
HPLC1100系统构成如下：
1 流动相A B C D 2 真空脱气装置 3、6、9、11 电缆
4 输液泵 5 自动进样器（无） 7 柱温箱 8 检测器（DAD）
10 数据接收处理控制系统（计算机） 12 打印机 13 手动进样器
1． 指示灯状态
每个部件接通电源后，LED灯显示绿色；
黄色 Not Ready
绿色 Run
红色 Error
2． 四元泵系统的工作原理图
HPLC操作手册
2 3． 柱温箱的特征
可以在低于室温10℃至80℃间恒温
空间大，可以容纳三根30cm长的柱子
安装柱识别可以记录进样次数
两个单独的加热区
可以程序升温
4． 检测器
HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示：
光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后，照射到流通池上，透射光经全息凹面衍射光栅色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件，它有三个动作位置：（1）光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；（2）将氧化钬滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；（3）打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。
高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程
高效液相色谱仪操作步骤（原文摘录自网络）：
1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)． 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7)． 设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)． 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10)． 填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
