(完整版)脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用(精)

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3?mM。

去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

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包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。

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冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。

如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。

２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。

ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。

洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。

这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。

也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。

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去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。

对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

尿素及盐酸胍对蛋白的变性作用机制
简单地说，尿素和盐酸胍在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键,从而使蛋白质发生不同程度的变性.同时,还可通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度,降低疏水相互作用.
在室温下4～6mol/L尿素和3～4mol/L盐酸胍,可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点,通常增加变性剂浓度可提高变性程度,通常8mol/L尿素和约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态.盐酸胍由于具有离子特性,因而比尿素的变性能力强.一些球状蛋白质,甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性,然而在8mol/L盐酸胍溶液中,它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在.
尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制:
第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合,形成变性蛋白质-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N→D反应平衡向右移动.随着变性剂浓度的增加,天然状态的蛋白质不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性.然而,由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的.因此,只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变性;第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用.因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力,当它们在高浓度时,可以破坏水的氢键结构,结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加. 尿素和盐酸胍引起的变性通常是可逆的,但是,在某些情况下,由于一部分尿素可以转变为氰酸盐和氨,而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应改变了蛋白质的电荷分布.因此,尿素引起的蛋白质变性有时很难完全复性. 还原剂(半胱氨酸,抗坏血酸,β-巯基乙醇,二硫苏糖醇)可以还原二硫交联键,因而能改变蛋白质的构象.。

目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。

基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为。

EDTA为mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

核酸提取常见试剂的作用原理异硫氰酸胍强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。

胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。

含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。

在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。

盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。

4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。

高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性巯基试剂1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。

DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。

DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。

巯基乙醇β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。

1 还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。

盐酸胍让蛋白变性的原理盐酸胍是一种常用的蛋白变性剂，它能够使蛋白质失去其原有的结构和功能。

盐酸胍的原理主要通过以下几个方面来解释。

首先，盐酸胍是一种带正电荷的分子，它可以与蛋白质上的负电荷基团（如羧基、磷酸基团等）发生电荷吸引作用，从而引发蛋白质的离解反应。

蛋白质本身是由氨基酸残基组成的，在水溶液中，氨基酸残基会解离成带正（NH3+）和负（COO-）电荷的离子。

当盐酸胍与蛋白质发生作用时，它的正电荷会与蛋白质的负电荷相互吸引，导致蛋白质的离解。

这种离解作用会破坏蛋白质的空间结构，使其失去原有的构象。

其次，盐酸胍还具有脱水作用。

蛋白质的三维结构是由氨基酸残基之间的各种化学键和非共价相互作用力维持的。

其中，氢键、离子键、范德华力等都在维持蛋白质的结构和稳定性方面发挥重要作用。

而盐酸胍可以与水分子发生氢键和离子键的相互作用，从而增加水分子和蛋白质之间的相互作用力。

这种相互作用力的增加会使水分子与蛋白质之间的吸引力增大，导致蛋白质结构的破坏和蛋白质分子之间的非共价相互作用力的破坏。

另外，盐酸胍还可以改变溶剂的物理化学性质，从而影响蛋白质的结构和稳定性。

盐酸胍是一种强酸性物质，加入溶液中会使溶液的酸碱性增大，从而改变了溶剂中的离子浓度和溶剂极性。

这种酸碱性的变化会引起蛋白质的溶解度的改变，导致蛋白质的沉淀、聚集和凝集。

同时，酸碱性的变化还可影响电荷分布，进一步改变蛋白质分子的空间构象。

此外，盐酸胍还可以与蛋白质分子中的氨基酸残基发生化学反应，导致氨基酸残基的改变。

例如，盐酸胍可以与蛋白质中的氨基酸残基中的羧基发生酯化反应，从而改变蛋白质中的酯键结构。

这种酯化反应会破坏蛋白质的二级和三级结构，从而使蛋白质失去原有的构象和功能。

综上所述，盐酸胍可以通过与蛋白质上的负电荷基团发生电荷吸引作用、通过与水分子发生氢键和离子键的相互作用、通过改变溶剂的物理化学性质以及通过与蛋白质内部的氨基酸残基发生化学反应等多种方式来使蛋白质变性。

脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用脲和盐酸胍变性剂如脲和盐酸胍等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，这增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度，减少了疏水相互作用；脲还可以深入到蛋白质分子的内部影响蛋白质分子的密堆积。

此外，去污剂、有机溶剂、重金属、热、机械力、冷冻、超声、高压、辐射等均可引起蛋白质的变性。

这些变性均不会破坏蛋白质的共价键而是只涉及到氢键、盐键、疏水相互作用、范得华相互作用等次级键的破坏。

有些变性的蛋白质当变性因素被除去后又可自动地恢复到天然状态，这种现象称为蛋白质的复性(renaturation)，这种复性即蛋白质折叠研究中的重折叠(refolding)。

（1931年吴宪提出的蛋白质变性学说）包涵体蛋白质提纯大多数在pH8的条件下，一般用强的变性剂如尿素（6-8mol/L）、盐酸胍（GdnHCl 5~8mol/L 或6mol/L），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。

或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。

用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。

另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。

还有有机溶剂、碱性环境（大于9）或酸（70%甲酸）也可使之溶解。

在变性液中需加入还原剂，如2－巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽（GST）、半胱氨酸。

还原剂的使用浓度一般是50-100mM β-ME或DTT，也有文献使用5mM浓度。

还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。

目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。

基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包含体蛋白质的纯化方案1、破碎：1、1、破碎缓冲液组成： 50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 µg/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 µg/g cell)细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。

1、2、超声波破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。

因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。

占空比50％，超声15s，停15s，10－20min。

破碎后的匀浆在4℃，15,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

2、洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。

此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

离心后的沉淀物质用上述缓冲液进行悬浮，搅拌洗涤20－30min，在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

重复一次。

再用50mM Tris pH7.0-8.5左右洗涤，以去除Buffer中的EDTA。

20－30min，在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液3、溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。

蛋白包涵体-溶解原理及方法2009年03月15日星期日00:20 维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。

先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。

二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。

最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。

1. 遵循标准包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。

溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：(1) 快速溶解的动力学；(2) 与蛋白质的结合是可逆的；(3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；(4) 对温度没有依赖作用；(5) 抑制蛋白质酶的降解作用；(6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；(7) 在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。

2. 溶解包涵体的试剂最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。

最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。

除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。

一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。

为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。

（1）去垢剂去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。

脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用脲和盐酸胍变性剂如脲和盐酸胍等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，这增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度,减少了疏水相互作用；脲还可以深入到蛋白质分子的内部影响蛋白质分子的密堆积.此外,去污剂、有机溶剂、重金属、热、机械力、冷冻、超声、高压、辐射等均可引起蛋白质的变性。

这些变性均不会破坏蛋白质的共价键而是只涉及到氢键、盐键、疏水相互作用、范得华相互作用等次级键的破坏。

有些变性的蛋白质当变性因素被除去后又可自动地恢复到天然状态,这种现象称为蛋白质的复性（renaturation)，这种复性即蛋白质折叠研究中的重折叠（refolding)。

（1931年吴宪提出的蛋白质变性学说）包涵体蛋白质提纯大多数在pH8的条件下，一般用强的变性剂如尿素（6—8mol/L）、盐酸胍（GdnHCl 5~8mol/L或6mol/L)，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲,盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时.或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。

用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。

另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键.还有有机溶剂、碱性环境（大于9）或酸（70%甲酸)也可使之溶解.在变性液中需加入还原剂,如2－巯基乙醇(β-ME）、二硫苏糖醇(DTT）、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽（GST）、半胱氨酸。

还原剂的使用浓度一般是50-100mM β-ME或DTT，也有文献使用5mM浓度。

还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶.对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。