WB FOR you
- 格式：doc
- 大小：211.50 KB
- 文档页数：6
WB（Western Blot）原理及相关试剂
一、WB的基本原理和用途
原理：
通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测, Western blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1～5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白.
应用：
Western blot主要用于未知蛋白质的检测及抗原组分、抗原决定簇的分子生物学检测；同时也可用于未知抗体的检测和单克隆抗体的鉴定等。
二、实验操作步骤
第一步：标本的制备
绝大多数蛋白抗原的初次预实验检测可直接在SDS上样缓冲液中裂解组织和细胞。
检测成功后，可以采用其它方法制备制备亚细胞蛋白组分（蛋白的提取可以是总蛋白、核蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白、细胞器蛋白等）。
一般客户自己配制细胞裂解液（如RIPA裂解液，裂解液中需要加入蛋白酶抑制剂cocktail）来进行蛋白的提取。
Biovision蛋白提取系列，蛋白酶抑制剂cocktail
相关产品信息
供应商目录号产品描述规格价格
以下试剂盒采用物理学的方法和独特的试剂，快速的将细胞浆蛋白和细胞颗粒分开，避免了传统分离方法所致的两组分间尤其是小分子间物质，从而可以准确地进行目的分子亚细胞定位研究。
石蜡包埋组织蛋白抽取：以下试剂盒使用专利的liquid tissue技术和试剂，专为福尔马林固定，石蜡包埋组织（FFPE）中提取蛋白而设计。
使得该类标本的检测不再局限于IHC 的方法，提取得蛋白可直接用于膜检测分析或芯片检测，尤其适用于蛋白质组分析。
生物素标记的蛋白MARKER
提供由10种生物素化的重组蛋白混合而成的蛋白MARKER及HRP标记的抗生物素的抗
第二步：SDS-PAGE电泳：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用. 而蛋白质结合固定比例的SDS 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density), 所以不同蛋白的泳动速率主要取决于亚基分子量的大小。
需要SDS、PAGE胶、蛋白质Marker（MBI蛋白质Marker（SM0671/SM0661/SM0441/SM0431））、2×上样缓冲液（MBI）、DTT等
相关产品
供应商目录号产品描述规格价格
主要竞争对手：Invitrogen有比较齐全的蛋白质Marker，质量不错，但是价格比较贵。
相对来讲MBI的蛋白质Marker具有更好的性价比。
第三步：转膜：
PVDF 膜或NC 膜：价格较便宜，简单快速封闭非特异性抗体结合
尼龙膜：价格昂贵，封闭非特异性抗体结合麻烦，在下列特殊要求下可选择: 1. 需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm 2; NC 膜：80µ
g/cm 2）。
2. 目的蛋白与NC 膜的结合能力弱。
3. 需要更大的机械强度。
尼龙膜
供应商 目录号 产品描述
规格
价格
Roche
11417240001 NYLON MEMBRAN,POSITIV
GELADEN
30cmX3m
]杂交液，封闭剂，洗膜溶液
供应商 目录号 产品描述
规格 价格
Roche 11796895001 DIG Easy hyb Granules 6*100ml （30次）
KPL
71-83-00 Detector Block 阻断溶液 2x120ml
KPL 50-63-00 浓缩洗涤液（20倍）4X200ML
Roche
11585762001 DIG WASH
A.DETECT.BUFFER SET P C
第四步：杂交：
封闭：用来封闭杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点。
用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。
封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
在选择封闭剂时，要注意一些特殊情况。
例如：
1.脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白
和生物素。
2.如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白会受到影响，因为磷酸酶
与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。
一抗的选择：
1.根据抗原选择相应的一抗，单抗和多抗都可以。
多抗具有便宜、生产周期短、与抗原有
很高亲和作用等优点。
单抗具有特异性好、纯度高、效价高等优点。
，
2.一种抗体可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象），由于WB
实验中抗原经变性处理，因此只有识别变性构象的抗体可以选择。
3.选择一抗时应先了解产品的应用范围，如果未写明可用于WB，最好不要选择。
二抗的选择：要根据一抗的来源选择合适的二抗。
通常不同种属来源的二抗不影响实验，但是若使用的二抗产生高背景，则推荐换另一种属来源的二抗。
一抗（根据情况选择Neomarkers，abcam、upstate、CST、CMK，R&D，Biosource等，一定是说明书上注明可以用于WB实验的才可以选择）、二抗（KPL、SBA，一定要与一抗相匹配，可以是HRP或者AP标记）、封闭液（；一般为PBS/TBS含有BSA或non-fat milk 等）、稀释液（用来稀释一抗和二抗；一般为PBS/TBS＋BSA/non-fat milk，也可直接用封闭液稀释）、杂交袋（一般客户自己制备，KPL有销售60-00-51）等。
KPL提供完整的试剂盒以及各个组份。
其他通用组分
正规的WB实验需要内参，一般为管家基因蛋白表达量比较恒定（如beta actin，GAPDH），可用来检测WB系统的好坏，同时可以作为检测蛋白半量的依据。
目前很多客户选择国产的产品。
abcam有很齐全内参抗体。
相关产品
第五步：检测：
增强化学发光检测（ECL）：ECL的检测灵敏度高出普通显色方法几十甚至上百倍，是目前最灵敏的WB检测方法。
印迹膜可以用X光片曝光,也可以直接用与化学发光兼容的成像系统扫描，并且膜还可进行重复检测。
普通化学显色：
1.辣根过氧化物酶（HRP）生色底物：DAB，4-CN，CN/DAB，AEC，TMB
主要竞争对手：
Pierce：知名度比较高。
商标为West Pico/West Dura/West Femto系列。
价格中等，有多种包装。
Amershia：是WB化学发光检测的标准，产品商标为ECL/ECL Plus/ECL Advance系列。
价格最高，包装也比较大。
目前国内销售渠道不是很明朗，好多客户不清楚。
国产产品：有部分没钱的客户会选择。
价格比较便宜，但是灵敏度会受到一定的限制。
如康诚、天根、华美等
蛋白酶抑制剂：抑制标本制备过程中蛋白酶的活性，最大程度保证待测蛋白的完整性（Merck 产品现货供应！）
洗脱和再杂交试剂：拥有ReBlot系统，同一张膜上反复多次检测不再是难题。
