多糖结构解析ppt课件

多糖结构研究方法多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要的作用。

多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最基本的4类生命物质。

由于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切，因此清楚认识多糖的结构是进行多糖研究和利用的基础。

多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，可以说是自然界中最复杂的生物大分子。

从化学观点来看，多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复杂性。

糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法，即多糖的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。

与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要十分丰富。

测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；(4)各单糖残基的D-或L．构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间的连接顺序；(6)每个糖苷键所取的a-或B．异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链和非糖部分连接情况；(9)主链和支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。

多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四。

多糖结构的分析手段很多。

不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。

1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。

近年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱(FAB—MS)，电喷雾质谱(ESI—MS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展。

多糖结构解析的方法一类是传统的化学方法，一类是波谱学方法。

2.1化学方法化学方法是用来对一些简单的单糖、二糖和寡糖进行分析的经典方法，同时亦可应用在多糖的结构解析上。

它是通过完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和气质联用对多糖进行解析的。

2.1.1水解法水解法通过完全水解将多糖链分解成单糖，这是分析多糖链组成成分的主要手段。

水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。

水解后的多糖经过中和、过滤可采用气相色谱、纸层析、薄层层析、高效液相色谱仪[8]和离子色谱法[9]进行分析。

2.1.2高碘酸氧化法高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量进行，每裂开一个C—C键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分枝数[10]。

2.1.3Smith降解Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。

由于糖残基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物。

根据降解产物可以推断糖苷键的位置。

在降解产物中若有赤藓糖生成，则提示多糖具有1→4结合的糖苷键；若有甘油生成，则提示有1→6、1→2结合的糖苷键或有还原末端葡萄糖残基；若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,则有1→3糖苷键结合的存在[11]。

2.1.4甲基化反应甲基化反应是用甲基化试剂将各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而将甲基化多糖水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接的位置。

甲基化反应的关键在于甲基化是否完全，通常采用红外光谱法检测3500㎝-1处有无吸收峰,以此来判断甲基化多糖中是否含有游离的羟基(-OH)。

甲基化的方法有Purdie法、Hamorth法、Menzie法和Hakomori法等[12]。

现在使用较多的是Ciucanu和Kerek[13]方法,它是将多糖样品溶解在DMSO中,加入NaOH粉末和碘甲烷，混合在密封瓶中25℃搅拌6min即可,方法简单,重复性好。

一：多糖中的单糖组分分析一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.5~3M硫酸或1~6M盐酸，80℃~100℃水解2.5~8h 即可。

或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100℃水解15min，30min，45min 等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。

二：相邻单糖基连接方式分析将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。

高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。

结合¹³C-NMR确定连接位置。

三：端基碳苷键构型分析1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无α-苷键，与纤维素酶有作用者，存在β-苷键。

2；IR：α-型差向异构体的C-H键在844±8cm‾¹处有一个吸收峰；β-型的C-H键在891±7cm‾处有一个吸收峰。

但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的α-型和β-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。

3：¹H-NMR：端基碳的δ值大于5.00ppm者，糖苷键为α-型，小于5.00ppm者，则为β-型。

4；¹³C-NMR：α-型连接的C₁化学位移在97-101ppm，β-型的在103~105ppm。

对甘露聚糖不能用化学位移判断α-型或β-型。

可用裂分常数决定，一般¹Jｃ-ｈ=170HZ，为α-型，160HZ 者为β-型。

多糖的提取、分离纯化真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。

真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。

真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。

真菌多糖其研究日益受到人们重视。

1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测1.1 真菌多糖的提取和分离提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。

1.1.1 粗多糖中蛋白的去除常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。

三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。

三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。

另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。

1.1.2脱色多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。

游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-Sepharose TM Fast Flow来吸附色素。

若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。